枸杞多糖抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞活化作用機(jī)制

馬治華，牛丕蓮，許惺博，張自萍，周學(xué)章，白明生,*

（1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.哥廷根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，德國 哥廷根 37075）

心血管疾病是非傳染性疾病中首要威脅人類健康的疾病，對(duì)個(gè)人和社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)日益加重，有效防治心血管疾病是一個(gè)亟待解決的問題。心肌纖維化是各種心血管疾病發(fā)展至后期的共同病理特征，其主要特征是心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）的分化和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）聚積。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）在纖維化和心肌重構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用。TGF-β1介導(dǎo)ECM的產(chǎn)生過程，可誘導(dǎo)CFs分化并促進(jìn)膠原蛋白合成。因此有效抑制心肌纖維化可延緩心血管疾病后續(xù)的發(fā)生發(fā)展，有利于心血管患者的預(yù)后改善，為治療心血管疾病提供新方法。

近年來大量研究表明，中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，對(duì)心肌纖維化的預(yù)防治療有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，許多中藥復(fù)方、單味藥及其提取物對(duì)其均有顯著的防治作用。丹參酮IIA可通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)心肌纖維化；黃連素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖以及膠原蛋白合成；四逆湯是一種中藥復(fù)方，可干預(yù)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，從而抑制心肌纖維化。

寧夏枸杞是我國傳統(tǒng)的藥食兼用名貴中藥材。枸杞果實(shí)中的活性成分有很多，包括枸杞多糖、黃酮、類胡蘿卜素、酚酸、甜菜堿、維生素等。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖是枸杞提取物中最主要的功能成分，枸杞多糖具有降血糖、降血壓、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物學(xué)功能。然而，枸杞多糖對(duì)心肌纖維化影響的研究鮮有報(bào)道，本研究利用TGF-β1體外刺激小鼠CFs，建立心肌纖維化細(xì)胞模型，探究寧夏枸杞多糖對(duì)心肌纖維化的干預(yù)作用，為枸杞多糖在心血管類疾病的臨床治療中提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)C57BL/6新生小鼠，1～3 日齡，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（寧）2020-0001）。

枸杞多糖（純度≥96%） 寧夏沃福百瑞公司。

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Gibco公司；TGF-β1 美國Peprotech公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（鼠來源）、一抗Vimentin（兔來源） 賽信通（上海）生物試劑有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TritonX-100 生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A.Total RNA Kit I 美國Omega公司；HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR、ChamQTM SYBRqPCR Master Mix試劑盒美國Vazyme公司；膠原蛋白I（collagen I，Col I）、膠原蛋白III（collagen III，Col III）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒北京麗科生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MDF-382E（N）超低溫冰箱 上海申力科技有限公司；Trans-Blot SD Cell酶標(biāo)儀、TC20細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀美國Bio-Rad公司；E5311化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 美國GE公司；W211電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Power pac HV電泳儀 北京凱元信瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 C57BL/6小鼠CFs原代分離培養(yǎng)

參考劉夢(mèng)昕等的方法分離培養(yǎng)原代CFs。用乙醚將C57BL/6新生小鼠麻醉后，在無菌條件下，用無菌剪刀和鑷子取心尖部位，快速置于含雙抗的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2～7.6）洗3 遍。剔除結(jié)締組織，將心臟剪碎，加入適量胰酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中，分次消化，每次5 min，共消化8～10 次。取上清液，并加入等量含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F12培養(yǎng)基，混勻。過濾混合液，1 000 r/min離心5 min，收集沉淀于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)90 min左右后，將未貼壁的細(xì)胞懸液吸出，此時(shí)已貼壁的細(xì)胞即為CFs，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后更換含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液，觀察CFs的生長(zhǎng)情況。

1.3.2 CFs鑒定

采用免疫組化染色檢測(cè)纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin進(jìn)行CFs鑒定。在無菌的12 孔板中爬片，待細(xì)胞貼片30 min左右，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，放于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出，PBS漂洗，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定20 min后用PBS再次漂洗，體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100處理15 min，PBS漂洗，體積分?jǐn)?shù)3% HO處理15 min，PBS漂洗。室溫封閉60 min，取出甩干，一抗4 ℃過夜孵育，PBS洗3 次，二抗孵育60 min，PBS清洗，辣根過氧化物酶DAB顯色1～10 min，蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染，自來水洗返藍(lán)。體積分?jǐn)?shù)75%、85%、95%乙醇溶液和無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明2 次，中性樹膠封片。免疫組化染色為棕黃色，結(jié)果為陽性，即為CFs。

1.3.3 細(xì)胞分組處理

取培養(yǎng)的CFs，每孔5×10個(gè)接種到6 孔板，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)分為3 組：對(duì)照組（完全培養(yǎng)基）、模型組（質(zhì)量濃度10 ng/mL TGF-β1）、枸杞多糖組（質(zhì)量濃度10 ng/mL TGF-β1+質(zhì)量濃度100 ng/mL寧夏枸杞多糖）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 CFs形態(tài)及增殖情況觀察

CFs細(xì)胞分組處理培養(yǎng)4 d后，置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)和數(shù)目，并進(jìn)行拍照記錄。

1.3.5 免疫熒光法檢測(cè)α-SMA表達(dá)

待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右，以每孔1×10個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，分組培養(yǎng)48 h后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，取出玻片、固定，然后用100 μL 0.5% TritonX-100通透15 min，體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉60 min，棄舊液，采用α-SMA一抗（（一抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶500）37 ℃孵育2 h，熒光二抗（（二抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶500）避光孵育1 h，PBS清洗，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，觀察綠色熒光強(qiáng)度。

1.3.6 膠原蛋白I和膠原蛋白III表達(dá)水平檢測(cè)

CFs分組培養(yǎng)48 h后，收集上清液，3 000 r/min離心20 min，收集上清液。按試劑盒說明書要求采用ELISA法檢測(cè)Col I、Col III表達(dá)量。

1.3.7 Western blot測(cè)定TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化水平

采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取并用BCA法對(duì)蛋白濃度定量，調(diào)整所有蛋白質(zhì)量濃度為3 μg/μL，沸水煮10 min至變性。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，之后分別放于一抗actin、Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4（抗體稀釋比例為（一抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶1 500），于4 ℃冰箱過夜孵育過夜，用1×TBST洗6 次（5 min/次），加入相應(yīng)二抗（抗兔或抗小鼠，（二抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶10 000）在室溫孵育1 h，1×TBST洗6 次（5 min/次）。用發(fā)光液A、B等體積混合，用ECL化學(xué)發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中顯影，最后用Image J軟件對(duì)蛋白條帶相對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

1.3.8 纖維化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、和的mRNA表達(dá)水平測(cè)定

收集各組細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別將cDNA、、和及基因引物加至實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）Mix反應(yīng)體系中，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列參考Song Shuai和戚曉琳等方法，序列如下：：F：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，R：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’；引物序列：F：5’-GGGCTCTGAAGATGCACAT，R：5’-TGGCTTCTCACCAGTGTGGG-3’；引物序列：F：5’-CGCCTCCAAGAAGCCCAA-3’，R：5’-CTGGGTAAAGGAGAGTGGAGTGG-3’；引物序列：F：5’-TGATAGAAGTCTGAACACTCGTTTG-3’，R：5’-GGCTGATTGGCAAGACCTCT-3’；引物序列：F：5’-CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC-3’，R：5’-CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGG-3’。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用GraphPad Prism5軟件用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠CFs鑒定結(jié)果

波形蛋白Vimentin為纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白，為鑒定分離所得細(xì)胞是否為小鼠CFs，采用免疫組化檢測(cè)Vimentin。如圖1所示，分離所得細(xì)胞的免疫組化染色為棕黃色，結(jié)果為陽性，符合CFs特征，表明分離所得細(xì)胞為小鼠CFs，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 小鼠原代CFs免疫組化鑒定結(jié)果Fig. 1 Results of immunohistochemical identification of mouse primary CFs

2.2 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)CFs形態(tài)的影響

如圖2所示，TGF-β1誘導(dǎo)后，CFs由梭形、不規(guī)則多邊形變得細(xì)長(zhǎng)、狹長(zhǎng)，枸杞多糖干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，表明枸杞多糖可使TGF-β1誘導(dǎo)的CFs形態(tài)變化有所改變。

圖2 形態(tài)學(xué)觀察枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)CFs的影響Fig. 2 Microscopic observation of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on TGF-β1-induced CFs

2.3 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs中α-SMA表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞中α-SMA綠色熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)，而枸杞多糖組相較于模型組，α-SMA綠色熒光表達(dá)明顯減弱。Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫熒光檢測(cè)結(jié)果一致。如圖4所示，與對(duì)照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞中α-SMA表達(dá)水平高度顯著上調(diào)（＜0.001），枸杞多糖干預(yù)后，α-SMA蛋白表達(dá)水平較模型組高度顯著下調(diào)（＜0.001）。結(jié)果表明在蛋白水平，枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)有抑制作用。

圖3 免疫熒光檢測(cè)枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs中α-SMA表達(dá)的影響（400×）Fig. 3 Immunofluorescence detection of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs induced by TGF-β1 (400 ×)

圖4 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs α-SMA表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs treated with TGF-β1

2.4 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs中Col I、Col III蛋白表達(dá)的影響

如圖5顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中Col I、Col III蛋白質(zhì)量濃度高度顯著增加（＜0.001），枸杞多糖干預(yù)后，Col I、Col III蛋白質(zhì)量濃度均較模型組高度顯著減少（＜0.001），表明枸杞多糖可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Col I和Col III蛋白表達(dá)增加。

圖5 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs Col I、Col III蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of Col I and Col III in CFs treated with TGF-β1

2.5 枸杞多糖對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量均高度顯著上調(diào)（＜0.001），枸杞多糖組相較模型組，相關(guān)蛋白表達(dá)均呈高度顯著下調(diào)（＜0.001）。上述結(jié)果表明，TGF-β1成功激活TGF-β1/Smads信號(hào)通路，枸杞多糖可通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活進(jìn)而改善心肌纖維化。

圖6 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化的影響Fig. 6 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of TGF-β1/Smads signaling pathway-related proteins in CFs treated with TGF-β1

2.6 枸杞多糖對(duì)纖維化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail 1、Snail 2、Twist和S100A4 mRNA表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組中/、和的mRNA相對(duì)表達(dá)量高度顯著增高（＜0.001）；與模型組比較，枸杞多糖組的/、和的mRNA相對(duì)表達(dá)量高度顯著下降（＜0.001）。表明枸杞多糖可改善心肌纖維化，與下調(diào)纖維化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子/、和表達(dá)有關(guān)。

圖7 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs中Twist、S100A4、Snail 1/2 mRNA表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the mRNA expression of Twist, S100A4, Snail 1/2 in CFs treated with TGF-β1

3 討 論

心臟組織受損時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)修復(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制——心室重塑。心室重塑過程中形成的瘢痕可替代死亡的心肌細(xì)胞，從而起到修復(fù)受損心臟的作用，但當(dāng)心臟持續(xù)發(fā)生心室重塑就會(huì)造成心肌纖維化。心肌纖維化發(fā)生時(shí)，CFs被活化，活化的CFs過度分泌ECM，ECM主要包括膠原蛋白和α-SMA等。研究表明，心肌纖維化是一個(gè)很復(fù)雜的病理過程，與許多因素相關(guān)。TGF-β1作為重要的促心肌纖維化生物因子之一，可以活化CFs。

寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)為藥材枸杞子，其味甘、性平，歸肝、腎經(jīng)，有滋肝補(bǔ)腎、益精明目之功效，為茄科枸杞屬的一種多分枝小灌木。《中華人民共和國藥典》記載，寧夏枸杞成熟果實(shí)具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效，可用于治療虛勞精虧、眩暈耳鳴、陽萎遺精、內(nèi)熱消渴、目昏不明等病癥。枸杞子中具有多種活性成分，如枸杞多糖、黃酮類化合物、生物堿、氨基酸等。研究表明，枸杞子中最具有提取利用價(jià)值的是枸杞多糖。本實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1刺激CFs后，細(xì)胞形態(tài)顯著變化，細(xì)胞數(shù)目增多且α-SMA的熒光表達(dá)顯著增強(qiáng)，Col I、Col III和α-SMA蛋白的表達(dá)上調(diào)；但加入寧夏枸杞多糖處理細(xì)胞后，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象起到抑制作用，表明寧夏枸杞多糖可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFs活化。TGF-β1也可誘導(dǎo)特異性轉(zhuǎn)錄因子如、和的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)纖維化的發(fā)生。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子、和在纖維化發(fā)生中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用TGF-β1刺激后，、和的mRNA表達(dá)增加；給予寧夏枸杞多糖處理細(xì)胞后，、和的mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)。這表明寧夏枸杞多糖可有效抑制纖維化轉(zhuǎn)錄因子、和的mRNA表達(dá)。

TGF-β1是TGF-β1/Smads信號(hào)通路中關(guān)鍵因子。TGF-β1與其受體特異性結(jié)合，進(jìn)而激活下游的Smads蛋白家族，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。Smads蛋白家族與TGF-β1相互協(xié)調(diào)作用促使心肌纖維化。為進(jìn)一步探究枸杞多糖如何改善心肌纖維化的發(fā)生，對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1可成功激活TGF-β1/Smads信號(hào)通路，使Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達(dá)增多，枸杞多糖干預(yù)后，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，表明枸杞多糖可能通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活，進(jìn)而減緩心肌纖維化的發(fā)生，改善心肌纖維化程度。

綜上所述，寧夏枸杞多糖可有效抑制TGF-β1刺激的CFs活化，降低纖維化轉(zhuǎn)錄因子、、的mRNA表達(dá)，從而促使心肌纖維化Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和Smad4蛋白表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枸杞多糖可通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活，發(fā)揮改善心肌纖維化的作用。