高晴,劉贊
(1.東北國(guó)際醫(yī)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110623;2遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心,遼寧 沈陽(yáng)110000)
肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤,我國(guó)肺癌的發(fā)病率及死亡率居所有惡性腫瘤首位[1]。肺癌患者早期癥狀不明顯,導(dǎo)致患者不能及早診斷和治療。原發(fā)性肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類,其中,非小細(xì)胞肺癌約占80%,肺腺癌約占32%-40%[2]。由于缺乏特異的臨床癥狀,僅僅表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難或者體重減輕等,75%的患者在就診是已經(jīng)處于中晚期,由于其惡性度高,易復(fù)發(fā),易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),絕大多數(shù)患者的預(yù)后較差,生存時(shí)間不超過5年。為延長(zhǎng)肺腺癌患者的生存周期,降低死亡率,研究肺腺癌的發(fā)生機(jī)制以及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因,更好的對(duì)患者進(jìn)行早診顯得尤為重要。腫瘤的持續(xù)增長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲依賴于腫瘤細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境(Tumor microenviroment,TME)中交互作用。TEM是腫瘤存在的環(huán)境,包括腫瘤細(xì)胞、周圍血管和細(xì)胞外基質(zhì)、其它非惡性細(xì)胞及信號(hào)分子[3-4]。目前的研究認(rèn)為,腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于內(nèi)環(huán)境中細(xì)胞分泌、分泌途徑和分泌蛋白對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的交流和信息傳遞。并且,微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞和其它細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分和其它分子是腫瘤潛在標(biāo)記物和治療藥物靶點(diǎn)的豐富來源[5]。基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在過去的十年里發(fā)展迅速,在腫瘤標(biāo)記物的篩選、分類、發(fā)生發(fā)展機(jī)制、治療和預(yù)后評(píng)估等方面承擔(dān)重要角色。多種標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度都較單一的標(biāo)志物檢測(cè)更高[6]。比較蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)蛋白質(zhì)組的整體進(jìn)行分析,從蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、表達(dá)數(shù)量、修飾狀態(tài)上進(jìn)行比較,得出蛋白質(zhì)組見的差異,為腫瘤診斷標(biāo)志物的篩選提供了全新的思路。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣品進(jìn)行直接定量比較,結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(iTRAQ-LC-MS/MS),具有靈敏度高、適用范圍廣、特異性強(qiáng)、定量精準(zhǔn)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前,分子診斷以血清學(xué)為主,其中高豐度蛋白占99%,低豐度蛋白不足1%,低豐都蛋白雖然稀少,但腫瘤標(biāo)志物主要儲(chǔ)存于這些蛋白中[7]。
分泌組(Secretome)是指從活細(xì)胞內(nèi)合成,分泌到胞外起作用的蛋白質(zhì),參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移等過程。腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的改變和機(jī)體對(duì)腫瘤的反應(yīng)均可引起釋放在腫瘤微環(huán)境中的分泌蛋白的表達(dá)異常,進(jìn)而可能引起腫瘤的增值、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。研究肺腺癌病理改變導(dǎo)致的分泌蛋白表達(dá)的改變,對(duì)于我們篩選肺腺癌血清標(biāo)志物、診斷和預(yù)后和療效檢測(cè)都有重要的意義。
本研究對(duì)同一來源的高低轉(zhuǎn)移能力的Anip973、AGZY83a 以及正常肺支氣管上皮細(xì)胞系的8-plex iTRAQ定量結(jié)果進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究,以期發(fā)現(xiàn)肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物,進(jìn)一步篩選可用于肺腺癌預(yù)后及干預(yù)的潛在標(biāo)志物。
人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973與AGZY83a 細(xì)胞系購(gòu)自上海拜利生物有限公司(https://www.bioleaf.com/),此兩株細(xì)胞于液氮中保存于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理教研室。
Anip973、AGZY83a 、HBE細(xì)胞系于含表皮生長(zhǎng)因子(rEGF)和牛垂體提取物(BPE)的無血清培養(yǎng)基中 (Invitrogen, formerly GIBCO-BRL, Cat. No.17005-042)在37℃、5% CO2的條件下孵育至細(xì)胞豐度達(dá)80%左右時(shí),取培養(yǎng)基1500rpm離心,10分鐘后取上清進(jìn)行分泌蛋白提取。
將收集的上清裝于透析袋(3500Da, Millipore,Billerica, MA, USA)分別在100mmoL、50 mmoL、25 mmoL、10 mmoL NaCL 透 析 液 中2h,4h,8h,12h進(jìn)行梯度透析,最后放入兩蒸水中24小時(shí)之后放入-80℃過夜。過夜之后的固體狀態(tài)的透析液真空濃縮系統(tǒng)(Heto-Holten,Aller d, Denmark)12h-14h直至固體粉末狀態(tài)。
將Anip973和AGZY83a 溶解于裂解緩沖液中[8M尿素(GibcoBRL)、4% CHAPS(Calbiochem)、10 mM DTT(Pro-mega)、1 mM PMSF (Amesco)、2mM EDTA (Ame-sco)]。DTT 10mM,56℃ 1h,IAM 55mM,避光45min,進(jìn)行蛋白烷基化。酶(Promega):蛋白質(zhì)=1:30,37℃,共消化36小時(shí),消化24小時(shí)之后,補(bǔ)加底物質(zhì)量的1/100Trypsin。使用8-標(biāo)iTRAQ 試劑盒((AB Sciex, Foster City, CA, USA)進(jìn)行樣本標(biāo)記:將70μL異丙醇加到標(biāo)記試劑中進(jìn)行復(fù)融,并且消化的肽段標(biāo)記于不同的iTRAQ 試劑上(Anip973 和AGZY83a分別標(biāo)記117、119),室溫孵育2h,將3個(gè)樣本的肽段放入真空濃縮儀。
強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)采用島津LC-6AD高效液相色譜泵系統(tǒng),將在4mL緩沖液A(10 mMKH2PO4,25% ACN,pH 3.0) 消化的肽段加入4.6×250mm的Ultremex 強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(Phenomenex)。肽段在A緩沖液中以1mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫20min,采用逐步提高陽(yáng)離子濃度的洗脫的方式將大部分肽段洗脫下來,洗脫下來的肽段分為12部分通過Strata X C18柱(Phenomenex)脫鹽并真空干燥。
結(jié)合在線毛細(xì)管液相色譜系統(tǒng)(Famos,Switchos, Ultimate; Dionex, Amsterdam, Netherlands),采 用micrOTOF-Q II (Bruker Daltonics, Bremen,Germany),進(jìn)行肽組分的納米流電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析。
使 用MASCOT 軟 件(Mascot 2.3.01 software,Matrix-Science)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用Swiss-Prot 57.15人類蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(515,286 條序列),搜索時(shí)利用以下5個(gè)特異性參數(shù):(1)肽和碎片離子的質(zhì)量公差±0.5Da;(2)一個(gè)缺失的酶蛋白酶裂解;(3)氨基甲基半胱氨酸固定化修飾;(4)氧化變量;(5)iTRAQ 8標(biāo)-復(fù)合物(K),iTRAQ 8標(biāo)-復(fù)合物(N-末端),iTRAQ 8標(biāo)-復(fù)合物(Y),氧化(M)。
將蛋白序列輸入 SecretomeP2.0 和SignalP4.0 servers (http://www.cbs.dtu.dk/services)預(yù)測(cè)蛋白的通路,使用AmiGO version 1.8 software (http://amigo.geneontology.org)預(yù)測(cè)差異分泌蛋白的功能,所分析的差異分泌蛋白分類為:細(xì)胞組成,分子功能和生物學(xué)過程。
RIPA裂解液裂解細(xì)胞或組織提取腎皮質(zhì)組織全蛋白,取40μg上樣,在SDS-PAGE膠體中電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜(300mA,100min),含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉60min,4℃過夜孵育一抗(ALPP稀釋比例分別為1:2000),洗去未結(jié)合的一抗,加入HRP偶聯(lián)二抗(1:5000稀釋)室溫孵育60min,最后用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影、定影,掃描膠片并保存數(shù)據(jù)。
為鑒定肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)血清標(biāo)志物,iTRAQ標(biāo)記的三株株細(xì)胞系A(chǔ)nip973、AGZY83和HBE的分泌蛋白經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)共鑒定492個(gè)差異表達(dá)蛋白,當(dāng)設(shè)置(117/119,117/113,119/113)?。?.5或<0.667并且至少含有一個(gè)特異性肽段時(shí),Anip973與AGZY83a比較的差異蛋白表達(dá)共161個(gè),Anip973與HBE比較的差異蛋白表達(dá)共86個(gè),AGZY83a 與HBE比較的差異單蛋白表達(dá)共98個(gè)。經(jīng)IPA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,與腫瘤遷移、血管生成、增值、黏附、侵襲相關(guān)的蛋白,見表1。
表1 IPA 數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤標(biāo)記物富集
見圖1。
圖1 同一遺傳背景不同轉(zhuǎn)移能力的2株細(xì)胞系A(chǔ)nip973和AGZY83a差異蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)組比較的細(xì)胞組分注釋、分子功能注釋、生物學(xué)過程注釋。
iTRAQ 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同一遺傳背景不同轉(zhuǎn)移能力的兩株細(xì)胞系A(chǔ)nip973和AGZY83a比較,ALPP蛋白在AGZY83a細(xì)胞系分泌蛋白中高表達(dá)(見圖2)。
圖2 ALPP蛋白在相同遺傳背景相同轉(zhuǎn)移能力不同的Anip 973細(xì)胞系和AGZY83a細(xì)胞系的分泌蛋白中的表達(dá)情況
續(xù)表1
本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ 標(biāo)記定量的方法,比較兩株遺傳背景相同轉(zhuǎn)移能力不同的肺腺癌細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973和AGZY83a的分泌蛋白表達(dá)差異,以尋找肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子。
腺癌作為最常見的肺癌病理類型,約占到NSCLC的40%[9]。由于臨床癥狀隱匿,很多患者就診時(shí)已經(jīng)為中晚期,有的已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,喪失手術(shù)機(jī)會(huì),預(yù)后較差。隨著靶向藥與免疫治療的推廣應(yīng)用,無法進(jìn)行手術(shù)的晚期肺癌患者的5年生存率有所提高,目前早期診斷的手段主要采用低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù),這使得肺癌的早期診斷率有所提高。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展,iTRAQ標(biāo)記技術(shù)與高敏感性、高準(zhǔn)確性的串聯(lián)質(zhì)譜以及多為液相色譜聯(lián)用已經(jīng)成為蛋白質(zhì)定量、定性的主要研究工具。分泌蛋白可以通過復(fù)雜的途徑進(jìn)入唾液、血液或者其它體液中并且可以用作唾液、血液、或其它體液檢測(cè)的蛋白標(biāo)志物[10]。這些蛋白標(biāo)志物的變化可以為檢測(cè)組織或者器官的生理狀態(tài)提供線索,對(duì)疾病做出及時(shí)的檢測(cè)和診斷。
本研究對(duì)鑒定的差異分泌蛋白進(jìn)生物信息學(xué)分析,首要在IPA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了與遷移、轉(zhuǎn)移、血管生成、增殖、粘附以及侵襲相關(guān)的蛋白,并且選取了與白細(xì)胞遷移、腺癌、肝癌、膽管癌、性腺腫瘤、肺癌、子宮癌、生殖器腫瘤、宮頸癌、睪丸癌等腫瘤相關(guān)的ALPP 蛋白進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證。在肝腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因進(jìn)行基因芯片研究結(jié)果表明,與對(duì)照細(xì)胞MOCK 細(xì)胞比較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJHCC-2的肝癌細(xì)胞5B4,出的差異蛋白中,ALPP基因表達(dá)量明顯下降[11],這表明ALPP 在肝癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮這某種作用。本研究結(jié)果為ALPP 蛋白在相同遺傳背景的兩株不同轉(zhuǎn)移能力的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973 、AGZY83a 比較中,低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系A(chǔ)GZY83a 中表達(dá)月高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系A(chǔ)nip973的3倍,這表明,ALPP過某種機(jī)制抑制肺腺癌的轉(zhuǎn)移,其發(fā)揮作用的具體靶點(diǎn)以及相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。