低頻靜磁場對發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)富集及降糖活性的影響

方曉敏，任世達(dá)，賈 睿，劉倩男，蔡 丹，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118）

玉米籽粒富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、酚類物質(zhì)等活性物質(zhì)，具有開發(fā)成為高營養(yǎng)功能食品的巨大潛力。酚類物質(zhì)是玉米中重要的活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂等生理活性。發(fā)芽是一種簡單、有效的處理方法，可以提高谷物的活性物質(zhì)含量，目前常用于輔助發(fā)芽的非熱物理技術(shù)有多色光輻照、非熱等離子體、脈沖電場等，其中磁場作為一種簡單、高效且對植物組織傷害小的方法，受到大量研究人員的關(guān)注。

研究表明植物酚類物質(zhì)代謝的主要途徑有莽草酸、苯丙烷代謝途徑，其中苯丙烷代謝途徑主要作用的酶有苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酰-輔酶A連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）等，酚類物質(zhì)的合成與這些酶密切相關(guān)。磁場作為一種外界物理?xiàng)l件處理方法，可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)酶活性，促進(jìn)種子萌發(fā)和生長，現(xiàn)有研究報(bào)道，棕櫚種子在磁場強(qiáng)度9 mT下處理4 h后，其發(fā)芽率顯著高于對照組；向日葵種子在磁場強(qiáng)度50 mT下處理2 h后，發(fā)芽速度、幼苗長度和幼苗干質(zhì)量達(dá)到峰值，與對照組相比，磁場處理向日葵種子的-淀粉酶、脫氫酶和蛋白酶的活性顯著增強(qiáng)；大豆和玉米在200 mT靜磁場條件下處理1 h，可以有效緩解鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制；番茄種子、鷹嘴豆、洋蔥等其他作物在磁場作用下，種子萌發(fā)速率也得到顯著提高。目前磁場處理發(fā)芽的相關(guān)研究主要集中在植物的生理變化上，對其活性成分酚類物質(zhì)及其降糖效果的研究報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)以玉米（‘吉單66’）為原料，采用不同時(shí)間、磁場強(qiáng)度處理，研究低頻靜磁場對發(fā)芽玉米的生長情況、總酚含量、酚酸組成及降糖活性的影響，以及多酚代謝關(guān)鍵酶PAL、C4H、4CL活力的變化，旨在揭示磁場處理對發(fā)芽玉米中酚類物質(zhì)富集的作用機(jī)理，為發(fā)芽玉米產(chǎn)品的開發(fā)提供必要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬齒形黃玉米‘吉單66’（2020年10月份成熟采摘）由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室提供。

沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸、丁香酸、鄰香豆酸酚酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、冰乙酸（均為色譜純）以及-葡萄糖苷酶（10 U/g）、-淀粉酶（10 U/g） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

植物生長箱 德國Binder公司；FLUO star Omega全自動多功能酶標(biāo)儀 德國BMGLabtech公司；Z36HK超高速冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；磁場催化光照培養(yǎng)箱MFOI-L1 英都斯特（無錫）感應(yīng)科技有限公司；FD-IB-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康儀器有限公司；高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 磁場處理發(fā)芽

取籽粒飽滿的玉米，用體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min，然后用蒸餾水沖洗后浸泡6 h，將其放在磁場兩極之間，在磁場強(qiáng)度為2.5、3.5、4.5 mT條件下分別放置12、24、36、48、60、72 h，然后將玉米籽粒均勻放入規(guī)格為34 cm×25 cm×4.5 cm的發(fā)芽盤中，每盤放100 粒，加入1 000 mL水，放入植物生長箱中25 ℃避光發(fā)芽至第4天取樣（通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)玉米在發(fā)芽第4天時(shí)酚類物質(zhì)含量最高），每12 h換水一次，以未經(jīng)磁場處理發(fā)芽至第4天的玉米作為對照組，將樣品進(jìn)行冷凍干燥處理，研磨成粉后待測。

1.3.2 生長指標(biāo)測定

發(fā)芽率：測定100 粒玉米的發(fā)芽情況，種子出現(xiàn)肉眼可見的胚根萌芽時(shí)，且無霉變污染情況，則視為發(fā)芽。芽長：隨機(jī)取10 粒玉米，用游標(biāo)卡尺測量芽長，計(jì)算平均值。鮮質(zhì)量：隨機(jī)選取10 粒玉米，用精密電子天平稱質(zhì)量，計(jì)算平均值。上述實(shí)驗(yàn)均做3 次平行。

1.3.3 多酚的提取

游離酚的提取：參照Okarter等的方法，稱取2 g發(fā)芽玉米粉，加入60 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，在超聲波輔助的條件下提取45 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)上述操作步驟2 次，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用5 mL甲醇溶解備用。

結(jié)合酚的提?。簠⒄绽钇G等的方法，向上述提取游離酚剩下的殘?jiān)屑尤?0 mL 2 mol/L NaOH溶液，在25 ℃搖床中振蕩反應(yīng)1 h，用6 mol/L HCl溶液調(diào)整pH值至2～3，最后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，每個(gè)樣品萃取3 次，合并上清液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋蒸至干，用5 mL甲醇溶解備用。

1.3.4 多酚含量測定

多酚含量測定參考Luo Jiaqiang等的方法并稍作修改。精確吸取50 μL發(fā)芽玉米多酚提取液，依次加入200 μL蒸餾水和250 μL福林-酚工作液，室溫下避光靜置5 min，然后加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaCO溶液，室溫下避光反應(yīng)1 h，吸取200 μL反應(yīng)液置于96 孔板中，使用酶標(biāo)儀測定765 nm波長處的吸光度。選用系列質(zhì)量濃度沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行上述處理，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝0.005 7+0.074 6（＝0.999 1）。根據(jù)式（1）計(jì)算發(fā)芽玉米多酚含量。

式中：為發(fā)芽玉米粉多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為提取液體積/mL；為稀釋倍數(shù)；為發(fā)芽玉米粉質(zhì)量/g。

1.3.5 酚酸含量測定

本實(shí)驗(yàn)選取沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸、丁香酸、鄰香豆酸6 種酚酸類物質(zhì)進(jìn)行分析，這些酚酸類物質(zhì)是苯丙烷途徑代謝的關(guān)鍵酚類物質(zhì)，采用高效液相色譜法對低頻靜磁場處理后發(fā)芽玉米中的酚酸類物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。色譜柱：Zorbox SBC柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），二極管陣列檢測器，檢測波長280 nm。流動相分別為體積分?jǐn)?shù)0.5%的冰乙酸溶液（B相）和甲醇（A相），洗脫梯度：0～8 min，5%～8%流動相A；8～17 min，8%～10%流動相A；17～20 min，10%～12%流動相A；20～25 min，12%～15%流動相A；25～33 min，15%～22%流動相A；33～50 min，22%～50%流動相A。

1.3.6 PAL活力的測定

參考丁羽宣等方法測定PAL活力，以每分鐘每克發(fā)芽玉米酶促反應(yīng)體系290 nm波長處吸光度增加0.01為一個(gè)PAL活力單位（U）。

1.3.7 C4H活力的測定

參考Wang Mian等方法測定C4H活力，以每分鐘每克發(fā)芽玉米酶促反應(yīng)體系340 nm波長處吸光度增加0.01為一個(gè)C4H活力單位（U）。

1.3.8 4CL活力的測定

參考Wei Yingying等方法測定4CL活力，以每分鐘每克發(fā)芽玉米酶促反應(yīng)體系340 nm波長處吸光度增加0.01為一個(gè)4CL活力單位（U）。

1.3.9 發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)體外降糖活性的測定

1.3.9.1 酚類物質(zhì)對-葡萄糖苷酶活性抑制率的測定

參考Yang Xiaoping等方法并稍作修改。取40 μL濃度為0.1 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，加入發(fā)芽玉米多酚提取液20 μL、0.4 U/mL-葡萄糖苷酶液10 μL，37 ℃保溫10 min，再加入50 μL濃度為10 mmol/L的底物對硝基苯酚葡萄糖苷溶液，37 ℃反應(yīng)20 min，最后加入0.2 mol/L NaCO溶液50 μL終止反應(yīng)，在405 nm波長處測定反應(yīng)體系吸光度。玉米多酚對-葡萄糖苷酶的抑制率按公式（2）計(jì)算。

式中：為10 μL-葡萄糖苷酶溶液+20 μL發(fā)芽玉米多酚提取液+50 μL底物+90 μL磷酸鹽緩沖液的吸光度；為100 μL磷酸鹽緩沖溶液+50 μL底物+20 μL發(fā)芽玉米多酚提取液的吸光度；為110 μL磷酸鹽緩沖溶液+10 μL-葡萄苷酶溶液+50 μL底物的吸光度。

1.3.9.2 酚類物質(zhì)對-淀粉酶活性抑制率的測定

參考喬錦莉等方法并稍作修改。取發(fā)芽玉米多酚提取液20 μL，加入20 μL-淀粉酶（7 U/L），混勻后在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱30 min，加入40 μL預(yù)熱到37 ℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%淀粉溶液，在37 ℃下反應(yīng)3 min后加入80 μL DNS試劑，沸水浴8 min，冷卻至室溫后，加入800 μL蒸餾水稀釋，在450 nm波長處測定吸光度，同時(shí)以20 μL蒸餾水替換發(fā)芽玉米多酚提取液作為對照。玉米多酚對-淀粉酶的抑制率按公式（3）計(jì)算。

式中：為不加發(fā)芽玉米多酚提取液的反應(yīng)體系吸光度；為加入發(fā)芽玉米多酚提取液的反應(yīng)體系吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Origin 2017軟件繪圖，使用SPSS 24軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以＜0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低頻靜磁場處理對發(fā)芽玉米生長指標(biāo)的影響

由圖1可知，隨著低頻靜磁場處理時(shí)間的延長，發(fā)芽玉米籽粒的芽長、發(fā)芽率、鮮質(zhì)量總體都呈先增加后下降的變化趨勢，3.5 mT下處理60 h后，發(fā)芽玉米芽長、發(fā)芽率達(dá)到最大，分別為（4.51±0.11）cm、96%，較對照組分別提高了32.65%、14.29%；3.5 mT下處理48 h后發(fā)芽玉米籽粒的鮮質(zhì)量最大，為（1.49±0.04）g/粒，較對照組提高了34.23%（＜0.05）。玉米種子在磁場作用下，增加了細(xì)胞膜的滲透性，加快了水和氧氣進(jìn)入種子的速度，提高了呼吸氧化酶的活性，從而增強(qiáng)了胚的呼吸作用，因此促進(jìn)了玉米籽粒的萌發(fā)，使玉米籽粒芽和根的長度增長；經(jīng)磁場處理后的玉米種子根系更加發(fā)達(dá)，且側(cè)根數(shù)量增多，使得種子吸水面積增大，吸水能力增強(qiáng)，所以種子的鮮質(zhì)量被提高。但在磁場處理60 h后發(fā)芽玉米芽長、鮮質(zhì)量都有所下降，可能是低頻靜磁場處理會產(chǎn)生臨界效應(yīng)，處理時(shí)間過長對玉米籽粒的生長產(chǎn)生了抑制作用。綜上，適宜的磁場處理?xiàng)l件可以促進(jìn)種子的生長。

圖1 低頻靜磁場處理對發(fā)芽玉米生長指標(biāo)的影響Fig. 1 Effect of low-frequency static magnetic field treatment on growth indexes of germinated maize

2.2 低頻靜磁場處理對發(fā)芽玉米游離酚、結(jié)合酚含量的影響

由圖2可知，在靜磁場的作用下，發(fā)芽玉米多酚含量顯著提高，磁場處理前48 h內(nèi)多酚含量增長幅度較小，在磁場強(qiáng)度3.5 mT下處理60 h后，游離酚和結(jié)合酚含量增加最多，分別為（4.15±0.09）mg/g和（1.33±0.06）mg/g，較對照組分別提高了47.16%和72.72%（＜0.05），說明磁場處理60 h富集多酚效果最佳，所以后續(xù)在磁場處理60 h進(jìn)行酚酸含量的測定。這一結(jié)果與張茜等的研究結(jié)果相似，靜磁場處理可以有效地富集酚類物質(zhì)，種子經(jīng)磁場處理后，多種酶被激活，使酶活力提高，促進(jìn)了植物體內(nèi)的代謝過程，從而保證有充足的養(yǎng)料，為酚類物質(zhì)的富集提供了足夠的物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來源。

圖2 低頻靜磁場處理對發(fā)芽玉米游離酚（A）、結(jié)合酚（B）含量的影響Fig. 2 Effect of low-frequency static magnetic field treatment on the contents of free (A) and bound (B) phenols in geminated maize

2.3 低頻靜磁場處理對發(fā)芽玉米酚酸組分的影響

多酚標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜和回歸方程分別如圖3和表1所示。由表2可知，低頻靜磁場處理發(fā)芽玉米結(jié)合酚和游離酚含量變化存在明顯差異。在游離酚中，丁香酸、對香豆酸、咖啡酸、鄰香豆酸在磁場強(qiáng)度為3.5 mT時(shí)含量最高，分別為（206.72±8.26）、（753.20±10.25）、（235.06±4.39）、（382.03±13.14）μg/g，較對照組分別提高501.80%、149.25%、22.71%、2.42%；沒食子酸在磁場強(qiáng)度為3.5～4.5 mT條件下，含量為（158.20±4.25）～（160.46±7.98）μg/g，差異不顯著（＞0.05），但與對照組相比提高58.18%～60.44%（＜0.05）；阿魏酸含量與對照組相比顯著下降。

表1 6 種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程Table 1 Calibration curve equations for determination of six phenolic compounds

表2 低頻靜磁場處理對發(fā)芽玉米酚酸類物質(zhì)組成和含量的影響Table 2 Effect of low-frequency static magnetic field treatment on the composition and content of phenolic acids in germinated maize

圖3 多酚標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜Fig. 3 High performance liquid chromatogram of polyphenol standards

在結(jié)合酚中，磁場處理后沒食子酸、鄰香豆酸含量較對照組相比均有所下降，丁香酸、對香豆酸在磁場強(qiáng)度4.5 mT條件下含量最大，分別為（188.24±5.24）μg/g和（387.01±6.15）μg/g，與對照組相比分別提高了492.32%、69.56%（＜0.05），阿魏酸和咖啡酸在磁場強(qiáng)度為3.5 mT時(shí)含量達(dá)到最大，分別為（211.85±6.34）μg/g和（332.68±5.32）μg/g，這可能是在種子發(fā)芽過程中受到多酚氧化酶、水解酶等影響，酚酸類物質(zhì)與木素質(zhì)交聯(lián)，參與植物細(xì)胞壁的形成，產(chǎn)生更多酚酸類物質(zhì)，從而影響其含量。

2.4 低頻靜磁場處理發(fā)芽玉米多酚含量及關(guān)鍵酶活力的變化關(guān)系

低頻靜磁場處理總酚含量及關(guān)鍵酶PAL、C4H、4CL活力變化情況如圖4所示。由圖4B可知，經(jīng)3.5 mT低頻靜磁場處理后，總酚含量以及C4H、4CL活力隨著處理時(shí)間的延長均呈先上升后下降的變化趨勢，PAL活力變化趨勢為上升-下降-上升。2.5、4.5 mT條件下，前36 h總酚含量以及3 種酶活力呈現(xiàn)波動變化，36 h后多酚含量與3 種代謝酶活力隨著時(shí)間的延長總體呈先增加后下降的趨勢，在磁場強(qiáng)度為3.5 mT下處理60 h后，總酚含量最高（（5.48±0.15）mg/g），此時(shí)PAL、C4H、4CL活力均達(dá)到最大值，分別為（496.67±14.21）、（64.68±2.22）、（97.56±3.64）U/g，經(jīng)磁場處理后，發(fā)芽玉米總酚含量被提高，這與其代謝相關(guān)酶活力增強(qiáng)相關(guān)。磁場處理首先影響了作用于多酚苯丙烷代謝途徑的第一限速酶PAL，使PAL活力提高，為后續(xù)多酚代謝產(chǎn)生足夠的肉桂酸，進(jìn)而提高了C4H活力，促進(jìn)了對香豆酸的合成，為下一步咖啡酸、阿魏酸等酚酸類物質(zhì)提供足夠的前體物質(zhì)，也為苯丙烷代謝途徑中黃酮類物質(zhì)的生成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。這些多酚代謝關(guān)鍵酶活力提高的原因可能是酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)由氫鍵、范德華力和離子鍵等來維持，磁場處理后，種子細(xì)胞中大量的帶電離子和極性分子重新組合，加速酶分子氫鍵的合成，改變酶的空間結(jié)構(gòu)，從而提高酶活力。此外，在靜磁場的作用下，種子中的水分子和其他化合物水分子相互作用后產(chǎn)生超氧陰離子自由基，這種自由基可以使合成酶的基因活化，從而提高各種酶的活性和合成速度，進(jìn)而改變植物代謝的速率。

圖4 低頻靜磁場處理發(fā)芽玉米多酚含量及關(guān)鍵酶活力變化關(guān)系Fig. 4 Relationship between phenolic contents and key enzyme activities in germinated maize treated with low-frequency static magnetic field

2.5 低頻靜磁場處理對發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)降糖活性的影響

2.5.1 發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)對-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖5可知，低頻靜磁場處理后，發(fā)芽玉米游離酚對-葡萄糖苷酶活性的抑制作用明顯高于結(jié)合酚，在磁場強(qiáng)度為3.5 mT條件下處理60 h，游離酚的-葡萄糖苷酶半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC）為（18.21±0.52）μg/mL，表明此時(shí)游離酚對-葡萄糖苷酶的抑制作用最大，3.5、4.5 mT條件下，結(jié)合酚的-葡萄糖苷酶IC與對照組比存在顯著差異（＜0.05），在3.5 mT條件下處理60 h，結(jié)合酚對-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最大，IC為（52.77±1.85）μg/mL，這與上述多酚含量變化結(jié)果相印證。磁場處理能夠促進(jìn)種子的生長，同時(shí)促進(jìn)多酚的次級代謝，從而影響多酚的含量、種類、結(jié)構(gòu)，提高其對-葡萄糖苷酶的抑制率，說明磁場處理發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)有良好的降糖效果。

圖5 發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig. 5 Effects of phenols on α-glucosidase activity in germinated maize

2.5.2 發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)對-淀粉酶活性的影響

-淀粉酶作用在小腸中是消化碳水化合物的關(guān)鍵酶，由圖6可知，游離酚和結(jié)合酚對-淀粉酶的抑制作用存在明顯差異，隨著磁場處理時(shí)間的延長，游離酚和結(jié)合酚的-淀粉酶IC均呈逐漸下降后上升的變化趨勢。在磁場強(qiáng)度3.5 mT下處理60 h，游離酚的-淀粉酶IC為（35.89±1.46）μg/mL，結(jié)合酚的-淀粉酶IC為（70.49±1.76）μg/mL，與對照組比存在顯著差異（＜0.05）。Worsztynowicz等的研究結(jié)果證明了多酚中酚酸類物質(zhì)是抑制-淀粉酶活力的主要物質(zhì)，磁場處理玉米發(fā)芽提高了其酚酸類物質(zhì)的含量，進(jìn)而提高了其降糖活性。

圖6 發(fā)芽玉米酚類物質(zhì)對α-淀粉酶活性的影響Fig. 6 Effects of phenols on α-amylase activity germinated maize

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在磁場強(qiáng)度3.5 mT條件下處理60 h時(shí)，玉米籽粒的芽長、發(fā)芽率顯著提高，與對照組相比，結(jié)合酚、游離酚含量分別提高72.72%、47.16%，游離酚中丁香酸和對香豆酸含量顯著增加，分別為（206.72±8.26）、（753.20±10.25）μg/g，在此條件下體外降糖實(shí)驗(yàn)效果最佳，游離酚對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的IC分別為（18.21±0.52）、（35.89±1.46）μg/mL，結(jié)合酚對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的IC分別為（52.77±1.85）、（70.49±1.76）μg/mL，低頻靜磁場處理后，多酚代謝關(guān)鍵酶PAL、4CL、C4H活力得到提高。綜上，低頻靜磁場能夠促進(jìn)玉米發(fā)芽，富集酚類物質(zhì)，增強(qiáng)酚類物質(zhì)降糖活性。本研究可為發(fā)芽玉米食品的開發(fā)提供一定的理論參考。