食品工業(yè)中混合菌生物被膜的形成、相互作用與新型控制策略

檀利軍，王敬敬,3，彭知云，李玉鋒，曾巧輝，趙 勇,*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.華南食品安全研究發(fā)展中心，廣東 佛山 528000；4.安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

在自然環(huán)境和食品工業(yè)中，大多數(shù)細(xì)菌主要是以生物被膜的形式存在。生物被膜是一種復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的細(xì)菌聚集體，包裹在自產(chǎn)的水合胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）中，包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等。由于生物被膜中細(xì)胞的生理變化與EPS介導(dǎo)的保護(hù)屏障，生物被膜對(duì)外界極端環(huán)境壓力的抵抗力比浮游態(tài)細(xì)菌高1 000 倍以上。此外，生物被膜能夠黏附在各種生物或非生物表面，從而給食品工業(yè)帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，生物被膜已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年花費(fèi)數(shù)10億 美元來(lái)解決生物被膜引起的食品污染、設(shè)備損壞和人類疾病等問(wèn)題。

事實(shí)上，包含多種細(xì)菌的混合菌生物被膜才是生物被膜的主導(dǎo)形式。然而，現(xiàn)階段大多數(shù)研究都集中在對(duì)單菌生物被膜的探索，這些研究并不能準(zhǔn)確反映生物被膜的真實(shí)情況。與單菌生物被膜相比，混合菌生物被膜中不同細(xì)菌之間具有更加復(fù)雜的相互作用，影響生物被膜的結(jié)構(gòu)、發(fā)展和功能。因此，明確混合菌生物被膜的形成與種間相互作用有利于制定防控生物被膜污染的新型策略，對(duì)保障食品安全與公眾健康具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究開(kāi)始聚焦混合菌生物被膜新型控制策略的開(kāi)發(fā)，這些新型策略是消除食品工業(yè)中有害菌污染、維護(hù)食品健康可持續(xù)發(fā)展的有力手段，然而卻缺少該方面的系統(tǒng)綜述。因此，本文首先概述了混合菌生物被膜的形成與相互作用，介紹了近年來(lái)食品工業(yè)中控制混合菌生物被膜污染的一些新型策略，最后對(duì)混合菌生物被膜防控在食品工業(yè)中的發(fā)展進(jìn)行了展望。旨在為食品工業(yè)中混合菌生物被膜的深入研究與制定有效的生物被膜新型控制策略提供新的見(jiàn)解和思路，以期更好地保障食品安全與公眾健康。

1 食品工業(yè)中混合菌生物被膜的形成

食品工業(yè)中的有害菌能夠在食品或食品接觸表面形成生物被膜，危害食品安全與公眾健康。例如，大腸桿菌O157:H7是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，可在蔬菜和莖葉表面形成生物被膜。Silagyi等還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7能在家禽、肉類和即食熟食表面形成生物被膜。此外，單增李斯特菌、副溶血性弧菌與沙門(mén)氏菌也是食品工業(yè)中常見(jiàn)病原菌，已被證明可以在三文魚(yú)、牡蠣和金槍魚(yú)等海產(chǎn)品表面形成生物被膜。另一方面，腐敗微生物引起的污染也是食品工業(yè)中面臨的重要挑戰(zhàn)。假單胞菌、希瓦氏菌與沙雷氏菌等優(yōu)勢(shì)腐敗菌極易在食品或食品接觸表面形成生物被膜。實(shí)際上，混合菌生物被膜才是有害菌在自然界和食品工業(yè)中的主要存在形式。因此，了解混合菌生物被膜的形成有利于闡明細(xì)菌生物被膜間的相互作用機(jī)制，從而更好地應(yīng)對(duì)其帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1.1 混合菌生物被膜的形成過(guò)程

混合菌生物被膜中緊密聚集在EPS內(nèi)多種細(xì)菌間存在復(fù)雜關(guān)聯(lián)，其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受到一系列物理、化學(xué)和生物過(guò)程的調(diào)控。與單菌生物被膜相比，混合菌生物被膜形成的機(jī)制與相互作用更為復(fù)雜，但其形成過(guò)程與單菌生物被膜基本相同，主要經(jīng)歷了3 個(gè)連續(xù)過(guò)程（圖1）：1）黏附階段；2）成熟階段；3）分散階段。

圖1 混合菌生物被膜的形成過(guò)程Fig. 1 Formation process of mixed-species biofilms

在第一個(gè)階段，浮游細(xì)胞在接觸表面附近移動(dòng)，通過(guò)物理作用力或細(xì)菌附著物（例如鞭毛或菌毛）黏附到接觸表面。表面特性、溫度和壓力等不同因素可極大地調(diào)節(jié)細(xì)菌的黏附過(guò)程。細(xì)菌黏附到接觸表面相關(guān)的作用力包括范德華力、空間相互作用和靜電相互作用等。如果接觸表面有利于細(xì)菌成熟發(fā)展便會(huì)由初級(jí)黏附階段轉(zhuǎn)變到次級(jí)黏附階段。當(dāng)吸引力大于排斥力時(shí)，一些可逆附著的細(xì)胞開(kāi)始保持固定并變得不可逆附著。據(jù)報(bào)道，鞭毛或菌毛等附著物克服細(xì)胞和表面間的雙重排斥力，鞏固了細(xì)菌與接觸表面之間的相互作用。當(dāng)細(xì)菌黏附在非極性疏水表面時(shí)，細(xì)胞表面疏水性在生物被膜形成的過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。這是因?yàn)榻佑|表面與細(xì)菌間的疏水相互作用降低了彼此間的排斥力?？傊谏锉荒ば纬砂l(fā)展的第一個(gè)階段，微生物細(xì)胞與接觸表面初步結(jié)合，然后通過(guò)相互作用力加強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞對(duì)接觸表面的黏附。

生物被膜形成過(guò)程的第二個(gè)階段是成熟階段。在這個(gè)階段，不同微生物細(xì)胞間通過(guò)產(chǎn)生自誘導(dǎo)信號(hào)分子進(jìn)行交流，從而啟動(dòng)生物被膜特異性相關(guān)基因的表達(dá)。此外，細(xì)菌開(kāi)始分泌EPS基質(zhì)來(lái)構(gòu)建生物被膜的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。EPS中的胞外多糖促進(jìn)細(xì)胞間的黏附和吸引，進(jìn)而形成致密的生物被膜屏障；胞外蛋白可以增強(qiáng)EPS框架的穩(wěn)定性；而胞外DNA則發(fā)揮著細(xì)胞之間形成復(fù)雜生物被膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵連接器與通訊媒介的重要功能。隨后，微菌落的大小與厚度不斷增加，進(jìn)而提供了生物被膜細(xì)胞內(nèi)部發(fā)展的空間與環(huán)境。簡(jiǎn)而言之，在這個(gè)階段，生物被膜通過(guò)操縱其結(jié)構(gòu)、生理和新陳代謝去適應(yīng)外部條件從而形成成熟生物被膜。

最后一個(gè)階段是生物被膜的分解。在這個(gè)階段，生物被膜細(xì)菌群落開(kāi)始產(chǎn)生多種裂解酶，這些酶靶向破壞EPS并降低其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從生物被膜內(nèi)部釋放的細(xì)菌重新轉(zhuǎn)變?yōu)楦∮螒B(tài)細(xì)胞。例如，熒光假單胞菌與銅綠假單胞菌釋放海藻酸鹽裂解酶；大腸桿菌釋放-乙酰肝素多糖裂解酶；馬鏈球菌產(chǎn)生用于分解生物被膜基質(zhì)的透明質(zhì)酸酶。細(xì)菌還可以通過(guò)上調(diào)鞭毛蛋白基因的表達(dá)，增強(qiáng)其自身的泳動(dòng)性，使得細(xì)菌有利于轉(zhuǎn)移到新的黏附位點(diǎn)。此外，生物被膜也可以通過(guò)物理機(jī)制主動(dòng)分離，例如脫落和侵蝕?？傊旌暇锉荒さ男纬墒且粋€(gè)復(fù)雜的連續(xù)過(guò)程，理解混合菌生物被膜的形成有助于探究混合菌生物被膜間的相互作用機(jī)制，進(jìn)而為開(kāi)發(fā)新型控制策略提供新的見(jiàn)解和思路。

1.2 混合菌生物被膜形成的影響因素

混合菌生物被膜的形成受到接觸表面的特性、食品基質(zhì)成分、外在環(huán)境條件與細(xì)菌自身特性等多種因素制約。接觸材料表面的特性包括疏水性、接觸角、粗糙度與靜電作用力等，這些參數(shù)往往共同作用并最終決定生物被膜的形成。然而，這些參數(shù)的具體影響在不同的實(shí)驗(yàn)條件下差異很大。例如，Guo Linxia等研究了副溶血性弧菌培養(yǎng)48 h后在不銹鋼、聚苯乙烯與玻璃上生物被膜的形成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物被膜的形成能力依次是玻璃＞聚苯乙烯＞不銹鋼。而Yan Jun等卻發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌在以上3 種黏附表面生物被膜的形成能力依次是聚苯乙烯＞不銹鋼＞玻璃。有研究表明細(xì)菌傾向于黏附在粗糙度更大的接觸表面，而有研究卻發(fā)現(xiàn)粗糙度與細(xì)菌附著之間并沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。同樣地，盡管一些研究證明親水性表面比疏水性表面更容易促進(jìn)細(xì)菌黏附，但一些測(cè)試疏水性效果的研究中卻得到完全相反的結(jié)果。此外，食品加工過(guò)程中最常見(jiàn)的接觸材料是304不銹鋼，因其具有較好的耐腐蝕、耐高溫、易于清潔且價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。然而，隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，不銹鋼表面容易出現(xiàn)裂縫或裂紋，反而成為細(xì)菌生物被膜的“庇護(hù)所”。實(shí)驗(yàn)結(jié)論的差異性可能是由于實(shí)驗(yàn)條件和細(xì)菌菌株的不同，也可能是多種因素共同制約的結(jié)果。

食品基質(zhì)也是影響生物被膜形成的關(guān)鍵因素之一。例如，鮭魚(yú)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，有利于微生物的生長(zhǎng)和繁殖，進(jìn)而促進(jìn)單增李斯特菌與熒光假單胞菌混合生物被膜在其表面定植。牛奶中的乳糖通過(guò)激活LuxS介導(dǎo)的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞間的黏附，進(jìn)而增強(qiáng)枯草芽孢桿菌生物被膜的形成。此外，牛奶中較高濃度的Ca與Mg也能促進(jìn)嗜熱菌屬生物被膜的形成。另一方面，不同食品基質(zhì)中形成混合菌生物被膜的微生物也有所差異。金黃色葡萄球菌也被稱作“嗜肉菌”，極易作為優(yōu)勢(shì)菌在高蛋白乳制品與肉制品表面形成混合菌生物被膜；單增李斯特菌與腐敗希瓦氏菌是冷鏈?zhǔn)称芳庸せ蛸A存過(guò)程中最常見(jiàn)的“嗜冷菌”，能夠在設(shè)備或冷藏食品表面形成生物被膜，黏附數(shù)月甚至長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，進(jìn)而導(dǎo)致交叉污染和食品腐敗變質(zhì)；果蔬加工中的主要污染源是由多種真菌和細(xì)菌形成的混合生物被膜。因此，食品基質(zhì)是探究混合菌生物被膜形成必不可少的影響因素。

外在環(huán)境條件包括溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)條件與氧氣等也在生物被膜的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Pang Xinyi等研究發(fā)現(xiàn)與4 ℃相比，15 ℃下單增李斯特菌與鮭魚(yú)表面土著菌形成的混合菌生物被膜更致密，另外該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)混合菌生物被膜在鮭魚(yú)汁中的形成能力顯著強(qiáng)于胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基。最近有研究探究了環(huán)境條件和營(yíng)養(yǎng)條件（pH值、溫度、營(yíng)養(yǎng)物）對(duì)單菌和混合菌生物被膜生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，混合菌生物被膜生長(zhǎng)的最佳pH值為7，酸性或堿性條件都會(huì)顯著抑制其生長(zhǎng)。此外，生物被膜最佳生長(zhǎng)溫度在25～35 ℃之間，營(yíng)養(yǎng)物濃度升高反而導(dǎo)致生物被膜形成減少。

細(xì)菌自身特性也是影響生物被膜形成的主要因素之一。不同種屬類型的細(xì)菌，甚至是同種細(xì)菌之間生物被膜的形成能力差異很大。因?yàn)椴煌⑸镏g具有菌株異質(zhì)性，例如細(xì)胞疏水性、細(xì)菌附屬物（菌毛與鞭毛）、細(xì)胞膜成分（脂多糖與蛋白質(zhì)）以及分泌EPS的能力。Liu Xing等發(fā)現(xiàn)與無(wú)鞭毛的硫還原地桿菌相比，有鞭毛的菌株能夠增加生物被膜內(nèi)的電子擴(kuò)散速率，進(jìn)而增強(qiáng)生物被膜的形成能力。Tan Lijun等研究了副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌單菌和雙菌生物被膜的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌具有更多的呼吸代謝系統(tǒng)，能夠產(chǎn)生大量的EPS進(jìn)而促進(jìn)生物被膜生物量的增加。不同血清型和基因型菌株之間生物被膜形成能力也具有顯著差異，這表明遺傳背景也是影響生物被膜形成的重要因素之一。此外，在混合菌生物被膜中，不同細(xì)菌群落間往往伴隨著復(fù)雜的相互作用，進(jìn)而影響彼此生物被膜的形成。總之，混合菌生物被膜的形成不是某種單一因素作用的結(jié)果，而是受到多種因素的共同調(diào)控。明確混合菌生物被膜形成的影響因素有助于從源頭陰斷生物被膜形成，從而降低其在食品工業(yè)中帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

2 混合菌生物被膜間的相互作用

混合菌生物被膜中不同微生物群落間往往伴隨著復(fù)雜強(qiáng)烈的相互作用，進(jìn)而影響生物被膜的結(jié)構(gòu)、發(fā)展和功能。這些相互作用可以是競(jìng)爭(zhēng)或者協(xié)同的。探究混合菌生物被膜間的相互作用有助于靶向制定更有效的抗菌策略來(lái)控制生物被膜的形成。

2.1 競(jìng)爭(zhēng)性相互作用

競(jìng)爭(zhēng)性相互作用是指混合菌生物被膜中不同的微生物群落對(duì)有限的養(yǎng)料、生存空間和重要的代謝分子（如螯合劑、表面黏附素、多糖、信號(hào)分子和消化酶）等公共資源進(jìn)行爭(zhēng)奪或者通過(guò)分泌抑制其他群落生長(zhǎng)的化合物的一種作用方式。在混合菌生物被膜中，一些細(xì)菌群落之間具有相同或相似的代謝需求，其中競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌通過(guò)積極消耗公共資源或產(chǎn)生抑菌物（細(xì)菌素、酶、過(guò)氧化氫和有機(jī)酸等）來(lái)降低其他菌株的適應(yīng)性。例如，Pang Xinyi等研究發(fā)現(xiàn)，新鮮鮭魚(yú)肉湯中的土著微生物與單增李斯特菌爭(zhēng)奪混合生物被膜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致單增李斯特菌的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。假交替單胞菌屬常是混合菌生物被膜中的優(yōu)勢(shì)競(jìng)爭(zhēng)者，因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生一種抗菌蛋白（AlpP）殺滅競(jìng)爭(zhēng)者中的敏感菌株。細(xì)菌黏附是另外一種競(jìng)爭(zhēng)方式，有利于細(xì)菌細(xì)胞與非黏附細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)。據(jù)報(bào)道，霍亂弧菌的EPS產(chǎn)生細(xì)胞具有高黏附性，在混合菌生物被膜中形成團(tuán)簇并強(qiáng)制去除非EPS產(chǎn)生細(xì)胞。運(yùn)動(dòng)性也是混合菌生物被膜中重要的競(jìng)爭(zhēng)手段，它通常可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)養(yǎng)分的利用率，幫助破壞其他細(xì)菌形成的生物被膜。許多細(xì)菌通過(guò)VI型分泌系統(tǒng)（T6SS）競(jìng)爭(zhēng)排除其他細(xì)菌群落。與單菌生物被膜相比，銅綠假單胞菌的T6SS和Psl胞外多糖在18 種菌株的生物被膜群落中被高度誘導(dǎo)，使其在混合菌生物被膜中比其他細(xì)菌更具有生長(zhǎng)和適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的另一個(gè)重要策略是通過(guò)快速占據(jù)可用的黏附位點(diǎn)來(lái)避免其他菌株的定植黏附，稱為“表面覆蓋”。Chen Ping等通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)對(duì)副溶血性弧菌與單增李斯特菌混合生物被膜的空間分布進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在混合生物被膜空間中單增李斯特菌位于副溶血性弧菌的下方，并占據(jù)了大部分的接觸表面，這導(dǎo)致副溶血性弧菌的生物量與代謝活力顯著下降。此外，銅綠假單胞菌迅速蔓延到接觸表面并通過(guò)聚集和運(yùn)動(dòng)來(lái)防止根癌農(nóng)桿菌的黏附，而銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)缺陷基因突變體則無(wú)法在混合菌生物被膜形成中排除根癌農(nóng)桿菌。

2.2 協(xié)同性相互作用

當(dāng)混合菌生物被膜體系中所有微生物群落因其他微生物存在而以某種方式受益時(shí)，細(xì)菌間的作用方式稱之為協(xié)同性相互作用（也稱共生性相互作用）。協(xié)同性相互作用在混合菌生物被膜中非常普遍，通常會(huì)導(dǎo)致生物被膜形成的增加。Tan Lijun等發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)，混合生物被膜的生物量、活菌數(shù)與細(xì)胞活力顯著高于單菌生物被膜。Chen Xiaoxue等也報(bào)道了在生肉加工環(huán)境中，金黃色葡萄球菌與產(chǎn)酸克雷伯菌雙菌生物被膜的形成能力較單菌顯著增強(qiáng)。甚至有一些細(xì)菌在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不會(huì)形成生物被膜，但與其他種類的細(xì)菌共培養(yǎng)后卻開(kāi)始形成生物被膜。混合菌生物被膜協(xié)同作用的一種方式是細(xì)菌群落共同抵抗外界極端環(huán)境壓力。Piccardi等通過(guò)使用數(shù)學(xué)模型等工具揭示了4 種細(xì)菌的混合生物被膜能夠降解金屬加工液、工業(yè)冷卻劑和潤(rùn)滑劑等有毒化合物的機(jī)制，認(rèn)為每種菌株的解毒作用促進(jìn)自身生存同時(shí)使其他菌株受益，從而協(xié)同促進(jìn)菌株彼此更好地生長(zhǎng)和降解有毒化合物。另一種協(xié)同作用方式是一種或幾種細(xì)菌分泌EPS基質(zhì)并被其他細(xì)菌群落積極利用。細(xì)菌生物被膜中的EPS提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和群落生存的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，是抵御外界環(huán)境刺激的庇護(hù)所。EPS賦予微生物群落間發(fā)生協(xié)同相互作用的基礎(chǔ)，包括物理（黏附力、機(jī)械穩(wěn)定性、保護(hù)性）、化學(xué)（pH值、氧氣、無(wú)機(jī)離子、代謝物、信號(hào)分子）和毒力特性（抵抗殺菌劑和增加致病力）。據(jù)報(bào)道，在銅綠假單胞菌與肺炎克雷伯菌形成的混合菌生物被膜中，通過(guò)分泌3 種胞外多糖（海藻酸鹽、Psl和Pel）增強(qiáng)整個(gè)群落對(duì)外界環(huán)境應(yīng)激的響應(yīng)能力。類似地，EPS中通過(guò)產(chǎn)生某些酶類（如-內(nèi)酰胺酶）或抗性質(zhì)?？梢员Ｗo(hù)整個(gè)混合菌生物被膜群落免受抗生素的侵害。此外，營(yíng)養(yǎng)代謝物的相互利用也是一種協(xié)同作用方式，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是混合菌生物被膜群落中一種或幾種細(xì)菌的代謝產(chǎn)物可以被其他細(xì)菌正向利用從而促進(jìn)生物被膜的生長(zhǎng)。Henson等在體外建立了多形擬桿菌、大腸桿菌與普拉梭菌3 種致病菌的混合生物被膜模型。乙酸鹽由大腸桿菌和多形擬桿菌產(chǎn)生并由普拉梭菌所利用；二氧化碳由多形擬桿菌和普拉梭菌產(chǎn)生并被大腸桿菌與普拉梭菌消耗；乙醇由大腸桿菌產(chǎn)生被多形擬桿菌所利用?；旌暇锉荒と郝溟g的代謝交叉利用成為了整個(gè)細(xì)菌群落間發(fā)生協(xié)同作用的驅(qū)動(dòng)力。總之，混合菌生物被膜間的相互作用受到多種因素的綜合影響，這些因素取決于微生物自身和環(huán)境，進(jìn)而影響著生物被膜的形成、結(jié)構(gòu)與功能。探究混合菌生物被膜相互作用機(jī)制，有助于靶向設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)新型抗菌策略，從而徹底根除混合菌生物被膜在食品工業(yè)中的污染。

3 混合菌生物被膜的新型控制策略

混合菌生物被膜是食品安全相關(guān)的一個(gè)重大問(wèn)題，因此廣大學(xué)者對(duì)減少混合菌生物被膜在食品工業(yè)環(huán)境中的污染進(jìn)行了廣泛的研究?？刂苹旌暇锉荒鹘y(tǒng)的方法主要是熱殺菌（高壓蒸汽滅菌、微波加熱等）與化學(xué)消毒（氯、過(guò)氧化氫、過(guò)氧乙酸和抗生素等）。然而熱殺菌或化學(xué)消毒具有很大的弊端：破壞或改變食品原有品質(zhì)、對(duì)食品加工設(shè)備有腐蝕作用、使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性以及化學(xué)殘留，容易對(duì)人體健康造成嚴(yán)重危害等。因此，開(kāi)發(fā)混合菌生物被膜新型控制策略顯得尤為重要。以下總結(jié)了一些近年來(lái)針對(duì)混合菌生物被膜的物理、化學(xué)和生物的綠色新型控制策略（圖2）。

圖2 混合菌生物被膜的新型控制策略Fig. 2 Novel control strategies for mixed-species biofilms

3.1 物理方法

3.1.1 光動(dòng)力技術(shù)

光動(dòng)力技術(shù)（photodynamic technology，PDT）是近年來(lái)從臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用到食品工業(yè)上的新興抗菌策略。在氧氣存在的條件下，光敏劑被特定波長(zhǎng)的光照射后其分子激發(fā)到高能量狀態(tài)，在返回基態(tài)的過(guò)程中與鄰近分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生高能量分子活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS能破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等大分子結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

本課題組近年來(lái)對(duì)PDT滅活多種食源性致病菌與腐敗菌進(jìn)行了廣泛深入的研究。目前已證明PDT對(duì)副溶血性弧菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、腐敗希瓦氏菌等多種有害菌的浮游菌和生物被膜均具有顯著的滅活效果。此外，多位研究者也證實(shí)了PDT清除混合菌生物被膜的高效性。例如，Banerjee等發(fā)現(xiàn)核黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合生物被膜有顯著抗菌作用。Tan Lijun等開(kāi)發(fā)了一種PDT耦合弱堿性電解水高效清除混合菌生物被膜的新技術(shù)，在150 μmol/L光敏劑和4.56 J/cm能量照射下，PDT結(jié)合弱堿性電解水使混合菌生物被膜的生物量、活菌數(shù)和細(xì)胞活力分別顯著降低72.4%、3.51（lg（CFU/mL））和85.7%，此外，還發(fā)現(xiàn)該技術(shù)同樣能高效清除食品（魚(yú)鱗）或食品接觸表面（不銹鋼）上形成的混合菌生物被膜。PDT優(yōu)良的抗生物被膜功效使得其在食品保鮮、食品包裝、水體消毒等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。此外，PDT還具有裝置簡(jiǎn)單、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，更重要的是這種非熱殺菌技術(shù)不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。然而，由于食品和食品加工環(huán)境的多樣性，PDT在實(shí)際應(yīng)用時(shí)其抗菌或保鮮功效可能會(huì)受到影響。因此，未來(lái)對(duì)PDT的研究應(yīng)該聚焦于開(kāi)發(fā)或篩選更加高效的新型光敏劑以及進(jìn)一步探究PDT對(duì)食品品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)特性的影響，以便于PDT在食品工業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用。

3.1.2 冷大氣等離子體

等離子體是自然界中物質(zhì)的4 種基本狀態(tài)之一，主要包括分子、中性原子、帶電粒子、亞穩(wěn)態(tài)自由基和光子等活性成分。冷大氣等離子體（cold atmospheric plasma，CAP）被認(rèn)為是一種快速、環(huán)保、節(jié)能和多功能的抗菌技術(shù)，其中的活性成分能協(xié)同滅活多種微生物并破壞生物被膜中的EPS基質(zhì)。近年來(lái)，CAP在食品工業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的研究。

CAP也已被證明是控制混合菌生物被膜的新型策略之一。Patange等表明，用高壓CAP處理非生物表面上單增李斯特菌和熒光假單胞菌混合生物被膜，僅120 s后便無(wú)法檢測(cè)到存活細(xì)菌；而處理生菜上的混合菌生物被膜需要更長(zhǎng)的時(shí)間，在封閉處理120 s后，單增李斯特菌與熒光假單胞菌數(shù)分別減少了2.2（lg（CFU/mL））與4.2（lg（CFU/mL））。Govaert等報(bào)道了CAP處理單增李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合生物被膜后，活菌數(shù)降低了1.5～2.5（lg（CFU/mL））。CAP目前在食品領(lǐng)域的應(yīng)用大多是在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)食品或食品接觸表面的抗菌研究，這主要與其過(guò)高的成本和對(duì)食品品質(zhì)容易產(chǎn)生不利的影響有關(guān)。因此，未來(lái)的研究應(yīng)不斷優(yōu)化CAP抗生物被膜的工藝與降低成本，這將有助于CAP在食品工業(yè)上的進(jìn)一步應(yīng)用。

3.1.3 抗生物被膜材料

食品接觸表面的性質(zhì)決定了食品加工環(huán)境中生物被膜的形成與陰力。因此，通過(guò)改變接觸表面的理化性質(zhì)或?qū)佑|表面進(jìn)行改性可以從源頭解決生物被膜形成的污染。抗生物被膜材料是指通過(guò)改變材料表面理化性質(zhì)或在表面涂層加入抗菌劑來(lái)抑制生物被膜生長(zhǎng)的一種新型功能性材料。

食品工業(yè)中常見(jiàn)的接觸材料包括食品加工器械/管道、食品包裝等。類金剛石碳涂層由于其高硬度、低摩擦、化學(xué)惰性、高耐磨性和防污性能，已成為食品工業(yè)中不銹鋼的替代品。有研究表明，類金剛石涂層對(duì)大腸桿菌與成團(tuán)泛菌混合生物被膜形成具有良好的抑制效果。此外，牛奶板式換熱器會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而形成污垢，同時(shí)也加速了細(xì)菌在表面的黏附，并最終導(dǎo)致生物被膜的形成。Jindal等比較了常規(guī)不銹鋼板式換熱器與改良表面的板式換熱器在牛奶殺菌過(guò)程中生物被膜的形成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良板式換熱器表面的生物被膜活菌顯著低于不銹鋼表面。生物表面活性劑在接觸表面可以改變其疏水性，進(jìn)而影響生物被膜的形成。例如，線性低密度聚乙烯中加入的聚((叔丁基氨基)-甲基-苯乙烯)后，不僅能完全抑制單增李斯特菌生物被膜的形成，還顯著延遲了金黃色葡萄球菌與大腸桿菌混合生物被膜的定植。抗生物被膜材料能夠從源頭降低混合菌生物被膜的污染，因此，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)安全、高效、價(jià)格低廉的抗生物被膜復(fù)合材料，以更好地應(yīng)用到食品加工器械/管道與食品包裝等領(lǐng)域。

3.2 化學(xué)方法

3.2.1 天然產(chǎn)物

許多植物來(lái)源的天然產(chǎn)物因?yàn)榫哂刑厥獾幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出一定的抗菌和抗生物被膜活性。天然產(chǎn)物的抗生物被膜作用主要依靠抑制細(xì)胞的黏附和附著、陰斷EPS的形成以及減少毒力因子的產(chǎn)生，從而陰斷QS網(wǎng)絡(luò)和生物被膜的發(fā)展。

這些天然產(chǎn)物包括精油、姜黃素、酚酸和多酚化合物等。精油是一種天然化合物，可替代消毒劑用于控制混合菌生物被膜。Kerekes等報(bào)道了馬郁蘭精油對(duì)多種食源性致病菌與腐敗菌混合生物被膜形成具有良好的抑制效果。同樣地，在低濃度香芹酚的持續(xù)影響下，金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌形成的混合生物被膜未能發(fā)展為成熟的生物被膜，并且在高濃度香芹酚下完全無(wú)法形成生物被膜。因?yàn)橄闱鄯幽芨蓴_細(xì)菌生物被膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP和鉀離子泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。值得注意的是，精油在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)揮發(fā)出強(qiáng)烈的氣味，并且在消毒后難以沖洗干凈。然而，有研究者報(bào)道了一種名為“Satureja thymbra”的精油水溶膠對(duì)致病菌與腐敗菌混合生物被膜具有良好的抗菌作用。這種精油水溶膠在使用后很容易清洗干凈并且沒(méi)有刺鼻的氣味。其他植物來(lái)源的天然產(chǎn)物也具有抗生物被膜的功效。例如，在酚酸（阿魏酸和水楊酸）存在的情況下，蠟樣芽孢桿菌和熒光假單胞菌雙菌生物被膜的復(fù)原力和對(duì)外界環(huán)境刺激的抵抗力會(huì)降低，這可能是由于酚酸干擾了混合菌生物被膜形成時(shí)的相互作用。以上研究結(jié)果表明，不同植物來(lái)源的天然產(chǎn)物對(duì)多種有害菌混合生物被膜具有顯著抑制作用?，F(xiàn)階段，從天然產(chǎn)物中提取有效抗菌成分作為食品防腐劑是各國(guó)的研究熱點(diǎn)。因此，未來(lái)的研究應(yīng)進(jìn)一步評(píng)估天然產(chǎn)物作為食品防腐劑的安全性以及開(kāi)發(fā)高效廉價(jià)的天然產(chǎn)物抗菌劑，旨在深入挖掘天然產(chǎn)物在食品工業(yè)中的真正潛力。

3.2.2 酸性電解水

電解水因成本低、對(duì)環(huán)境友好和應(yīng)用方便而被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。大量研究表明，酸性電解水（acid electrolyzed water，AEW）對(duì)多種有害菌生物被膜及混合菌生物被膜具有優(yōu)良的抑制活性。AEW殺菌的主要機(jī)制是低pH值、高氧化還原電位（oxidation-reduction potential，ORP）與有效氯的協(xié)同作用。低pH值使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡更容易受到有效氯的影響，導(dǎo)致更多的次氯酸分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞破壞內(nèi)部關(guān)鍵結(jié)構(gòu)；而高ORP的氧化作用會(huì)損傷細(xì)胞膜或改變細(xì)胞的正常電子流，從而造成細(xì)胞損傷或死亡。

有研究表明，AEW對(duì)熒光假單胞菌屬生物被膜具有高效的抗菌活性，此外還發(fā)現(xiàn)AEW增加了細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，降低了膜電位、細(xì)胞內(nèi)ATP濃度與pH值，同時(shí)也破壞了EPS基質(zhì)并最終清除生物被膜。Hu Haijing等發(fā)現(xiàn)AEW隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)不銹鋼上腸炎沙門(mén)氏菌與熒光假單胞菌混合生物被膜的殺菌效果逐漸增強(qiáng)。由于AEW抗菌的高效性和自身特殊的性質(zhì)，使得其在食品工業(yè)中常被用于食品加工設(shè)備表面消毒與果蔬保鮮，包括抑制有害菌的生長(zhǎng)、維持營(yíng)養(yǎng)或化合物生物活性和去除農(nóng)藥殘留。然而，AEW因其低pH值與高有效氯濃度容易改變食品原有品質(zhì)。因此，降低AEW對(duì)食品品質(zhì)的影響以及推廣大型AEW生產(chǎn)設(shè)備的普及有利于擴(kuò)大其在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

3.3 生物方法

3.3.1 抗生物被膜酶

生物被膜的本質(zhì)是由EPS包裹的微生物聚集體，因此使用生物方法對(duì)抗生物被膜是一種“以子之矛，攻子之盾”的最佳策略之一。EPS基質(zhì)為嵌入生物被膜的細(xì)菌提供了“保護(hù)傘”，而使用抗生物被膜酶這種綠色抗菌劑可有效破壞EPS中的多糖、蛋白、脂質(zhì)和核酸，從而靶向根除生物被膜?？股锉荒っ付嗯c殺菌劑相結(jié)合，能夠瓦解EPS網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)消毒劑與抗菌劑的滲透，中斷控制生物被膜形成和維持的細(xì)胞間通訊信號(hào)，也有助于減少化學(xué)試劑的使用、水消耗和能源成本。

目前用于去除生物被膜的酶主要包括蛋白水解酶、多糖降解酶、氧化還原酶和抗QS酶4 大類。蛋白水解酶主要用于水解EPS基質(zhì)中的各種蛋白質(zhì)或使細(xì)菌黏附在接觸面的一些黏附蛋白；多糖降解酶包括溶菌酶、纖維素酶和淀粉酶等，主要降解生物被膜中的多糖結(jié)構(gòu)；氧化還原酶可以靶向攻擊EPS中的eDNA，陰礙生物被膜的形成、成熟、擴(kuò)散以及細(xì)胞間的連接；抗QS酶通過(guò)中斷生物被膜內(nèi)細(xì)胞間通訊，導(dǎo)致細(xì)胞群落代謝紊亂。由于酶特異性以及生物被膜基質(zhì)的復(fù)雜性，因此往往需要多種酶聯(lián)合使用才能高效去除混合菌生物被膜。然而，現(xiàn)階段抗生物被膜酶的高成本和低商業(yè)普及性限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用。此外，食品工業(yè)中環(huán)境的復(fù)雜性，如溫度、pH值、食物殘?jiān)?、加工表面多樣性也是影響酶發(fā)揮功效的關(guān)鍵因素?？股锉荒っ甘且环N富有前景但又充滿挑戰(zhàn)的綠色新型抗菌策略，未來(lái)研究應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，并繼續(xù)深入探究其對(duì)生物被膜的作用機(jī)制及其與其他抗菌手段的協(xié)同抗菌作用，如結(jié)合光熱催化反應(yīng)、納米催化和金屬離子等協(xié)同抗菌策略，進(jìn)而提高抗菌效力和特異性。

3.3.2 QS抑制劑

QS通過(guò)介導(dǎo)生物被膜細(xì)胞間的通訊，是調(diào)控生物被膜形成的重要因素。而QS抑制劑是中斷/陰礙QS系統(tǒng)的一類物質(zhì)，主要包括降解自誘導(dǎo)物的酶（如內(nèi)脂酶、酰胺酶、細(xì)胞色素氧化酶等）、一些天然化合物（如吲哚類及其衍生物、黃酮類、生物堿、有機(jī)硫化物等）與QS合成類似物（酰基-高絲氨酸內(nèi)酯類似物）。

例如，已發(fā)現(xiàn)香蘭素（一種從植物中提取的天然化合物）是一種很有前景的QS抑制劑。在質(zhì)量濃度0.05、0.15 mg/mL和0.30 mg/mL香蘭素存在的條件下培養(yǎng)24 h后，混合菌生物被膜的生物量分別減少9%、25%和52%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，香蘭素能夠顯著減少生物被膜中胞外多糖（17%）和胞外蛋白（28%）的產(chǎn)生。類似地，抗菌肽LL-37能夠使銅綠假單胞菌中QS失調(diào)，并抑制金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合生物被膜形成。現(xiàn)階段，QS抑制劑主要應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控、食品保藏（如肉制品和果蔬制品）等。然而，QS抑制劑較強(qiáng)的特異性以及過(guò)高的成本導(dǎo)致其普適性和應(yīng)用性降低。此外，混合菌生物被膜內(nèi)部不同細(xì)菌之間的QS信號(hào)十分復(fù)雜，對(duì)QS抑制劑發(fā)揮作用產(chǎn)生很大的干擾。因此，未來(lái)需要進(jìn)一步解析QS互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，并開(kāi)發(fā)新型高效的QS抑制劑，尤其是天然產(chǎn)物QS抑制劑，從而為靶向設(shè)計(jì)新型抗菌劑提供新的途徑。

3.3.3 噬菌體

噬菌體是一種在自然環(huán)境中存在的病毒，只感染細(xì)菌而不會(huì)對(duì)食品或人體等造成風(fēng)險(xiǎn)，是名副其實(shí)的細(xì)菌“捕食者”。噬菌體能夠攻擊生物被膜中的細(xì)菌，可以和宿主共存，將遺傳物質(zhì)整合到細(xì)菌基因組中，隨后噬菌體在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制，并最終裂解細(xì)菌并釋放出能夠感染更多細(xì)菌的噬菌體。因此，噬菌體是一種天然、高特異性和無(wú)毒的混合菌生物被膜新型控制策略。

當(dāng)噬菌體與生物被膜接觸時(shí)，會(huì)進(jìn)一步發(fā)生相互作用，結(jié)果取決于生物被膜細(xì)胞對(duì)噬菌體的敏感性和受體位點(diǎn)的可及性，因?yàn)橹旅艿腅PS屏障可能會(huì)隱藏這些受體位點(diǎn)。然而一些噬菌體能編碼EPS基質(zhì)降解酶，使其自身能夠滲透進(jìn)入生物被膜進(jìn)而與內(nèi)部細(xì)菌細(xì)胞相結(jié)合，并最終裂解細(xì)菌。一般情況下，多種噬菌體聯(lián)合使用往往顯示出更好地控制效果。Montso等評(píng)估了牛肉上多重耐藥的大腸桿菌生物被膜分別對(duì)8 種噬菌體和6 種噬菌體混合物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單個(gè)噬菌體和噬菌體混合物均能抑制大腸桿菌生物被膜的形成，噬菌體混合物則顯示出更高的抑制效率。目前噬菌體在食品工業(yè)中的具體應(yīng)用主要有鮮切食品的保鮮、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害防控治療、畜禽產(chǎn)品的抑菌等。然而噬菌體控制混合菌生物被膜也會(huì)存在一定的局限性，因?yàn)槭删w具有高度的特異性，在使用前往往需要對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行鑒定。因此，需使用噬菌體混合物、工程噬菌體、酶類以及其他抗菌劑組合來(lái)克服這一障礙。此外，噬菌體控制生物被膜的效率容易受到外界環(huán)境因素（溫度、生長(zhǎng)階段與噬菌體濃度等）的影響。總而言之，噬菌體抗菌技術(shù)將會(huì)是今后食品工業(yè)中防控混合菌生物被膜污染的重要手段之一，未來(lái)的研究需要進(jìn)一步明確噬菌體在不同食品加工環(huán)境中與病原菌的相互作用、抗性等問(wèn)題，以此來(lái)提高噬菌體抗菌的應(yīng)用效率。此外，闡明混合菌生物被膜如何影響噬菌體敏感性相關(guān)成分有助于提高其有效性和安全性。

4 結(jié) 語(yǔ)

混合菌生物被膜是食品工業(yè)中最常見(jiàn)的污染形式，然而現(xiàn)階段絕大多數(shù)研究都是基于單菌生物被膜。由于混合菌生物被膜形成的結(jié)構(gòu)與彼此間的相互作用極其復(fù)雜，因此，探究混合菌生物被膜形成和相互作用有利于更好地靶向制定生物被膜污染的防控策略。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始聚焦于發(fā)展控制混合菌生物被膜的新策略以期應(yīng)對(duì)其帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而促進(jìn)食品安全可持續(xù)發(fā)展。本文基于食品工業(yè)中混合菌生物被膜的研究現(xiàn)狀，對(duì)未來(lái)混合菌生物被膜的研究方向提出以下幾點(diǎn)展望，旨在為制定混合菌生物被膜新型控制策略、徹底消除食品工業(yè)中混合菌生物被膜的污染提供新的見(jiàn)解和思路，從而更好地保障食品安全與公眾健康。

4.1 進(jìn)一步揭示混合菌生物被膜間的相互作用

現(xiàn)階段對(duì)混合菌生物被膜相互作用的理解仍非常有限，進(jìn)一步解析混合菌生物被膜群落間的相互作用對(duì)在食品工業(yè)中制定有效的生物被膜污染防控策略至關(guān)重要。因此，需要進(jìn)一步了解混合菌生物被膜在食品及食品接觸表面的持久性、開(kāi)發(fā)檢測(cè)混合菌生物被膜的新方法或工具來(lái)揭示混合菌生物被膜間的相互作用，從而建立更加高效的新型控制策略。

4.2 聯(lián)合多種新型控制策略根除混合菌生物被膜

雖然目前已有有效的混合菌生物被膜新型控制策略，但仍然無(wú)法徹底解決混合菌生物被膜在食品工業(yè)中的污染問(wèn)題。因此，聯(lián)合兩種或兩種以上的方法來(lái)控制混合菌生物被膜的污染往往更加高效，不同的抗菌策略相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，進(jìn)而發(fā)揮協(xié)同抗菌的功效。

4.3 推動(dòng)混合菌生物被膜新型控制策略在食品工業(yè)中的應(yīng)用

上述控制策略在實(shí)驗(yàn)室條件下都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。然而，食品工業(yè)中生物被膜的真實(shí)情況往往比實(shí)驗(yàn)室研究復(fù)雜得多，這些新興的控制策略可能在食品工業(yè)中應(yīng)用時(shí)會(huì)遭遇陰礙。首先，必須保證這些混合菌生物被膜新型控制策略是安全的；其次，必須保證這些方法與技術(shù)不會(huì)明顯改變或破壞食品原有的品質(zhì)；最后，必須保證它們?cè)谑称饭I(yè)中的應(yīng)用性，包括可接受的成本、在各種食品加工環(huán)境下的可操作性等。推動(dòng)混合菌生物被膜新型控制策略在食品工業(yè)中的應(yīng)用應(yīng)從以上3 個(gè)方面努力實(shí)現(xiàn)，從而提高食品質(zhì)量與安全，并最終保障公眾健康。