小麥肽改善慢性疲勞綜合征大鼠認(rèn)知功能障礙

劉 輝，周安妮，胡勝男，陳 寧，秦 智，賈紹輝,*

（1.武漢體育學(xué)院健康科學(xué)學(xué)院，運動訓(xùn)練監(jiān)控湖北省重點實驗室，天久運動營養(yǎng)食品研發(fā)中心，湖北 武漢 430079；2.武漢體育學(xué)院研究生院，湖北 武漢 430079）

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一種至少持續(xù)6 個月，以嚴(yán)重身體和腦疲勞為主要表現(xiàn)的綜合征候群，常伴隨睡眠障礙、短期記憶力減退、注意力下降、頭痛、關(guān)節(jié)痛等癥狀。與一般性疲勞有所區(qū)別的是，充分休息并不能很好緩解CFS患者的臨床癥狀，且目前尚無針性的CFS標(biāo)準(zhǔn)治療方法，常用治療手段主要包括增強免疫能力的藥物治療，營養(yǎng)平衡療法，改善認(rèn)知行為的治療、局部物理治療以及分級運動療法等。已有研究表明CFS患者普遍存在認(rèn)知功能障礙，因此靶向改善認(rèn)知功能障礙的治療方法被認(rèn)為有助于緩解CFS癥狀。

最近的研究結(jié)果提示合適的營養(yǎng)補充可能是CFS的有效干預(yù)手段。小麥肽是利用現(xiàn)代酶解技術(shù)酶解小麥蛋白而獲得的一種小分子混合肽，諸多研究證實小麥肽具有良好抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及促進損傷恢復(fù)等多種生物學(xué)功能。此外，氧化應(yīng)激的增加和免疫功能低下是誘導(dǎo)CFS發(fā)病的兩大重要原因，據(jù)此推測小麥肽可能具有緩解CFS臨床癥狀的功效。鑒于認(rèn)知功能障礙是CFS患者常見的臨床表現(xiàn)，本實驗通過構(gòu)建CFS大鼠模型，分別口服給予低、中、高劑量小麥肽進行干預(yù)，考察小麥肽對CFS模型大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥肽由山東中食都慶生物技術(shù)有限公司制備并提供。

70 只健康雄性SD大鼠購自湖北省三峽大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2011-0012，體質(zhì)量180～220 g。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 北京索萊寶生物技術(shù)公司；色氨酸、5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotropic factor，BDNF）以及神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）、IL-10、腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor β，TNF-β）以及干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LA8900氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；Morris水迷宮（ZS-Morris） 北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥肽分子質(zhì)量和氨基酸組成測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）測定小麥肽分子質(zhì)量，采用氨基酸分析儀測定小麥肽氨基酸組成，每種氨基酸含量表示為其在總氨基酸含量中的占比。

1.3.2 實驗動物及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機選擇10 只大鼠作為正常對照組（N），其余實驗大鼠進行CFS造模。造模成功后，將模型大鼠隨機分為模型對照組（M）、低劑量小麥肽組（M+L）、中劑量小麥肽組（M+M）以及高劑量小麥肽組（M+H），每組10 只。M+L、M+M以及M+H組實驗大鼠分別灌胃給予0.2、0.4、0.8 g/（kg·d）小麥肽，N組與M組大鼠灌胃同等劑量的生理鹽水，每天1 次，共8 周。干預(yù)結(jié)束后，水迷宮實驗用于評估大鼠認(rèn)知功能；水迷宮實驗結(jié)束后，處死大鼠取外周血，4 ℃、3 000 r/min離心5 min收集血清，采用ELISA法試劑盒檢測色氨酸、NGF、BDNF、IL-4、IL-10、TNF-β以及IFN-γ濃度，同時收集實驗大鼠新鮮海馬組織用于測定SOD活力、MDA和5-HT含量。

1.3.3 CFS模型大鼠構(gòu)建

采用慢性束縛結(jié)合冷水力竭游泳的方式構(gòu)建CFS大鼠模型。將實驗大鼠放入圓柱形塑料筒（筒長18 cm、直徑7 cm，前端有一內(nèi)徑為1.5 cm漏斗樣通氣口）中進行束縛以限制其活動，束縛時間30 min，然后將大鼠轉(zhuǎn)移至游泳缸內(nèi)進行游泳干預(yù)至力竭，力竭判斷以頭部沉入水中3 s不浮出水面為標(biāo)準(zhǔn)，水溫維持18～22 ℃。每天進行1 次上述干預(yù)，實驗大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量明顯減輕、毛發(fā)稀疏泛黃、背部皮膚松弛、大便干結(jié)或稀溏、精神萎靡不振、活動減少以及食欲下降等現(xiàn)象時，認(rèn)定模型構(gòu)建成功。

1.3.4 認(rèn)知功能評估

采用Morris迷宮評估實驗大鼠認(rèn)知功能。干預(yù)結(jié)束前6 d進行適應(yīng)性訓(xùn)練，訓(xùn)練前先在水池壁標(biāo)記4 個入水點，將水池劃分為4 個象限。然后分別進行定位航行實驗和空間探索實驗。

定位航行實驗：實驗前1 d，讓大鼠在水池內(nèi)自由游泳120 s以熟悉環(huán)境，實驗開始后每天進行5 次訓(xùn)練，依次從4 個象限入水點處面向池壁將大鼠放入池中，記錄大鼠爬上平臺所用時間，即逃避潛伏期，如果大鼠在120 s內(nèi)未能爬上平臺，則將其引導(dǎo)至平臺，并將逃避潛伏期記錄為120 s，2 次訓(xùn)練之間休息60 s，共訓(xùn)練5 d。

空間探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后，將平臺撤除，從第Ⅲ象限入水點處將大鼠放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠穿越平臺位置的次數(shù)以及在平臺象限逗留的時間。

1.3.5 海馬組織SOD活力和MDA含量檢測

取實驗大鼠海馬組織40 mg，加入細胞裂解液1 mL、蛋白酶抑制劑PMSF 1 μg，4 ℃下采用組織勻漿機勻漿5 min，然后冰浴超聲2 min。處理完畢后樣品于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用相應(yīng)試劑盒測定海馬組織中SOD活力和MDA含量。

1.3.6 炎性因子與神經(jīng)細胞因子水平檢測

取1.3.2節(jié)收集的實驗大鼠血清，采用ELISA試劑盒檢測血清色氨酸、NGF、BDNF、TNF-β、IFN-γ、IL-10以及IL-4含量。另取1.3.5節(jié)制備的適量海馬組織上清液，采用ELISA檢測試劑盒檢測其中5-HT含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 2.4軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥肽分子質(zhì)量分布

GPC檢測結(jié)果（表1）表明，小麥肽中分子質(zhì)量小于1 003 Da的肽占比97.52%，分子質(zhì)量小于505 Da的肽占比91.05%，分子質(zhì)量小于270 Da的小肽占比66.28%。

表1 小麥肽分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular mass distribution of wheat peptide

2.2 小麥肽氨基酸組成

氨基酸測序結(jié)果（表2）表明，該小麥肽氨基酸總含量為91.98%；小麥肽中含量最高的氨基酸為谷氨酸（Glu），約為34.55%，其次為脯氨酸（Pro），約為10.79%；此外該混合肽中，支鏈氨基酸（Val、Ile和Leu）含量為14.04%。

表2 小麥肽氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of wheat peptide

2.3 小麥肽對CFS大鼠逃避潛伏期時間的影響

如表3所示，隨著訓(xùn)練天數(shù)逐漸增加，各實驗組大鼠逃避潛伏期時間均呈縮短趨勢，且相同訓(xùn)練時間下，CFS模型組實驗大鼠逃避潛伏期時間均顯著長于正常對照組（＜0.05），經(jīng)8 周小麥肽干預(yù)后，各干預(yù)組大鼠的逃避潛伏期時間較CFS模型大鼠均顯著縮短（＜0.05），且呈一定的劑量依賴性，但各劑量組間無明顯差異。

表3 小麥肽對CFS大鼠逃避潛伏期的影響Table 3 Effect of wheat peptide on escape latency of CFS rats

2.4 小麥肽對CFS大鼠空間探索能力的影響

如表4可知，CFS模型大鼠（M組）穿越平臺象限次數(shù)與平臺象限停留時間較正常對照（N）組均顯著減?。ǎ?.05）。經(jīng)過8 周口服小麥肽干預(yù)后，M+L、M+M及M+H組實驗大鼠穿越平臺象限次數(shù)及平臺象限停留時間較CFS模型大鼠均顯著增加（＜0.05），雖平臺象限停留時間的延長呈一定的劑量依賴性，但組間無明顯差異。

表4 小麥肽對CFS大鼠穿越平臺象限次數(shù)與平臺象限停留時間的影響（n＝10）Table 4 Effect of wheat peptide on spatial exploration capacity of CFS rats (n = 10)

2.5 小麥肽對CFS大鼠神經(jīng)細胞因子分泌的影響

上述實驗結(jié)果表明，口服小麥肽可顯著改善CFS大鼠認(rèn)知能力，因此進一步評估各實驗組大鼠神經(jīng)細胞因子水平。如圖1所示，與正常對照組相比，CFS大鼠外周血中BDNF和NGF質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），而外周血中色氨酸濃度以及海馬組織中5-HT含量則顯著上升（＜0.05），經(jīng)8 周口服小麥肽干預(yù)后，CFS大鼠血清中色氨酸和海馬組織中5-HT水平均顯著下降（＜0.05），外周血中BDNF和NGF質(zhì)量濃度顯著升高（＜0.05），但3 種劑量小麥肽干預(yù)組間無顯著差異。

圖1 小麥肽對CFS大鼠血清中神經(jīng)細胞因子分泌的影響（n＝10）Fig. 1 Effect of wheat peptide on serum neurocytokines in CFS rats (n = 10)

2.6 小麥肽對CFS大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激水平的影響

抗氧化應(yīng)激能力下降是CFS發(fā)病的重要原因，本實驗進一步考察口服小麥肽對CFS大鼠氧化應(yīng)激水平的影響。如圖2所示，CFS模型大鼠血清中SOD活力較正常對照組大鼠顯著降低（＜0.05），而口服給予低、中、高劑量小麥肽均能顯著增加CFS大鼠海馬組織中SOD活力（＜0.05），且呈一定劑量依賴性，但無顯著差異。同樣，M組大鼠海馬組織中MDA濃度顯著高于N組（＜0.05），而M+L、M+M及M+H組實驗大鼠海馬組織中MDA濃度顯著低于M組（＜0.05），但這3 組間比較無顯著差異。

圖2 小麥肽對CFS大鼠氧化應(yīng)激水平的影響（n＝10）Fig. 2 Effect of wheat peptide on oxidative stress in CFS rats (n = 10)

2.7 小麥肽對CFS大鼠外周血中Th1型細胞因子向Th2型轉(zhuǎn)化的促進作用

對實驗大鼠血清Th1型和Th2型細胞因子水平檢測后發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠相比，CFS模型大鼠血清IL-4和IL-10質(zhì)量濃度顯著增加（＜0.05），而TNF-β以及IFN-γ質(zhì)量濃度均顯著下降（＜0.05）。經(jīng)8 周口服小麥肽干預(yù)后，與M組相比，CFS大鼠血清IL-4和IL-10質(zhì)量濃度均顯著下降（＜0.05）；相反，TNF-β和IFN-γ質(zhì)量濃度顯著上升（＜0.05），但3 種劑量小麥肽干預(yù)組間比較無顯著差異（圖3）。

圖3 小麥肽對CFS大鼠血清中Th1型和Th2型細胞因子的影響（n＝10）Fig. 3 Effect of wheat peptide on serum levels of Th1 and Th2 cytokines in CFS rats (n = 10)

3 討 論

已有研究表明，約有一半CFS患者可受益于營養(yǎng)干預(yù)。飲食療法，包括飲食調(diào)整和營養(yǎng)補充可能有助于緩解CFS患者臨床癥狀。認(rèn)知功能損傷是CFS患者常見的臨床癥狀，因此靶向改善認(rèn)知功能障礙是CFS重要的臨床治療手段。本研究中，水迷宮實驗顯示CFS模型大鼠發(fā)生明顯的認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為逃避潛伏時間延長，穿越平臺象限次數(shù)和平臺象限停留時間均顯著減少；而在給予不同劑量小麥肽干預(yù)8 周后，CFS模型大鼠認(rèn)知功能障礙得到明顯改善。

氧化應(yīng)激是CFS的重要致病因素，過度的氧自由基毒性與CFS患者認(rèn)知障礙的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。近年的研究結(jié)果顯示，疲勞患者血清中氧化參數(shù)包括MDA和活性氧水平顯著增加，而抗氧化SOD、過氧化氫酶活力以及谷胱甘肽含量則顯著降低。同樣，本研究中慢性束縛結(jié)合冷水力竭游泳誘導(dǎo)的CFS大鼠海馬組織中MDA濃度明顯增多，而SOD活力顯著降低，而經(jīng)過8 周口服小麥肽干預(yù)后，CFS大鼠海馬組織中SOD活力顯著升高，MDA濃度大幅下降，提示小麥肽可通過降低氧化應(yīng)激水平改善CFS大鼠的認(rèn)知功能障礙。有研究表明，小麥肽分子質(zhì)量對于其氧自由基清除能力有一定影響，分子質(zhì)量越小，氧自由基清除能力越強。分子質(zhì)量測定結(jié)果顯示，本研究所用小麥肽主要組分分子質(zhì)量小于1 000 Da，且其中分子質(zhì)量小于270 Da的小肽占比高達66.28%，這可能是本研究中小麥肽具有顯著抗氧化應(yīng)激功能的主要原因。

此外，還發(fā)現(xiàn)CFS大鼠血清中色氨酸和海馬組織中5-HT的水平明顯升高，而神經(jīng)細胞因子NGF和BDNF的含量顯著減少，口服小麥肽可有效增加血清中NGF和BDNF的含量，降低CFS大鼠血清中色氨酸濃度和腦組織中5-HT含量。5-HT是一種被廣泛研究的神經(jīng)遞質(zhì)，是5-HT系統(tǒng)的重要組成之一。已有研究表明，以色氨酸為起始的5-HT系統(tǒng)功能紊亂是CFS發(fā)生的重要誘導(dǎo)因素，CFS患者血清中色氨酸濃度顯著高于正常人群，其原因可能在于疲勞狀態(tài)下脂肪供能比例增加，造成外周血中色氨酸濃度大幅上升，而循環(huán)中色氨酸透過血腦屏障進入大腦，促進5-HT能神經(jīng)元分泌5-HT，這與本研究結(jié)果一致。NGF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對維持膽堿能神經(jīng)元的完整性和功能起著重要作用，雖然NGF在CFS中的作用還未被闡明，但諸多實驗結(jié)果已證實NGF在衰老和阿爾茨海默癥等與年齡相關(guān)的疾病中能夠促進神經(jīng)元的存活和再生，有利于改善衰老或者退行性改變導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。同樣，BDNF也是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，研究表明外周循環(huán)中BDNF水平的下降與CFS大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和腦萎縮密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，口服小麥肽可以顯著提高CFS大鼠外周循環(huán)中NGF和BDNF含量，這可能是小麥肽改善CFS大鼠認(rèn)知功能的原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)CFS大鼠血清中IL-10和IL-4質(zhì)量濃度顯著高于正常對照組，而TNF-β以及INF-γ質(zhì)量濃度則顯著低于正常對照組，經(jīng)過8 周口服小麥肽干預(yù)后，CFS大鼠外周血中IL-10和IL-4水平顯著上升，而TNF-β和INF-γ水平顯著降低。IL-10和IL-4是典型的Th2型細胞因子，而TNF-β和INF-γ則為典型的Th1型細胞因子，結(jié)合上述研究結(jié)果認(rèn)為，口服小麥肽促進CFS大鼠外周血中細胞因子由Th2型向Th1型轉(zhuǎn)變。已有研究揭示CFS患者存在細胞因子失調(diào)的現(xiàn)象，而細胞因子失調(diào)進一步會誘導(dǎo)CFS患者的免疫失調(diào)，故靶向免疫調(diào)節(jié)的治療也被認(rèn)為是改善CFS癥狀的有效對策。根據(jù)相關(guān)報道，免疫失調(diào)與認(rèn)知功能障礙發(fā)生密切相關(guān)，因此推測，CFS大鼠的認(rèn)知功能障礙出現(xiàn)可能與免疫調(diào)節(jié)失衡有關(guān)，而口服小麥肽促進Th2型免疫反應(yīng)向Th1型的轉(zhuǎn)變，可能是改善CFS大鼠認(rèn)知障礙的一個重要原因。

值得注意的是，氨基酸測序結(jié)果揭示小麥肽中支鏈氨基酸含量較豐富，約為14.04%。已有大量研究證實支鏈氨基酸具有顯著抗氧化功能，因此認(rèn)為較高含量的支鏈氨基酸可能是小麥肽降低氧自由基產(chǎn)生并改善CFS大鼠認(rèn)知功能障礙的主要原因。同樣，氨基酸測序結(jié)果也表明小麥肽中Glu含量高達34.55%，Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，被認(rèn)為對維持大腦功能至關(guān)重要，在學(xué)習(xí)和記憶形成中發(fā)揮積極作用。先前研究證實補充Glu可以顯著增加乙酰膽堿的釋放從而提高實驗大鼠的記憶力。與之相似，最近的一項研究顯示，補充Glu可以通過改善大腦的神經(jīng)遞質(zhì)和氧化還原系統(tǒng)提高實驗動物的運動能力和認(rèn)知功能。另外，該小麥肽中Pro含量達到10.79%，Pro被認(rèn)為與認(rèn)知功能改善密切相關(guān)，有研究表明富含脯氨酸的肽對阿爾茨海默癥模型大鼠的認(rèn)知功能障礙有明顯改善作用，這種改善作用可能是通過刺激免疫和神經(jīng)膠質(zhì)系統(tǒng)來實現(xiàn)。

綜上所述，口服小麥肽對CFS大鼠的認(rèn)知障礙具有顯著改善作用，其作用機理在于減少氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞因子釋放以及平衡免疫失調(diào)。同時，較高含量的Glu、Pro以及支鏈氨基酸可能對該小麥肽改善CFS大鼠認(rèn)知功能障礙具有重要作用。然而，在本實驗結(jié)果中，認(rèn)知功能的改善與小麥肽補充并無顯著的劑量依賴性，優(yōu)化的劑量還有待進一步探析；此外，本研究中缺乏市售CFS藥物作為陽性對照，因此小麥肽緩解CFS的確切療效還有待進一步驗證。