鉻脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生理響應(yīng)的主成分分析

劉長風(fēng)， 王 椰， 段士鑫， 王天楚， 劉學(xué)貴， 高品一

(1. 沈陽化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧沈陽 110142； 2.沈陽化工大學(xué)功能分子研究所，遼寧沈陽 110142；3. 沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽 110142)

紫花苜蓿(L.)為耐寒、耐旱的多年生豆科植物，具有較高的營養(yǎng)、經(jīng)濟及生態(tài)價值。截至2016年，我國商品苜蓿年產(chǎn)量已達100萬t，且仍呈上升趨勢。已有研究表明，紫花苜蓿對鎘、鉛、釩等重金屬脅迫具有一定耐受性。同時由于紫花苜蓿生長周期短、產(chǎn)量大、可多次刈割，在污染土壤的植被修復(fù)中被廣泛研究和應(yīng)用。本研究旨在探討紫花苜蓿在重金屬鉻脅迫下的抗氧化性及生長生理響應(yīng)規(guī)律。

主成分分析法(PCA)能將多個具有相關(guān)性的指標(biāo)通過數(shù)值分析計算，轉(zhuǎn)換為少數(shù)互不關(guān)聯(lián)的綜合指標(biāo)，避免了信息的重疊，達到“降維”的目的；綜合指標(biāo)在涵蓋原有多數(shù)指標(biāo)的基礎(chǔ)上，更直觀地反映了植物逆境脅迫下的內(nèi)在響應(yīng)規(guī)律，因此被廣泛應(yīng)用于植物抗逆性研究中。

本試驗以紫花苜蓿為試驗材料，通過水培模擬試驗探究其在不同濃度Cr脅迫下種子萌發(fā)、幼苗生理響應(yīng)和鉻積累情況。通過主成分分析法判斷苜?？剐员憩F(xiàn)的主要生理指標(biāo)，以便更直觀快捷地表征苜蓿在Cr脅迫下的氧化損傷程度及抗氧化應(yīng)激響應(yīng)規(guī)律，以期為探討紫花苜蓿在Cr污染土壤下的生長情況提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與水培試驗

試驗所用紫花苜蓿品種為金皇后，于2020年9月在遼寧省沈陽市進行試驗。篩選籽粒飽滿的種子于5% NaClO中消毒，每皿(直徑90 mm)放入40粒苜蓿種子，加入Cr處理液[0(CK)、1、5、10、20、30、50 mg/L]和1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液。在保持Cr濃度恒定期間，于全自動光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10 d，溫度為(20±1) ℃，光照時間為白天 ∶夜晚= 16 h ∶8 h)。

1.2 苜蓿種子萌發(fā)測定

按照《國際種子檢驗章程》，于試驗第4天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第10 天統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、抑制指數(shù)(根、莖)。

1.3 苜蓿幼苗鉻累積測定

將培養(yǎng)10 d后的苜蓿鮮樣取出清洗、烘干至恒質(zhì)量，用HCl-HNO-HClO消解定容，用火焰原子吸收法測定幼苗鉻含量。

1.4 苜蓿幼苗生理指標(biāo)測定

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0、Origin 2018對數(shù)據(jù)進行分析處理，所有試驗數(shù)據(jù)均為3個試驗組平均值。采用單因素方差分析法(ANOVA)對不同濃度Cr處理組數(shù)據(jù)進行差異性分析(=0.05)，采用SPSS 26.0進行主成分分析，采用Origin 2018進行圖形繪制。

專利間接侵權(quán)制度的輔助侵權(quán)一元立法論............................................................................................徐媛媛 01.80

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr6+脅迫對苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表1可知，低濃度(5～10 mg/L)Cr脅迫處理可促進苜蓿種子萌發(fā)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)均顯著增加；而種子活力指數(shù)在Cr脅迫下顯著降低(<0.05)，在50 mg/L時降至CK的12.78%；在Cr脅迫下苜蓿幼苗的根、莖伸長受到顯著抑制，且根長受到的抑制作用大于莖。

表1 不同濃度Cr6+脅迫對苜蓿種子萌發(fā)及幼苗長勢的影響

2.2 Cr6+脅迫對苜蓿幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1 Cr脅迫對苜蓿幼苗鉻吸收的影響 由圖1可知，隨Cr脅迫濃度的增加，苜蓿幼苗中鉻吸收量顯著增加(<0.05)，在處理濃度為1～20 mg/L時，苜蓿幼苗體內(nèi)鉻含量較對照增加了44～540倍，在50 mg/L時達CK的806倍。

2.2.2 Cr脅迫對苜蓿幼苗根系活力的影響 苜蓿幼苗根系活力隨Cr脅迫濃度增加總體呈下降趨勢(圖2)。在低濃度(1～5 mg/L)下，苜蓿幼苗根系活力變化不顯著(>0.05)；但在Cr濃度≥10 mg/L 時，根系活力出現(xiàn)顯著下降(<0.05)，且在濃度為20 mg/L時降低至CK的50%以下，在50 mg/L時降至CK的21%。

2.2.3 Cr脅迫對苜蓿幼苗葉綠素含量的影響 苜蓿幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均隨Cr脅迫濃度的增加先升后降(圖3)。施加1 mg/L Cr時，苜蓿幼苗葉綠素a及總?cè)~綠素含量顯著增加(<0.05)，隨脅迫加深Cr脅迫濃度與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)，20 mg/L時均降至CK的50%以下；在50 mg/L時部分葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。

2.2.5 Cr脅迫對苜蓿幼苗中MDA含量的影響 苜蓿幼苗中MDA含量隨脅迫濃度增加而上升(圖5)。Cr濃度在5 mg/L時，幼苗中MDA含量顯著增加(<0.05)；在Cr脅迫濃度為5～30 mg/L時，MDA含量增加緩慢。Cr脅迫濃度為50 mg/L時，MDA含量到試驗最大值，為0.017 8 μmol/g 。

2.2.6 Cr脅迫對苜蓿幼苗脯氨酸、可溶性蛋白含量的影響 苜蓿幼苗中脯氨酸含量與Cr濃度呈顯著正相關(guān)(<0.05)，可溶性蛋白含量隨Cr濃度的增加呈先升后降的趨勢(圖6)。幼苗中可溶性蛋白含量在Cr脅迫濃度為1 mg/L時達到試驗峰值，較CK增加35.50%，之后隨著Cr濃度增加而顯著下降(<0.05)，并在50 mg/L時降至CK的86.26%，達試驗最低值。Cr脅迫處理苜蓿體內(nèi)游離脯氨酸含量較CK增加了62.41%～104.68%，在50 mg/L時達試驗最大值，為57.72 μg/g 。

2.2.7 Cr脅迫對苜蓿幼苗GSH、AsA含量的影響 由圖7可知，苜蓿幼苗中AsA、GSH、GSH+AsA含量隨Cr脅迫濃度增加均呈先增后降的趨勢。AsA含量在Cr脅迫濃度為5 mg/L時出現(xiàn)試驗峰值，達對照的3.18倍；GSH含量在Cr脅迫濃度為1 mg/L時顯著增加(<0.05)，1～10 mg/L時變化不顯著(>0.05)，但整體均在CK的3倍以上，在Cr脅迫濃度為 20 mg/L 時顯著增加(<0.05)，并在30 mg/L時含量增至CK的9.81倍。GSH+AsA含量在Cr脅迫濃度為5 mg/L時達到CK的3.30倍，且除Cr脅迫濃度為50 mg/L以外，其余各處理組GSH+AsA含量均顯著高于CK(<0.05)。

2.2.8 Cr脅迫對苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響 由圖8可知，苜蓿幼苗中POD、SOD活性隨Cr脅迫濃度變化而存在差異，POD活性與Cr脅迫濃度呈正相關(guān)，各試驗梯度下較CK增加了1.34～2.81倍；SOD活性隨Cr脅迫濃度變化不顯著(>0.05)，整體呈先升后降的趨勢，各試驗梯度下幼苗中SOD活性整體高于對照，并在10 mg/L時達到試驗峰值。

2.3 主成分分析

由主成分分析結(jié)果(表2)可知，前3個主成分方差累積達90%以上，故前3個主成分能較好地反映Cr脅迫下苜蓿幼苗主要生理指標(biāo)的變化。由表3中成分矩陣系數(shù)及圖9可知，主成分1的貢獻率達68%以上，對主成分1貢獻較大的指標(biāo)為幼苗中的鉻含量、根系活力、MDA含量、POD活性、HO含量，因此當(dāng)苜蓿遭受Cr脅迫時，幼苗中鉻含量、根系活力、MDA含量、POD活性及HO含量能較好地反映苜蓿的生理變化。后續(xù)研究中可以考慮以這幾項指標(biāo)作為判定苜蓿受脅迫狀況的依據(jù)。

表2 生理指標(biāo)主成分分析方差解釋

表3 成分矩陣

3 討論

種子萌發(fā)期對Cr脅迫濃度變化敏感，苜蓿種子萌發(fā)情況能較好地反映其Cr耐受水平。研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cr可提高苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)； 但高濃度Cr脅迫表現(xiàn)出顯著抑制作用。

種子活力指數(shù)是衡量種子發(fā)芽質(zhì)量及幼苗生長勢的重要指標(biāo)之一，Cr顯著抑制苜蓿種子活力指數(shù)、根長及莖長，且Cr對根的抑制大于莖。這說明Cr濃度對種子萌發(fā)的影響呈低促高抑趨勢，但對種子生長勢及苜蓿幼苗后續(xù)生長發(fā)育具有顯著的抑制作用。

植物根系是植物受外環(huán)境脅迫的第一道屏障，根系活力是衡量植物根系功能的重要指標(biāo)之一。幼苗根系活力與Cr脅迫濃度存在顯著的劑量效應(yīng)，隨Cr脅迫濃度的增加而根系活力顯著下降，且這種負(fù)相關(guān)效應(yīng)在高濃度Cr脅迫時更明顯。這是由于植物根系在重金屬脅迫下會通過一系列反應(yīng)緩解毒害效應(yīng)，包括減少吸收和阻礙運輸以達到重金屬解毒作用；而過量的鉻超出根系細(xì)胞壁與液泡區(qū)隔作用閾值，進入植物細(xì)胞內(nèi)，破壞原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)，造成根系活力下降；未被根系阻隔的Cr經(jīng)主動運輸在葉片中積累，葉綠素是衡量植物光合作用功能的重要指標(biāo)。低濃度(≤5 mg/L)Cr脅迫顯著促進了苜蓿幼苗總?cè)~綠素、葉綠素a及葉綠素b合成，而高濃度(≥10 mg/L)Cr脅迫顯著抑制了葉綠素合成，且葉綠素b對鉻脅迫敏感。這可能是由于低濃度的Cr可增強植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；而高濃度的Cr造成葉綠體膜損傷破裂；同時由于鉻-鐵互作效應(yīng)降低了植物體內(nèi)活性鐵的可利用性，導(dǎo)致葉綠素合成受阻、影響植物光合作用。

細(xì)胞膜是維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，胞外環(huán)境中過高的重金屬誘導(dǎo)植物體內(nèi)ROS大量積累，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，引起膜脂過氧化反應(yīng)。MDA是衡量細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的重要指標(biāo)。本研究表明，苜蓿體內(nèi)的MDA含量與Cr脅迫濃度呈顯著正相關(guān)，這說明Cr對苜蓿幼苗細(xì)胞膜有顯著毒害作用。滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)能調(diào)節(jié)植物體內(nèi)滲透壓、維持營養(yǎng)物質(zhì)和能量吸收，維持植物在逆境下正常的生長代謝?？扇苄缘鞍缀透彼崾侵参矬w內(nèi)的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，Cr脅迫下苜蓿幼苗體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸可直接消耗ROS，是植物抗性的重要過程之一，Cr脅迫下脯氨酸的積累表明苜蓿對Cr具有一定的抗性；同時可溶性蛋白也參與細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)苜蓿幼苗在低濃度(≤5 mg/L)Cr脅迫時體內(nèi)可溶性蛋白含量顯著增加，相反高濃度Cr脅迫下其可溶性蛋白含量下降，這同樣表明苜蓿對低濃度Cr具有一定的抗性，而高濃度Cr影響蛋白質(zhì)的合成，加速蛋白質(zhì)的分解，造成苜蓿幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量下降。

4 結(jié)論

Cr脅迫濃度≤10 mg/L時，苜蓿種子萌發(fā)被促進。幼苗能通過調(diào)節(jié)POD活性、脯氨酸含量及GSH+AsA含環(huán)量，維持幼苗體內(nèi)ROS平衡，同時幼苗葉綠素含量顯著增加(<0.05)，幼苗正常的生長代謝過程未受顯著影響。Cr脅迫濃度≥10 mg/L時，苜蓿幼苗體內(nèi)正常代謝過程被打亂，氧化損傷加劇，對苜蓿造成毒害。同時通過對苜蓿氧化脅迫響應(yīng)指標(biāo)進行主成分分析發(fā)現(xiàn)，鉻積累量、根系活力、MDA含量、HO含量、POD活性等5個指標(biāo)能良好地表征苜蓿在Cr脅迫下氧化脅迫響應(yīng)規(guī)律。綜上所述，紫花苜蓿能耐受低濃度(≤5 mg/L)Cr脅迫，而高濃度Cr脅迫對苜蓿具有顯著的毒害作用。這可以縮減后續(xù)研究應(yīng)用的工作量，為鉻污染土壤下紫花苜蓿等植物生長提供數(shù)據(jù)支撐。