高壓微射流均質(zhì)法制備二十二碳六烯酸藻油脂質(zhì)體及其性質(zhì)分析

李 暢，薛 璐，蘆 晶，逄曉陽(yáng)，張書文，呂加平,*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。研究表明，DHA具有預(yù)防心血管疾病、促進(jìn)大腦發(fā)育、緩解阿爾茨海默病等多種生理功能。相比于DHA魚油，DHA藻油受到的污染少、魚腥味弱、資源更加豐富，且研究發(fā)現(xiàn)DHA藻油食用更加安全，藻類中的DHA很少引起胃腸道不適。然而，DHA不飽和度高，容易受到光、熱、氧等不同因素的影響，極易氧化產(chǎn)生氫過(guò)氧化物，失去其功能活性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這種不穩(wěn)定性限制了其應(yīng)用范圍。

脂質(zhì)體是由脂類兩親性物質(zhì)如磷脂組成的具有類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的一種閉合類球狀囊泡，由一層或多層磷脂包裹而成。最早是在1965年由英國(guó)科學(xué)家Bangham等發(fā)現(xiàn)，而后迅速發(fā)展成為一種運(yùn)載體系。將DHA藻油制備成脂質(zhì)體不僅對(duì)DHA能夠起到保護(hù)作用，且與微米級(jí)載體相比，納米級(jí)載體提供了更大的表面積、更好的擴(kuò)散滲透性，還具有靶向性、長(zhǎng)效性等特點(diǎn)。此外，由于被包封后發(fā)揮特定作用所需的藥物量要比未包封時(shí)少，因此可以屏蔽不良味道，大幅提高被包封物質(zhì)的生物利用度及感官可接受性。脂質(zhì)體的制備方法多樣，其中，高壓微射流均質(zhì)技術(shù)近年來(lái)不斷發(fā)展并得以應(yīng)用，利用這項(xiàng)技術(shù)制備的脂質(zhì)體具有粒徑小、分散性均勻、避免使用有毒有機(jī)試劑、可實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。目前高壓微射流均質(zhì)技術(shù)已實(shí)現(xiàn)了對(duì)高油酸棕櫚油、酶制劑、蝦油等營(yíng)養(yǎng)或功能物質(zhì)的包埋，提高了這些物質(zhì)的利用率。

近年來(lái)，隨著對(duì)脂質(zhì)體包埋脂溶性物質(zhì)相關(guān)研究的不斷深入，DHA脂質(zhì)體相關(guān)的研究也逐步展開。Rasti等通過(guò)薄膜分散法將-3多不飽和脂肪酸包埋進(jìn)脂質(zhì)體，并將其與未包埋的魚油分別添加進(jìn)食品，通過(guò)考察保留率、過(guò)氧化值等指標(biāo)，證明了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性與適用性。Han Chenlu等利用薄膜分散-超聲法制備得到DHA脂質(zhì)體，通過(guò)體內(nèi)及體外消化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了脂質(zhì)體這一運(yùn)載形式可提高小腸對(duì)DHA的吸收。基于此，本研究采用薄膜分散與高壓微射流均質(zhì)技術(shù)結(jié)合的方法，以DHA藻油脂質(zhì)體的平均粒徑、包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行DHA藻油脂質(zhì)體制備的單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并考察DHA藻油脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性及氧化穩(wěn)定性，旨在開發(fā)一種低粒徑、較高載量、穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體運(yùn)載體系，以便DHA藻油在藥品、食品實(shí)際加工生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DHA藻油（DHA純度≥40%） 廈門匯盛生物有限公司；大豆磷脂（磷脂酰膽堿純度≥45%） 上海麥克林生化科技有限公司；膽固醇、吐溫-80 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S-CW電子天平 德國(guó)Sartorius公司；MVS-1渦旋混合器 北京金北德工貿(mào)有限公司；RE 52-05真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化有限公司；AMH-3高壓微射流均質(zhì)機(jī) 安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度分析儀 英國(guó)馬爾文儀器公司；U-3010UV紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)TEM-7500透射電子顯微鏡 日本日立公司；DSC 8000差示掃描量熱儀 美國(guó)PE公司；Turbiscan穩(wěn)定性分析儀法國(guó)Formulaction公司；ZDJ-4A自動(dòng)電位滴定儀 上海雷磁股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DHA藻油脂質(zhì)體的制備

將一定量的大豆磷脂、膽固醇、DHA藻油脂溶性物質(zhì)加入到適量無(wú)水乙醇中，用磁力攪拌器攪拌均勻，在45 ℃、真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無(wú)水乙醇形成薄膜，將吐溫-80加入到0.01 mol/L、pH 7.2的PBS中攪拌均勻，再將PBS倒入裝有薄膜容器中振蕩水合得到脂質(zhì)體，用高壓微射流均質(zhì)機(jī)在一定壓力下處理若干次得到DHA藻油脂質(zhì)體。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

設(shè)置大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油的質(zhì)量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質(zhì)量的15%，PBS（0.01 mol/L，后同）的pH值為7.2，高壓微射流均質(zhì)壓力為120 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3，考察磷脂質(zhì)量濃度在5、10、20、30、40 mg/mL條件下對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體包封率和平均粒徑的影響。

設(shè)置大豆磷脂質(zhì)量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與DHA藻油的質(zhì)量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質(zhì)量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質(zhì)壓力為120 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3，考察大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比在4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1條件下對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體包封率和平均粒徑的影響。

設(shè)置大豆磷脂質(zhì)量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質(zhì)量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質(zhì)壓力為120 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3，考察大豆磷脂與DHA藻油的質(zhì)量比在4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、20∶1條件下對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體包封率和平均粒徑的影響。

設(shè)置大豆磷脂質(zhì)量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油的質(zhì)量比為8∶1，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質(zhì)壓力為120 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3，考察吐溫-80用量占大豆磷脂質(zhì)量0%、5%、10%、15%、20%條件下對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體包封率和平均粒徑的影響。

設(shè)置大豆磷脂質(zhì)量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油的質(zhì)量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質(zhì)量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質(zhì)次數(shù)為3，考察均質(zhì)壓力在0、80、100、120、140、160 MPa條件下對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體包封率和平均粒徑的影響。

設(shè)置大豆磷脂質(zhì)量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油質(zhì)量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質(zhì)量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質(zhì)壓力為120 MPa，考察均質(zhì)1、2、3、4、5、6 次對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體包封率和平均粒徑的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與分析。以平均粒徑為響應(yīng)值，采用Box-Behnken Design選定三因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。在得到的DHA藻油脂質(zhì)體最優(yōu)制備工藝條件下進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并在4 ℃條件下保存樣品。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table1 Codes and levels of independent variables used in response surface design

1.3.4 DHA藻油脂質(zhì)體性質(zhì)表征

1.3.4.1 平均粒徑、多分散指數(shù)的測(cè)定

使用Zetasizer Nano ZS納米粒度分析儀分別測(cè)定平均粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI），用蒸餾水將DHA藻油脂質(zhì)體稀釋至合適的質(zhì)量濃度，平行測(cè)定3 次取平均值。

1.3.4.2 包封率的測(cè)定

DHA藻油-正己烷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取1 000.0 mg的DHA藻油溶于正己烷，在100 mL容量瓶中定容得到10.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制一系列不同質(zhì)量濃度的DHA藻油-正己烷溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），以正己烷為空白，在288 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以DHA藻油的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用有機(jī)溶劑萃取法并稍作修改以對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體的包封率進(jìn)行測(cè)定。取1 mL脂質(zhì)體于離心管中，加入4 mL正己烷，渦旋混合2 min后機(jī)械振蕩10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在288 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)DHA藻油-正己烷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離DHA藻油的質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。通過(guò)下式計(jì)算包封率。

式中：為未被包封進(jìn)脂質(zhì)體中的游離DHA藻油的質(zhì)量/g；為制備脂質(zhì)體時(shí)加入的DHA藻油質(zhì)量/g。

1.3.4.3 微觀形態(tài)觀察

采用透射電子顯微鏡對(duì)經(jīng)高壓微射流均質(zhì)處理的脂質(zhì)體（以下簡(jiǎn)稱MF-L）及未經(jīng)高壓微射流均質(zhì)處理的脂質(zhì)體（以下簡(jiǎn)稱C-L）的微觀形態(tài)進(jìn)行觀察。參照Chaves等的方法并稍作修改，將脂質(zhì)體稀釋適當(dāng)倍數(shù)至半透明狀態(tài)，用飽和的醋酸鈾酰負(fù)染色法制備觀測(cè)樣品。

1.3.4.4 差示掃描量熱分析

用差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法對(duì)MF-L及C-L相變溫度進(jìn)行測(cè)定。參照Wang Qianqian等的方法并稍作修改，以空鋁鍋?zhàn)鳛閰⒄?，平均樣品質(zhì)量為（10±5）mg，在密封鋁鍋中加熱，溫度范圍為20～170 ℃，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，加熱速率為10 ℃/min。

1.3.5 穩(wěn)定性分析

1.3.5.1 物理穩(wěn)定性

利用Turbiscan穩(wěn)定性分析儀對(duì)兩種DHA藻油脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性進(jìn)行快速分析。取20 mL樣品于樣品瓶中，溫度設(shè)定為25 ℃，每1 h掃描一次，掃描24 h，記錄穩(wěn)定性指數(shù)（turbiscan stability index，TSI）。

1.3.5.2 貯藏穩(wěn)定性

將新鮮制備的兩種DHA藻油脂質(zhì)體分別貯藏在4、25 ℃條件下，于第0、28天分別對(duì)平均粒徑、包封率進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.3 氧化穩(wěn)定性

將新鮮制備的兩種DHA藻油脂質(zhì)體分別貯藏在4、25 ℃條件下，于第0、7、14、21、28天采用GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》中的電位滴定法對(duì)過(guò)氧化值進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1A可知，隨著大豆磷脂質(zhì)量濃度的增大，平均粒徑逐漸增大，包封率先升高后降低。低磷脂質(zhì)量濃度下雖然粒徑更小，但包封效果不理想。高磷脂質(zhì)量濃度雖然可以提高包封率，但過(guò)高的磷脂質(zhì)量濃度容易使體系不穩(wěn)定，產(chǎn)生絮沉，導(dǎo)致粒徑和PDI受到影響。綜合考慮，選擇20 mg/mL的大豆磷脂質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

如圖1B所示，隨著大豆磷脂與藻油質(zhì)量比的增加，平均粒徑總體呈增大趨勢(shì)，對(duì)包封率總體無(wú)明顯影響。當(dāng)磷脂與藻油質(zhì)量比為20∶1時(shí)，脂質(zhì)體的雙層膜受到破壞，包封率減小至（80.6±11.5）%，原因可能與制備過(guò)程有關(guān)，當(dāng)磷脂含量較多時(shí)，在旋蒸過(guò)程中很難形成均一穩(wěn)定的薄膜，導(dǎo)致水合時(shí)磷脂析出?？紤]到載藥量，磷脂與藻油的質(zhì)量比選擇4∶1。

膽固醇是許多生物膜的主成分，對(duì)于脂質(zhì)體的作用主要是通過(guò)自身的親水、親油基團(tuán)增加雙層膜的剛性、厚度以及結(jié)構(gòu)的有序性。如圖1C所示，隨著磷脂與膽固醇質(zhì)量比的增加，平均粒徑逐漸減小，包封率逐漸增加。當(dāng)磷脂與膽固醇質(zhì)量比為8∶1時(shí)，平均粒徑最小，包封率達(dá)到最高。

吐溫-80的加入可提高脂質(zhì)體的包封率。吐溫-80通過(guò)物理吸附在脂質(zhì)體雙層膜表面，形成一定厚度的親水相，使脂質(zhì)體在體系中更加均勻、穩(wěn)定，并且在制備過(guò)程中有利于脂質(zhì)體的水化。如圖1D所示，當(dāng)不添加吐溫-80時(shí)，包封率最低，平均粒徑最大。隨著吐溫-80用量的增加，平均粒徑逐漸減小，包封率明顯增加。但加入過(guò)多的表面活性劑可能溶解脂質(zhì)體囊泡，對(duì)脂質(zhì)體具有破壞作用，故選擇吐溫-80用量20%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

如圖1E所示，在高壓微射流均質(zhì)技術(shù)處理粗脂質(zhì)體的過(guò)程中，隨著均質(zhì)壓力的增大，脂質(zhì)體平均粒徑逐漸減小，相比未經(jīng)該技術(shù)處理的脂質(zhì)體，其包封率明顯增加。但在140 MPa均質(zhì)壓力下，脂質(zhì)體的微囊發(fā)生破裂，藻油發(fā)生泄漏，包封率降低，這與邰克東等的結(jié)論相似。當(dāng)高壓微射流均質(zhì)壓力為120 MPa時(shí)，脂質(zhì)體的平均粒徑為（74.93±0.61）nm，包封率為（94.2±0.8）%，較為理想，故選擇高壓微射流均質(zhì)壓力120 MPa進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1F中，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，脂質(zhì)體的平均粒徑逐漸減小，包封率逐漸增大，均質(zhì)處理5～6 次對(duì)于平均粒徑無(wú)明顯影響。但脂質(zhì)體囊泡易因均質(zhì)次數(shù)的增加或時(shí)間的延長(zhǎng)而導(dǎo)致溫度升高，體系內(nèi)容易出現(xiàn)重新聚集現(xiàn)象，故選擇均質(zhì)處理次數(shù)5 次。

圖1 大豆磷脂質(zhì)量濃度（A）、磷脂與DHA藻油質(zhì)量比（B）、磷脂與膽固醇質(zhì)量比（C）、吐溫-80用量（D）、高壓微射流均質(zhì)壓力（E）、高壓微射流均質(zhì)次數(shù)（F）對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體平均粒徑、包封率的影響Fig. 1 Effects of soy lecithin concentration (A), lecithin to DHA-rich algae oil mass ratio (B), lecithin to cholesterol mass ratio (C), Tween-80 dosage (D), homogenization pressure (E), and number of homogenization cycles (F) on mean particle size and encapsulation efficiency of DHA-rich algae oil liposomes

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以平均粒徑為響應(yīng)值，選擇磷脂與膽固醇質(zhì)量比、吐溫-80用量、高壓微射流均質(zhì)壓力作三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with response variable

對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到以平均粒徑（）為因變量，磷脂與膽固醇質(zhì)量比（）、吐溫-80用量（）、高壓微射流均質(zhì)壓力（）為自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：＝91.39+14.40-5.92-7.40-0.787 5+5.90+3.39-1.45-11.64-9.18。

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，模型＝0.001 3＜0.01，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)＝0.217 0＞0.05，差異不顯著，同時(shí)模型決定系數(shù)＝0.978 0，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合程度很好，可用于制備DHA藻油脂質(zhì)體工藝優(yōu)化的分析及預(yù)測(cè)。從分析結(jié)果中可知，、、對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，與影響極顯著，的交互作用影響顯著，交互作用響應(yīng)面3D圖見(jiàn)圖2。其他因素及其相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

圖2 磷脂與膽固醇質(zhì)量比、均質(zhì)壓力交互作用對(duì)DHA藻油脂質(zhì)體平均粒徑的影響Fig. 2 Response surface plot showing interactive effect of soy lecithin to cholesterol mass ratio and homogenization pressure on mean particle size of DHA-rich algae oil liposomes

根據(jù)上述方程可計(jì)算最佳制備工藝：磷脂與膽固醇質(zhì)量比11.9∶1、吐溫-80用量15%、高壓微射流均質(zhì)壓力138 MPa，平均粒徑理論預(yù)測(cè)值為55.50 nm，使用優(yōu)化后的工藝制備DHA藻油脂質(zhì)體并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到平均粒徑為（59.35±3.05）nm，PDI為0.189±0.025，包封率為（94.2±2.9）%。由此可見(jiàn)，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立的響應(yīng)曲面模型優(yōu)化可行。與黃茜等通過(guò)薄膜分散單一方法制備得到的DHA藻油脂質(zhì)體以及涂宗財(cái)?shù)韧ㄟ^(guò)乙醇注入法結(jié)合動(dòng)態(tài)高壓微射流法制備得到的魚油脂質(zhì)體相比，本研究中制備所得DHA藻油脂質(zhì)體的平均粒徑、包封率更為理想，說(shuō)明薄膜分散結(jié)合高壓微射流均質(zhì)法的使用有效提高了脂質(zhì)體的性能。

2.3 DHA藻油脂質(zhì)體的表征

2.3.1 微觀結(jié)構(gòu)

通過(guò)透射電子顯微鏡觀察到的MF-L與C-L大小、形態(tài)等信息如圖3所示，MF-L幾乎呈球體，分布均勻，與平均粒徑測(cè)定的結(jié)果一致。相比之下，C-L囊泡更大，部分粒徑接近1 μm，且均勻性較差。

圖3 MF-L放大倍數(shù)為60 000×（A）、200 000×（B）和C-L放大倍數(shù)為20 000×（C）、12 000×（D）的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 TEM images of MF-L at 60 000 × (A), 200 000 × (B) and C-L at 20 000 × (C), 12 000 × (D) magnifications

2.3.2 DSC分析結(jié)果

通過(guò)DSC分析儀對(duì)兩種脂質(zhì)體進(jìn)行相變溫度的分析。圖4中與C-L相比，MF-L提高了相變溫度，峰值溫度由95.49 ℃提高到111.67 ℃，并且具有更小的相變焓，因此磷脂雙層膜更加穩(wěn)定。Wang Qianqian等制備的魚油粗脂質(zhì)體通過(guò)DSC分析儀測(cè)得相變溫度為56.17 ℃，低于本研究中制備的DHA藻油脂質(zhì)體相變溫度。不同脂質(zhì)體制備相關(guān)研究中相變溫度的差異可能是由于制備時(shí)使用的磷脂種類不同。磷脂中脂肪酸鏈的長(zhǎng)度、飽和度直接決定了其相變溫度，一般脂肪酸鏈越長(zhǎng)，相變溫度越高。

圖4 MF-L和C-L的DSC分析曲線Fig. 4 DSC thermograms of MF-L and C-L

2.4 穩(wěn)定性分析結(jié)果

2.4.1 物理穩(wěn)定性

通過(guò)Turbiscan快速穩(wěn)定性分析儀分析了兩種不同處理方式脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性，圖5為動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性曲線。TSI越大，表明體系越不穩(wěn)定，相比之下C-L更容易發(fā)生聚沉，物理穩(wěn)定性較低。前12 h內(nèi)，MF-L表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性，TSI變化緩慢。12 h以后，雖然MF-L的變化幅度逐漸增大，但仍比C-L的TSI小。說(shuō)明脂質(zhì)體粒徑的降低對(duì)物理穩(wěn)定性的提高有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果與邰克東等研究不同均質(zhì)壓力對(duì)脂質(zhì)體囊泡特性和物理穩(wěn)定性影響的結(jié)論相似。

圖5 MF-L和C-L的動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性曲線Fig. 5 Kinetic instability curves of MF-L and C-L

2.4.2 貯藏穩(wěn)定性

如圖6～8所示，在貯藏期28 d內(nèi)，4、25 ℃條件下MF-L和C-L表現(xiàn)出了不同的穩(wěn)定特性，C-L在4 ℃下貯藏28 d后，平均粒徑由739.4 nm增大到942.7 nm（圖6），粒徑分布由雙重峰轉(zhuǎn)變成不規(guī)則的多重峰（圖7B、E），且藻油泄漏嚴(yán)重（圖8），油腥味加劇。兩種溫度下的C-L包封率呈現(xiàn)迅速下降的趨勢(shì)，出現(xiàn)絮沉，逐漸失去納米特性，在25 ℃下貯藏的脂質(zhì)體絮沉程度比4 ℃下更加劇烈。MF-L在4 ℃條件下貯藏28 d后，平均粒徑與包封率無(wú)明顯變化（圖6、8），其在兩種溫度條件下的粒徑分布圖峰形平滑，幾乎呈單峰分布（圖7C、D），且從外觀觀察，4 ℃條件下比25 ℃變化差異更小，呈半透明狀態(tài)分布均勻，無(wú)絮沉現(xiàn)象。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明MF-L比C-L貯藏穩(wěn)定性更好，低溫條件下貯藏脂質(zhì)體更能維持其良好特性。

圖6 MF-L和C-L在不同貯藏溫度與時(shí)間下的平均粒徑變化Fig. 6 Variation in mean particle size of MF-L and C-L at different storage temperatures and times

圖7 第28天MF-L和C-L在不同貯藏溫度下的粒徑分布Fig. 7 Particle size distribution of MF-L and C-L after 28 days of storage at different temperatures

圖8 MF-L和C-L在不同貯藏溫度與時(shí)間下的包封率變化Fig. 8 Variation in encapsulation efficiency of MF-L and C-L as a function of storage time at different temperatures

2.4.3 氧化穩(wěn)定性

通過(guò)過(guò)氧化值的測(cè)定評(píng)價(jià)DHA藻油脂質(zhì)體的氧化穩(wěn)定性。由圖9可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，4 ℃條件下MF-L和C-L的過(guò)氧化值都緩慢增長(zhǎng)，且MF-L的過(guò)氧化值漲幅低于C-L。7～14 d，25 ℃下C-L過(guò)氧化值降低了0.031 mmol/kg，原因是脂質(zhì)氧化是一個(gè)連鎖反應(yīng)過(guò)程，脂質(zhì)體在初級(jí)氧化產(chǎn)物的基礎(chǔ)上會(huì)進(jìn)一步生成次級(jí)氧化產(chǎn)物。從第21天開始，過(guò)氧化值呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，25 ℃比4 ℃條件下過(guò)氧化值增長(zhǎng)速率更快，且C-L的漲幅更大。C-L在貯藏期間大量泄漏油脂，酸敗程度加劇。第28天時(shí)，25 ℃下C-L具有最高的過(guò)氧化值，為（1.840±0.332）mmol/kg。與之相比，MF-L抗氧化能力更強(qiáng)，且4 ℃貯藏效果最好，第28天時(shí)過(guò)氧化值為（0.353±0.106） mmol/kg。這可能是高壓微射流的作用使脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，一方面減少了油脂泄漏量，限制了過(guò)氧化物的產(chǎn)生；另一方面磷脂雙層對(duì)藻油起到了很好的保護(hù)作用，防止其被氧化。同時(shí)，溫度是貯藏過(guò)程中的關(guān)鍵影響因素，在低溫條件下貯藏脂質(zhì)體有益于產(chǎn)品功能的保持。

圖9 MF-L和C-L在不同貯藏溫度與時(shí)間下的過(guò)氧化值Fig. 9 Peroxide values of MF-L and C-L as a function of storage time at different temperatures

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以平均粒徑、包封率為主要指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了DHA藻油脂質(zhì)體的高壓微射流均質(zhì)制備工藝。得到制備的最佳工藝條件為：磷脂質(zhì)量濃度20 mg/mL、磷脂與藻油的質(zhì)量比4∶1、磷脂與膽固醇質(zhì)量比11.9∶1、吐溫-80用量15%、均質(zhì)壓力138 MPa、均質(zhì)次數(shù)5 次。在此條件下進(jìn)行制備，DHA藻油脂質(zhì)體平均粒徑為（59.35±3.05）nm，PDI為0.189±0.025，包封率（94.2±2.9）%。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，高壓微射流均質(zhì)DHA藻油脂質(zhì)體微觀結(jié)構(gòu)為球狀，分布均勻。通過(guò)與未經(jīng)高壓微射流技術(shù)處理的脂質(zhì)體對(duì)比，高壓微射流均質(zhì)制備的DHA藻油脂質(zhì)體相變溫度有所提高，并在保持穩(wěn)定性上有一定的優(yōu)勢(shì)：28 d的貯藏期內(nèi)，經(jīng)處理的DHA藻油脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性良好，且在低溫條件下貯藏效果較為理想。本實(shí)驗(yàn)所用方法為實(shí)際加工中DHA藻油脂質(zhì)體的應(yīng)用提供了一定的技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。