牛蒡根結(jié)線蟲生防芽孢桿菌篩選及其生防機制研究

孫 科， 王 萌， 馮希勇

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥品食品學(xué)院，江蘇徐州 221006)

根結(jié)線蟲(spp.)是一種寄生性植物病原線蟲，能侵染3 000多種植物，對世界農(nóng)業(yè)危害嚴重，每年約造成1 000 億美元的損失。其中，南方根結(jié)線蟲()是危害我國農(nóng)作物及蔬菜的優(yōu)勢種，也是牛蒡種植中重要的蟲害，亟需安全有效的防治措施。由于化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的破壞越來越嚴重，我國對化學(xué)農(nóng)藥的使用限制也越來越嚴格，絕大多數(shù)殺線劑我國已經(jīng)禁用。生物防治根結(jié)線蟲病是減少化學(xué)農(nóng)藥危害實現(xiàn)綠色環(huán)保的重要途徑。目前，許多學(xué)者做出了有意義的探索與研究，分離篩選得到多種拮抗根結(jié)線蟲的生防菌，其中真菌比例最大，如哈茨木霉()、厚垣輪枝孢菌()、淡紫色擬青霉()等。芽孢桿菌()是一類重要的植物病蟲害生防菌，具有抗逆性強、功能多樣、親和性好等特性。目前，芽孢桿菌對根結(jié)線蟲的防治研究逐漸增多，Gao等發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽孢桿菌()S2的發(fā)酵產(chǎn)物鞘氨醇對南方根結(jié)線蟲以及秀麗桿線蟲具有較強的致死性。史鳳玉等研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌()以及解淀粉芽孢桿菌()的次生代謝產(chǎn)物具有顯著的殺滅根結(jié)線蟲的能力。雖然篩選出的根結(jié)線蟲的生防菌種類較多，但真正用于實際生產(chǎn)中極少，因此，挖掘新的根結(jié)線蟲生防菌仍然具有重要意義。

隨著時間的推移，植物病蟲害發(fā)病嚴重的田塊會出現(xiàn)病蟲害減輕的現(xiàn)象，并成為自然衰退現(xiàn)象，研究學(xué)者把具有自然衰退現(xiàn)象的土壤成為抑制性土壤。研究者認為之所以會出現(xiàn)病蟲害自然衰退現(xiàn)象，是因為土壤中存在大量病蟲害天敵，特別是一些拮抗微生物。因此，利用牛蒡根結(jié)線蟲自然衰退現(xiàn)象的抑制性土壤篩選根結(jié)線蟲拮抗劑，為尋找根結(jié)線蟲生物防治提供了一條新的途徑。本研究從江蘇省徐州市豐縣、沛縣牛蒡種植南方根結(jié)線蟲病自然衰退的土壤中，篩選南方根結(jié)線蟲生防菌，并研究生防菌發(fā)酵產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲的作用機制，以期為牛蒡根結(jié)線蟲病的綠色防治提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本來源 從徐州市豐縣、沛縣種植牛蒡的9個鎮(zhèn)，選取根結(jié)線蟲發(fā)病嚴重的牛蒡大田中采集生防菌芽孢桿菌樣本。南方根結(jié)線蟲由徐州市綠色植保工程技術(shù)研究中心提供。

試驗時間為2019年3月至2020年11月，試驗地點為徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物發(fā)酵研究中心和江蘇省徐州市沛縣牛蒡生產(chǎn)基地。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，瓊脂18 g，去離子水 1 000 mL，pH值為6.8～7.2。121 ℃滅菌20 min，培養(yǎng)基冷卻到50～55 ℃，加入過濾的放線菌酮20 mg。

LB液體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基配制過程中去掉瓊脂和放線菌酮。

1.1.3 供試牛蒡品種 牛蒡品種為新林-徐州1號，由徐州山崎農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)有限公司提供。

1.1.4 檢測試劑盒 總糖含量測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒、總蛋白(TP)含量測定試劑盒、羧酸酯酶(CES)活性檢測試劑盒、乙酰膽堿酯酶(ACh)活性檢測試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD單人單面超凈工作臺，購自上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；FA1004B-2204B萬分之一電子分析天平，購自青島聚創(chuàng)華業(yè)分析儀器有限公司；QM-QX-20L行星球磨機，購自長沙米淇儀器設(shè)備有限公司；MS-3漩渦混合儀，購自上海巴玖實業(yè)有限公司；SHP-80D生化培養(yǎng)箱，購自上海森信實驗儀器有限公司；SN5000SPlus紫外可見分光光度計，購自青島精誠儀器儀表有限公司；TG16G離心機，購自常州市億能實驗儀器廠；HWY-2112B立式雙層恒溫搖床，購自蘇州威爾實驗用品有限公司；G-12K離心機，購自濟南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生防菌篩選 把采集的9份樣品各取10 g加入裝有90 mL無菌生理鹽水的250 mL三角瓶中，80 ℃、180 r/min水浴加熱60 min，取1 mL菌懸液加入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩，按此方法進行濃度梯度稀釋。取10、10、10濃度的菌懸液0.1 mL進行平板涂布，每個濃度3次重復(fù)。在28 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)2 d，挑取平板上細菌單菌落劃線純化，將純化的單菌落接種于試管斜面，4 ℃保藏備用。

挑取分離純化的試管菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h制成種子液。以2%接種量進行發(fā)酵液制備，28 ℃、200 r/min發(fā)酵 48 h。將發(fā)酵液在12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，取上清液備用。

用2% NaClO溶液對根結(jié)線蟲卵囊塊消毒，25 ℃ 恒溫箱中孵化5 d獲得根結(jié)線蟲二齡幼蟲。在96孔板上每孔加入30頭根結(jié)線蟲二齡幼蟲，同時滴入 200 μL 過濾發(fā)酵液，進行毒力測定，每株菌株進行3次重復(fù)，并用LB液體培養(yǎng)基對照。25 ℃恒溫培養(yǎng)，24、48、72 h后用顯微鏡觀察根結(jié)線蟲的存活狀況。判斷線蟲死亡的標準為針觸碰不動為死亡個體。死亡率計算公式如下：

死亡率=線蟲死亡數(shù)/線蟲總數(shù)×100%；

校正死亡率=(處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率)/(1-對照線蟲死亡率)×100%。

1.3.2 盆栽試驗 將牛蒡種子在0.2% KMnO溶液種浸泡30 min后，用無菌水洗滌5次。放置于底層鋪滿吸水濾紙的培養(yǎng)皿中萌發(fā)。把發(fā)芽的牛蒡種子種植在裝有無菌培養(yǎng)土的花盆中，當(dāng)牛蒡長出4張真葉時，在距根5 cm處灌入10 mL發(fā)酵過濾液，5 d后每盆接入含有約3 000頭根結(jié)線蟲懸液 3 mL，同時用0.5%阿維菌素進行比較，對照組接入5 mL無菌水，每個菌株設(shè)置3次重復(fù)。溫室大棚中培養(yǎng)50 d，拔出牛蒡植株，用無菌水反復(fù)沖洗根部，統(tǒng)計根結(jié)數(shù)量。根據(jù)文獻[14]，確定根結(jié)指數(shù)和防治效果。

1.3.3 菌株鑒定 把篩選出的菌株在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后進行顯微觀察，并進行生理生化試驗。同時利用細菌總DNA提取試劑盒對篩出的菌株進行基因組提取，采用16S通用引物進行分析比對，利用系統(tǒng)進化分析及分子鑒定軟件Mega 7.0.14進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建。

1.3.4 抗根結(jié)線蟲菌株的生防機制研究 取根結(jié)線蟲卵囊塊，用1%NaClO溶液表面消毒2 min，用無菌水沖洗3～5次，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)孵化，用無菌生理鹽水把孵出的二齡幼蟲配成2萬頭/mL懸浮液，備用。

發(fā)酵濾液用乙酸乙酯萃取、減壓蒸餾、真空冷凍干燥，制成凍干粉。用去離子水配制成濃度為5、10、15 μg/mL發(fā)酵產(chǎn)物溶液，保存于4 ℃冰箱。

在1.5 mL離心管中加入100頭南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲，同時加入500 μL濃度為5、10、15 μg/mL的發(fā)酵產(chǎn)物溶液，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別于12、24、36、48 h后在離心管中加入1 mL緩沖液于冰浴中勻漿，對照組加入無菌LB液體培養(yǎng)基，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液。利用相關(guān)試劑盒測定發(fā)酵濾液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲體內(nèi)總糖、總蛋白降解情況，并檢測發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲體內(nèi)羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶及過氧化氫酶等活性的影響，每個處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌分離篩選結(jié)果

從9個鎮(zhèn)牛蒡種植區(qū)共篩選出產(chǎn)芽孢的細菌72株，通過制備細菌發(fā)酵過濾液作用于南方根結(jié)線蟲的卵囊及二齡幼蟲，從表1可以看出，8株細菌的發(fā)酵過濾液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲校正死亡率大于65%，其中LB-16菌株的發(fā)酵過濾液對線蟲的校正死亡率最高，達到了86.24%，菌株LB-24、LB-07、LB-36、LB-59發(fā)酵過濾液對線蟲的校正死亡率>70%，分別達到了80.19%、76.57%、74.83%、71.53%。同時測定了細菌發(fā)酵過濾液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的影響，可以看出，菌株LB-16對線蟲卵孵化抑制率最高達到82.24%，相對應(yīng)的孵化率為11.75%。孵化抑制率大于75%的菌株還有LB-24、LB-07、LB-36，抑制率分別為76.83%、77.67%、79.96%，對應(yīng)的孵化率分別為15.37%、14.62%、13.67%。因此，挑選LB-16、LB-24、LB-07、LB-36等4株菌株進行盆栽試驗。

表1 不同細菌發(fā)酵濾液對南方根結(jié)蟲卵孵化率和二齡幼蟲死亡率的影響

2.2 盆栽試驗結(jié)果

從盆栽試驗結(jié)果(表2)可以看出，菌株LB-16發(fā)酵濾液灌根處理后牛蒡的根結(jié)指數(shù)較小，防治效果最好，高于0.5%阿維菌素的防治效果。菌株 LB-24 的防治效果為63.58%，菌株LB-07的防治效果為59.92%，防治效果都大于50%。同時，菌株LB-16的株高和鮮質(zhì)量與CK相比顯著增加。由此可見，菌株LB-16的生防效果最好。

表2 盆栽試驗結(jié)果

2.3 菌株LB-16鑒定

菌株LB-16在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈白色、不透明，邊緣為不規(guī)則圓形，革蘭氏染色呈陽性。從表3可以看出，菌株LB-16與短短芽孢桿菌的生理生化反應(yīng)具有相同的特征。將菌株LB-16的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳檢測，獲得擴增片段大約約 1 500 bp，與原核生物的16S rRNA片段大小相符。把擴增產(chǎn)物回收純化，進行基因序列測定。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，選取重疊率大于98%的菌株構(gòu)架系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖1可以看出，短短芽孢桿菌() strain CanS-411(KT580607.1)與菌株LB-16的同源性最近，并處在同一分支中。結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA基因分子鑒定結(jié)果，菌株LB-16是和短短芽孢桿菌親緣關(guān)系較近的一種芽孢桿菌。

表3 生防菌LB-16生理生化特性

2.4 菌株LB-16生防機制的研究結(jié)果

2.4.1 菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲體內(nèi)總糖含量的影響 由圖2可知，發(fā)酵產(chǎn)物處理過的線蟲體內(nèi)總糖含量明顯低于對照組，并且隨著發(fā)酵產(chǎn)物濃度的增加總糖含量逐漸下降，隨著作用時間的延長總糖含量也迅速降低，而對照組的總糖含量隨著線蟲的生長逐漸增加。48 h時，對照組線蟲的總糖含量達到54.16 μg/mL，而15 μg/mL發(fā)酵產(chǎn)物處理的線蟲總糖含量只有4.78 μg/mL，前者是后者的11.33倍。說明菌株LB-16的發(fā)酵產(chǎn)物具有明顯的抑制南方根結(jié)線蟲糖代謝的作用，限制了線蟲體內(nèi)糖的積累，從而抑制了線蟲的正常生命活動。

2.4.2 菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲體內(nèi)總蛋白含量的影響 由圖3可知， 經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)物處理過的線蟲總蛋白含量與對照相比明顯降低，隨著發(fā)酵產(chǎn)物濃度的增加，總蛋白含量降幅也在增加，隨著作用時間的延長，總蛋白含量逐漸減少，且總蛋白含量變化趨勢和總糖含量變化趨勢基本一致。48 h時，對照組的總蛋白含量達到了 118.24 μg/mL，而15 μg/mL發(fā)酵產(chǎn)物處理的總蛋白含量只有 4.58 μg/mL，前者是后者的25.82倍。對照組的總蛋白含量呈上升趨勢， 表明線蟲蛋白質(zhì)代謝正常，體內(nèi)蛋白質(zhì)不斷積累，而試驗組蛋白質(zhì)代謝受到破壞，體內(nèi)總蛋白積累明顯減少，影響了線蟲的正常生命活動。

2.4.3 菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響 由圖4可知，發(fā)酵產(chǎn)物處理過的線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性相對于對照組受到明顯抑制，隨著發(fā)酵產(chǎn)物濃度的增高乙酰膽堿酯酶活性明顯下降。15 μg/mL濃度處理的酶活性最低，基本沒發(fā)生變化(24 h時酶活性略有增加)。5 μg/mL濃度處理下酶活和對照組差異不明顯，10 μg/mL濃度處理的乙酰膽堿酯酶活性降幅最大。48 h時，15 μg/mL濃度處理組的酶活性比對照組下降了77.24%，說明菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物能明顯抑制乙酰膽堿酯酶活性，造成根結(jié)線蟲神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，從而影響線蟲的正常生命活動。

2.4.4 菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲體內(nèi)過氧化氫酶活性的影響 由圖5可知，對照組的過氧化氫酶活性隨著時間的延長呈逐漸增加的趨勢，但處理組的過氧化氫酶活性隨著發(fā)酵產(chǎn)物濃度的增加和處理時間的延長呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢，在12～24 h酶活性降幅較大。15 μg/mL濃度處理組的酶活性最低且基本不隨時間變化而變化，5、10 μg/mL 濃度處理組酶活性下降幅度大致相同。48 h時，15 μg/mL濃度處理組的酶活比對照組下降了84.07%，說明菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物能明顯抑制過氧化氫酶活性，干擾根結(jié)線蟲正常代謝，影響線蟲正常的生命活動。

2.4.5 菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲體內(nèi)羧酸酯酶活性的影響 由圖6可知，對照組的羧酸酯酶活性呈逐漸增加趨勢，且隨著時間的延長，酶活性增幅也在增加。5 μg/mL濃度處理組羧酸酯酶活性比對照組略有降低，但變化幅度較小。10 μg/mL 濃度處理組羧酸酯酶活性比對照組有較大幅度的降低，而15 μg/mL濃度處理組的羧酸酯酶活性最低，且隨時間變化的幅度很小。48 h時，15 μg/mL 濃度處理組酶活性比對照組下降了93.75%，說明菌株LB-16發(fā)酵產(chǎn)物能明顯抑制羧酸酯酶活性，降低線蟲正常代謝功能，影響其正常的生命活動。

3 討論

分離和篩選高效生防菌是進行南方根結(jié)線蟲生物防治的關(guān)鍵，本試驗從根結(jié)線蟲發(fā)病嚴重并逐漸轉(zhuǎn)輕的田塊中篩選出72株產(chǎn)芽孢的細菌，通過制備發(fā)酵濾液進行根結(jié)線蟲卵和二齡幼蟲的毒力試驗，篩選出4株毒力較強的細菌。用篩選出的4株細菌發(fā)酵濾液進行盆栽灌根試驗，最終篩選出毒力最強的菌株LB-16，經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化特征及基因檢測鑒定為和短短芽孢桿菌親緣關(guān)系接近的芽孢桿菌，研究結(jié)果豐富了南方根結(jié)線蟲的生防資源。

目前，枯草芽孢桿菌()和解淀粉芽孢桿菌在根結(jié)線蟲的防治中被廣泛應(yīng)用，短短芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌親緣關(guān)系較近，但短短芽孢桿菌在南方根結(jié)線蟲防治研究中卻鮮有報道。目前，對短短芽孢桿菌的研究主要集中在代謝產(chǎn)物抑菌性方面。王潔等以短短芽孢桿菌為研究對象，采用DEAE-52陰離子交換層析等方法對其產(chǎn)生的蛋白進行分離純化及鑒定，發(fā)現(xiàn)該蛋白的抑菌譜較廣可抑制常見的植物病害真菌。龔國利等從美國黃石國家公園篩選出1株耐高溫的短短芽孢桿菌，對其發(fā)酵產(chǎn)物進行初步研究，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)具有良好的抑菌活性。本研究篩選出的芽孢桿菌LB-16發(fā)酵濾液通過盆栽灌根對牛蒡根結(jié)線蟲病的防治效果達到73.61%，比市售阿維菌素防治效果高出5.14%，表現(xiàn)出較強的根結(jié)線蟲生防潛力，同時顯著增加了牛蒡的鮮質(zhì)量和株高。下一步將對菌株LB-16的發(fā)酵產(chǎn)物用于牛蒡大田中根結(jié)線蟲的防治進行研究，為開發(fā)該菌株的牛蒡生物有機肥提供理論及實踐依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，芽孢桿菌LB-16的發(fā)酵產(chǎn)物能夠顯著降低南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的乙酰膽堿酯酶、過氧化氫酶以及羧酸酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶活性的降低，能夠破壞根結(jié)線蟲的神經(jīng)傳遞，抑制了線蟲的活動能力。同時，乙酰膽堿酯酶是一些農(nóng)藥如有機磷類的靶標酶，羧酸酯酶是許多藥物的解毒酶，芽孢桿菌LB-16誘導(dǎo)的靶標酶和解毒酶與許多農(nóng)藥的靶標酶和代謝酶系是一致的，這與楊秀娟等研究的3種植物乙醇提取物對南方根結(jié)線蟲卵囊酯酶活性影響的研究結(jié)果一致。過氧化氫酶是根結(jié)線蟲體內(nèi)重要的抗氧化保護酶，所以芽孢桿菌LB-16的發(fā)酵產(chǎn)物能夠抑制抗氧化保護酶正常的酶促反應(yīng)，進而導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲活性降低甚至死亡。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌LB-16的發(fā)酵產(chǎn)物可以明顯降低根結(jié)線蟲二齡幼蟲體內(nèi)總糖和總蛋白含量。糖和蛋白質(zhì)是根結(jié)線蟲體內(nèi)維持生命的重要組成物質(zhì)和功能成分，糖類在根結(jié)線蟲體內(nèi)是重要的信息傳遞物質(zhì)，線蟲的化學(xué)感受器中含有大量的糖類，糖類含量的降低會影響線蟲的趨化性，而蛋白質(zhì)是線蟲身體的重要組成物質(zhì)及生命過程調(diào)控物質(zhì)，特別是線蟲體表角質(zhì)層的重要組成成分，增加了線蟲的抗逆性。因此，芽孢桿菌LB-16的發(fā)酵產(chǎn)物可能通過干擾根結(jié)線蟲糖和蛋白質(zhì)代謝進而殺死線蟲。接下來將把芽孢桿菌LB-16和其他根結(jié)線蟲生防菌配合使用，以提高對南方根結(jié)線蟲的防治效果，減少農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的破壞。

4 結(jié)論

本研究從牛蒡種植根結(jié)線蟲病高發(fā)田塊中分離篩選得到產(chǎn)芽孢的細菌，通過離體毒力測定和盆栽灌根試驗獲得高效生防菌株LB-16，利用形態(tài)學(xué)、生理生化特性及基因檢測方法將其鑒定為與短短芽孢桿菌()親緣關(guān)系較近的一種芽孢桿菌，并初步研究了菌株LB-16對南方根結(jié)線蟲的作用機制，結(jié)果表明，用菌株LB-16的發(fā)酵產(chǎn)物凍干粉溶液處理南方根結(jié)線蟲，隨著濃度的增加，明顯降低了線蟲體內(nèi)總糖和總蛋白含量，同時明顯降低了乙酰膽堿酯酶、過氧化氫酶和羧酸酯酶的活性，可以為牛蒡南方根結(jié)線蟲病的生物防治提供依據(jù)。