高強(qiáng)度超聲對凡納濱對蝦蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響

戴澤川，毛相朝,2，郝亞楠，李 嬌,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家試點實驗室，海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237）

凡納濱對蝦（）是世界第一大養(yǎng)殖蝦種，產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖蝦總產(chǎn)量的70%，其味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價值，深受消費者喜愛。我國養(yǎng)殖凡納濱對蝦年產(chǎn)量達(dá)170萬 t，已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)。雖然我國對蝦產(chǎn)量大，但是蝦類加工產(chǎn)品的總量低、種類少，并且加工產(chǎn)品大多是以鮮活蝦和冷凍蝦為主的初級加工產(chǎn)品，精深加工產(chǎn)品比例還遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國家。凡納濱對蝦的常見食用方法是熱加工，但是熱加工在殺菌鈍酶的同時對蝦的食用品質(zhì)會造成較大改變，并且熱加工對蝦致敏性的消減效果甚微。非熱加工是一種新興的食品加工技術(shù)，包括超高壓、超聲波、高壓二氧化碳、電離輻射、高壓脈沖電場、等離子體等，符合“最低限度加工”的趨勢，能較大程度保留食品的營養(yǎng)和風(fēng)味，近年來非熱加工對食品致敏性的消減也引起了廣泛關(guān)注。

超聲波是指頻率高于20 kHz的聲波，超聲波在各個領(lǐng)域的應(yīng)用主要是依靠其在介質(zhì)中傳播時產(chǎn)生的空化效應(yīng)，以及伴隨超聲波產(chǎn)生的膨脹、閉合、振蕩等一系列動力學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)低頻高強(qiáng)度的超聲波（20～100 kHz，強(qiáng)度大于10 W/cm）在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾和改變方面中具有廣泛的用途；而在水產(chǎn)加工領(lǐng)域，也已經(jīng)有應(yīng)用超聲波對魚類肌肉蛋白進(jìn)行改性的研究，通過超聲波提高魚類肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度，應(yīng)用于魚糜制品中可以增加產(chǎn)品附加值。目前超聲波在凡納濱對蝦類研究中主要應(yīng)用在殺菌、保鮮和輔助解凍方面，對凡納濱對蝦蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性影響的研究還較少，且鮮見進(jìn)一步闡明其作用機(jī)理的報道。因此，本實驗以凡納濱對蝦為研究對象，通過不同時間的高強(qiáng)度超聲波處理蝦肌肉全蛋白勻漿，觀察超聲波處理對樣品肌肉組織和微觀結(jié)構(gòu)的影響；此外，將高強(qiáng)度超聲處理樣品進(jìn)一步凍干成蝦粉，探究超聲對對蝦蛋白致敏性、二級結(jié)構(gòu)、平均粒徑及其理化和功能特性方面（如總抗氧化能力、游離氨基酸含量和體外蛋白消化率）的影響，為將超聲應(yīng)用于凡納濱對蝦的精深加工提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦（平均體長（8.96±0.47）cm、體質(zhì)量（33.76±1.07）g）購于青島市市南區(qū)團(tuán)島市場。

胰蛋白酶（T8150-10G，250 U/mg）、胃蛋白酶（P8160-10G，250 U/mg）、甲苯胺藍(lán)水溶液 北京索萊寶科技有限公司；EPC-TPM-5蝦原肌球蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）2.0試劑盒 美國Indoor Biotechnologies公司；氨基酸緩沖溶液 日本三菱株式會社；WAKO茚三酮顯色液緩沖溶液R1、R2 日本和光純藥株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002電子天平、DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Elixtm純水機(jī) 美國Millipore公司；pHSJ-4實驗室pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)、L-8900全自動氨基酸分析儀日本Hitachi公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、SDC-6低溫恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZS90納米粒度及Zeta電位儀 英國馬爾文儀器公司；Ni-E電動熒光顯微鏡 日本尼康公司；Nova Nano SEM450掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將新鮮凡納濱對蝦用清水沖洗干凈，放入-20 ℃冰箱12 h致死，并在4 ℃條件下解凍，去頭、尾之后取蝦肉，按照質(zhì)量體積比1∶3將蝦肉與蒸餾水用勻漿機(jī)打勻。超聲處理條件：將上述蝦肉勻漿轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，以超聲功率300 W、超聲頻率20 kHz和超聲強(qiáng)度382 W/cm對對蝦肉勻漿分別超聲處理0（對照）、5、15、25、35 min，超聲探頭直徑為10 mm，用低溫恒溫槽循環(huán)系統(tǒng)控制超聲溫度在20 ℃以下，占空比為50%，超聲2 s間隔2 s。超聲處理后取樣，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察，剩余樣品在-80 ℃冰箱預(yù)凍后，在真空冷凍干燥機(jī)中-50 ℃下干燥48 h，凍干后的樣品在-20 ℃冰箱保存，待下一步檢測。

1.3.2 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考Stratakos等的方法用移液槍將稀釋過的10 μL蝦樣品置于載玻片上，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲苯胺藍(lán)水溶液染色3 min，使用配有數(shù)碼相機(jī)的熒光電動顯微鏡，在20 倍物鏡下觀察蝦樣品肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)。

參考Wang Jia等的方法，將超聲處理后的蛋白樣品冷凍干燥48 h之后，取凍干粉末使用掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)設(shè)置為250 倍，加速電壓為5.00 kV，使用掃描電子顯微鏡自帶軟件進(jìn)行圖像采集。

1.3.3 平均粒徑的測定

稱取蝦粉充分溶于雙蒸水中，調(diào)整蝦粉質(zhì)量濃度至1 mg/mL，使用納米粒度及Zeta電位儀測定平均粒徑，采用protein測定程序，平衡時間3 min，每輪測試10 次，分析蝦粉溶液的粒度分布。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）按照Laemmli的方法進(jìn)行。使用的電泳預(yù)制膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，分別將待測樣品溶液（5 mg/mL）與5×蛋白上樣緩沖液（體積比1∶4）充分混合，并在95 ℃水煮10 min后制成電泳樣品，180 kDa彩虹Marker上樣10 μL，電泳樣品上樣10 μL，先使用80 V電泳20 min，之后調(diào)整電壓到120 V電泳2 h，待電泳結(jié)束后取出預(yù)制膠，在55 ℃下使用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，然后用脫色液（體積分?jǐn)?shù)10%乙酸、體積分?jǐn)?shù)5%乙醇）脫色，直至蛋白質(zhì)條帶清晰。

1.3.5 過敏原檢測

按照Dong Xin等的方法，通過雙夾心法ELISA試劑盒測定蝦中的過敏原原肌球蛋白的含量。

1.3.6 總抗氧化能力測定

參考Nadeem等的研究，采用鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法檢測蝦樣品的總抗氧化能力。FRAP工作液是在室溫下分別將20 mmol/L氯化鐵溶液、300 mmol/L乙酸緩沖液和10 mmol/L 2,4,6-三吡啶--三嗪按體積比1∶1∶10混合而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。將FRAP工作液（180 μL）和蝦蛋白溶液（5 μL 5 mg/mL）分別加入96 孔板的微孔中，在黑暗中37 ℃孵育5 min后，用酶標(biāo)儀在593 nm波長處測定吸光度。以1 000 μmol/L硫酸亞鐵溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定抗氧化活性。

1.3.7 二級結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)劉斌等的方法，使用傅里葉變換紅外光譜儀分析樣品蛋白的二級結(jié)構(gòu)。將干燥后的蝦粉樣品與KBr混合均勻，通過壓片法壓片，以4 cm的分辨率進(jìn)行32 次掃描，采集樣品之前先采集背景，以消除空氣對實驗結(jié)果的影響。樣品的傅里葉變換紅外譜圖采用OMNIC 9.2軟件處理對原圖譜進(jìn)行自動修飾校正，使用PeakFit v4.12軟件對紅外圖譜進(jìn)行基線校正、去卷積、二階導(dǎo)數(shù)處理和高斯擬合，去卷積的參數(shù)控制半峰寬為40.0，增強(qiáng)因子1.9；高斯擬合的子峰在8～10之間。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)分析相應(yīng)波數(shù)處對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)相對含量。

1.3.8 巰基含量測定

巰基含量測定的原理是巰基基團(tuán)與5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng)會生成黃色化合物，其在412 nm波長處有最大吸收峰。參考張自業(yè)和杜琛等的方法并稍作修改進(jìn)行巰基含量的測定。準(zhǔn)確稱取0.2 g蝦粉溶于10 mL磷酸鹽緩沖液中，8 000×、4 ℃離心10 min，取上清液40 μL加入到160 μL緩沖液中（0.01 mol/L乙二胺四乙酸、0.1 mol/L KHPO，pH 6.0），再加入10 μL Ellman試劑（0.01 mol/L 5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、0.01 mol/L KHPO，pH 6.0），充分混合后室溫避光靜置25 min，使用酶標(biāo)儀于412 nm波長處測定吸光度。

1.3.9 游離氨基酸含量的測定

準(zhǔn)確稱取1 g樣品加入至10 mL 0.02 mol/L稀鹽酸溶液，充分均質(zhì)后用冷凍離心機(jī)（5 000 r/min、4 ℃）離心10 min，收集上清液。將剩余殘渣加入至10 mL 0.02 mol/L稀鹽酸中攪拌，再次離心5 min，合并兩次離心上清液，定容至50 mL。定容后移取2 mL樣品溶液，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸溶液，再次離心（5 000 r/min、4 ℃）10 min，然后經(jīng)0.22 μm水相過濾膜過濾，通過L-8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。色譜柱為P/N 855-4507標(biāo)準(zhǔn)蛋白水解分析柱（4.6 mm×60 mm）；流動相為氨基酸緩沖溶液、茚三酮緩沖溶液R1、R2；分離柱溫度：梯度升溫；梯度洗脫；反應(yīng)柱溫度：135 ℃，進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.10 總可溶性蛋白含量測定

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過不同處理的凍干蝦粉樣品0.2 g，溶于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，7 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G250檢測法測定蝦樣品的總可溶性蛋白含量，首先用系列質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取40 μL待測樣品與200 mL考馬斯亮藍(lán)G250充分混合，室溫避光反應(yīng)5 min后，用移液槍吸取200 μL至96 孔板，在595 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品的總可溶性蛋白含量。

1.3.11 體外蛋白模擬消化測定

根據(jù)Hejazi和劉艷美等的方法并加以改進(jìn)，采用胃-胰蛋白酶兩步消化法對蝦粉進(jìn)行體外模擬消化。使用1 mol/L HCl溶液將樣品（20 mL 50 mg/mL）pH值調(diào)至2，將胃蛋白酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，按照樣品與胃蛋白酶100∶1的質(zhì)量比添加胃蛋白酶，37 ℃恒溫?fù)u床中消化3 h，用1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH值至7.6，將胰蛋白酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，按照樣品與胰蛋白酶100∶1的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，37 ℃條件下消化2 h，用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度，體外消化率按下式計算。

式中：為消化前的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為消化后的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并利用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件中Duncan multiple range test法對數(shù)據(jù)間進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對對蝦肌肉提取物微觀結(jié)構(gòu)的影響

Aguilera等指出，結(jié)構(gòu)和功能之間存在聯(lián)系，要想正確分析和控制食物的屬性，對其加工過程中微觀結(jié)構(gòu)的了解至關(guān)重要。本研究使用熒光電動顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察不同超聲時間處理的蝦樣品。通過圖1可以觀察出，未經(jīng)過超聲處理的樣品細(xì)胞組織之間連接緊密，且分布不均勻，超聲5 min的樣品與之相比細(xì)胞組織之間分布松散、空隙增大；隨著超聲時間的延長，樣品組織之間的間隙進(jìn)一步增大，在視野范圍內(nèi)分散得也更加均勻，而超聲25 min和超聲35 min的細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間沒有明顯差異，分布都比較均勻松散。

圖1 不同超聲時間處理蝦樣品的熒光電動顯微鏡圖Fig. 1 Fluorescence electromotive microscopic images of shrimp samples treated with ultrasound

從圖2掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果可以看出，未經(jīng)過超聲處理的樣品顯示出完整、光滑的邊緣，而超聲處理5 min就能明顯觀察到片狀組織碎片的產(chǎn)生；超聲時間延長至15 min可以觀察到更多的碎片，并且開始出現(xiàn)條狀組織碎片；超聲25～35 min可以看到表面出現(xiàn)了不規(guī)則的孔洞，結(jié)構(gòu)被破壞的程度進(jìn)一步加劇，可能是超聲產(chǎn)生的剪切力和空化作用對蝦樣品的微觀結(jié)構(gòu)造成了破壞，且隨著超聲時間的延長破壞程度也增大。

圖2 超聲處理蝦樣品的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of shrimp samples treated with ultrasound

2.2 超聲對對蝦蛋白粒徑的影響

粒徑的變化可以反映出蛋白質(zhì)的聚集程度。由圖3可知，與對照組相比，超聲處理5 min后，平均粒徑從（268.70±3.70）nm下降到（153.90±2.67）nm，說明超聲波處理可以顯著減小蛋白質(zhì)的平均粒徑，這是超聲過程中的空化泡破裂產(chǎn)生的機(jī)械力高速剪切，使得蛋白質(zhì)溶液變得更均勻。超聲波處理25 min后，平均粒徑降至（112.40±3.00）nm，隨著處理時間的繼續(xù)延長，平均粒徑變化不顯著，超聲35 min時平均粒徑甚至略有上升，這可能是過度超聲處理使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子之間非共價鍵被破壞，形成新的化學(xué)鍵，使得相互作用力增加，從而使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。孫攀研究超聲處理對金槍魚肌原纖維蛋白粒徑的影響，也發(fā)現(xiàn)在超聲18 min時蛋白的平均粒徑降低28%，但是延長超聲時間至24 min時，粒徑反而增加。此外，葉鈺等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以使蛋清蛋白部分蛋白質(zhì)分子平均粒徑變小，還可以使整體粒徑分布范圍變窄，均勻度提高；而蛋白平均粒徑的降低，從理論上可以增加蛋白的消化率。

圖3 超聲對對蝦蛋白粒徑的影響Fig. 3 Influence of ultrasound on the particle size of shrimp proteins

2.3 超聲對對蝦原肌球蛋白含量的影響

原肌球蛋白（34～36 kDa）是對蝦的主要過敏原，具有一定的熱穩(wěn)定性。Shriver等分別用煮沸和脈沖紫外光處理大西洋白蝦，發(fā)現(xiàn)用脈沖紫外光處理大西洋白對蝦4 min可以使蝦原肌球蛋白的反應(yīng)原性和免疫球蛋白E結(jié)合水平降低，而煮沸反而會增加原肌球蛋白和免疫球蛋白E的結(jié)合能力。由圖4可知，35 kDa處蛋白電泳條帶隨著超聲時間的延長顏色逐漸變淺，說明超聲處理后35 kDa處原肌球蛋白含量隨處理時間的延長呈下降趨勢。由圖5可知，經(jīng)ELISA定量分析，隨著超聲時間的延長，原肌球蛋白含量從對照組的（2.09±0.08）ng/mg降低至超聲處理25 min后的（0.81±0.06）ng/mg（＜0.05），在超聲35 min時原肌球蛋白的含量降到最低（（0.78±0.08）ng/mg），降低了62.68%，表明超聲波可以顯著降低原肌球蛋白含量，進(jìn)而降低對蝦致敏性，這可能是高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的空化作用以及引入的自由基攻擊原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)所致。Liu Guangxian等研究了超聲處理對乳糖蛋白致敏性的消減作用，結(jié)果表明，經(jīng)超聲處理后乳糖蛋白抗原性出現(xiàn)一定程度降低，且隨著超聲處理時間的延長乳糖蛋白抗原性不斷降低，本研究結(jié)果與之相符。

圖4 超聲處理對蝦蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE patterns of shrimp proteins subjected to ultrasonic treatment

圖5 超聲對對蝦樣品原肌球蛋白含量的影響Fig. 5 Influence of ultrasonic treatment on tropomyosin content in shrimp samples

2.4 超聲對對蝦肌肉蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

采用傅里葉變換紅外光譜分析不同超聲時間處理對對蝦肌肉蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。對于酰胺I區(qū)，不同的波數(shù)范圍對應(yīng)不同的二級結(jié)構(gòu)，其中1 600～1 640 cm對應(yīng)-折疊，1 640～1 650 cm對應(yīng)無規(guī)卷曲，1 650～1 660 cm對應(yīng)-螺旋，1 660～1 700 cm對應(yīng)-轉(zhuǎn)角，通過Peakfit 4.12軟件擬合可以得到蝦蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量。從圖6和圖7可以看出，隨著超聲時間的延長，無規(guī)卷曲相對含量明顯減少，而-轉(zhuǎn)角和-折疊相對含量總體有所增加，表明超聲波處理使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中部分無規(guī)卷曲向-轉(zhuǎn)角和-折疊轉(zhuǎn)化，這與Jiang Lianzhou等研究超聲波處理對黑豆蛋白二級結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果一致。-轉(zhuǎn)角是對蝦蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分，經(jīng)過超聲之后其相對含量較對照組略有增加，而-螺旋相對含量的變化隨著超聲時間的延長而減少，這使得蛋白二級結(jié)構(gòu)趨向于展開，這與Yang Xue等研究300 W超聲波處理使大米蛋白二級結(jié)構(gòu)-螺旋向-折疊轉(zhuǎn)化的結(jié)果相符。綜上，超聲處理可以使蝦蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從無規(guī)卷曲、-螺旋向-折疊和-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化。

圖6 超聲對對蝦蛋白傅里葉變換紅外光譜的影響Fig. 6 FTIR spectra of shrimp proteins treated by ultrasound

圖7 超聲對對蝦蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 7 Influence of ultrasonic treatment on secondary structure of shrimp proteins

2.5 超聲對對蝦肌肉蛋白巰基含量的影響

巰基基團(tuán)屬于弱二級鍵，可以參與次級鍵的形成，起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的作用，巰基含量和表面疏水性的變化在一定程度上可以揭示蛋白三級結(jié)構(gòu)的改變。從圖8可以看出，蝦肉中巰基含量隨著超聲時間的延長逐漸增加，當(dāng)超聲處理35 min時，巰基含量從對照組的19.52 μmol/g顯著提高到25.81 μmol/g。巰基含量的增加可能是超聲產(chǎn)生的空化作用破壞了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)趨向于延伸和展開，導(dǎo)致在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基等疏水基團(tuán)暴露；也可能是超聲波在液體介質(zhì)傳播中產(chǎn)生的剪切力和湍流作用導(dǎo)致蝦肉蛋白中二硫鍵斷裂，從而產(chǎn)生了新的巰基。

圖8 超聲處理對對蝦樣品巰基含量的影響Fig. 8 Influence of ultrasonic treatment on sulfhydryl content of shrimp samples

2.6 超聲對對蝦樣品總抗氧化能力的影響

圖9反映了超聲波處理對對蝦蛋白抗氧化能力的影響。對蝦蛋白的總抗氧化能力隨著超聲處理時間的延長而逐漸增加，超聲35 min時，從（24.61±1.14）μmol/100 mg增加到（47.76±1.64）μmol/100 mg，表明長時間的高強(qiáng)度超聲處理有利于增加蝦樣品的抗氧化能力。Abid等的研究結(jié)果表明超聲處理能顯著提高蘋果汁的自由基清除能力，超聲處理后蘋果汁總抗氧化能力顯著提高，這是由于超聲波的機(jī)械作用增加了果汁中抗壞血酸和多酚類化合物的提取率和有效性。因此，推測超聲波處理也可能提高了蝦肌肉提取物中抗氧化活性物質(zhì)的提取率，導(dǎo)致對蝦樣品的總抗氧化能力提高；除此之外，Alicia等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過熱超聲處理的黑莓汁與普通巴氏殺菌黑莓汁相比，抗氧化活性和滅酶能力顯著提高。由此推斷，在超聲波處理的過程中一些與氧化反應(yīng)相關(guān)的酶（如多酚氧化酶）由于超聲的空化作用引入自由基攻擊而失活，這也可能會增加樣品的總抗氧化能力。

圖9 超聲對對蝦樣品總抗氧化能力的影響Fig. 9 Influence of ultrasonic treatment on total antioxidant capacity of shrimp samples

2.7 超聲對對蝦肌肉提取物游離氨基酸含量的影響

凡納濱對蝦具有較好的營養(yǎng)保健價值，蝦肉中含有18 種氨基酸，其中必需氨基酸占比達(dá)到近40%。通過表1可以看出，隨著超聲波處理時間的延長，部分游離氨基酸的含量明顯增加，這是超聲波的空化效應(yīng)及伴隨其產(chǎn)生的機(jī)械作用和瞬時高溫高壓破壞了蛋白質(zhì)肽鏈，以及對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞可能使更多酶作用位點暴露所致。其中甘氨酸、天冬氨酸等呈鮮味的氨基酸含量增加較多，脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸等和甘味相關(guān)的氨基酸含量也明顯提高。同時發(fā)現(xiàn)，一些人體必需氨基酸如賴氨酸、甲硫氨酸的含量明顯增加，其在人體中可以起到抗氧化和增強(qiáng)免疫力的作用，精氨酸含量的增加對人體代謝具有積極的作用，它能催化鳥氨酸循環(huán)的進(jìn)行、促進(jìn)尿素的形成，從而使人體內(nèi)的氨變成無毒尿素，這些必需游離氨基酸含量的增加從理論上可以提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。

表1 超聲對對蝦樣品游離氨基酸含量的影響Table 1 Effect of ultrasonic treatment on the contents of free amino acids in shrimp samples mg/g

2.8 超聲對對蝦可溶性蛋白含量及體外消化率的影響

由表2可知，長時間的超聲處理降低了對蝦樣品的總可溶性蛋白含量，經(jīng)過超聲處理35 min后對蝦樣品的總可溶性蛋白含量從（331.83±7.75）mg/g顯著降低到（232.29±9.47）mg/g（＜0.05）。Kang Dacheng等發(fā)現(xiàn)20 kHz超聲波處理30～120 min后，牛肉的總可溶性蛋白含量會顯著降低，這可能與超聲波處理后超聲空化泡破裂產(chǎn)生的強(qiáng)微射流作用于蛋白質(zhì)，導(dǎo)致其氫鍵和肽鏈斷裂有關(guān)，同時由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，埋藏在內(nèi)部的疏水性基團(tuán)更多暴露在表面，這也導(dǎo)致了可溶性蛋白含量的降低。經(jīng)過超聲處理5 min后的蝦肌肉提取物體外消化率與對照組相比有所提高，超聲15 min時顯著提高到78.13%，超聲35 min時消化率顯著提高到81.97%。根據(jù)Dong Xin等的研究，高強(qiáng)度超聲處理20 min能顯著增加蝦樣品的體外消化率，超聲波處理使蛋白質(zhì)構(gòu)象展開和平均粒徑降低，可以提高體外蛋白消化率；Jia Junqiang等也發(fā)現(xiàn)，在20 kHz、1 500 W、20 min超聲處理條件下脫脂小麥胚芽蛋白肽的酶解消化率提高到21.0%，這可能是超聲波的微射流和空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，使蛋白質(zhì)構(gòu)象從卷曲和緊密折疊到趨向于展開，增加了和酶反應(yīng)的活性位點數(shù)量和空間，從而進(jìn)一步增加了消化率。

表2 超聲對對蝦可溶性蛋白含量和體外消化率的影響Table 2 Effect of ultrasonic treatment on solubility and in vitro digestibility of shrimp proteins

3 結(jié) 論

本研究以凡納濱對蝦為研究對象，通過超聲波處理凡納濱對蝦肌肉全蛋白提取物，探究高強(qiáng)度超聲對凡納濱對蝦蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果表明，高強(qiáng)度的超聲波處理可以改變凡納濱對蝦的微觀結(jié)構(gòu)，同時顯著降低原肌球蛋白含量；經(jīng)高強(qiáng)度超聲處理后凡納濱對蝦蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，無規(guī)卷曲相對含量明顯減少，-螺旋相對含量略有降低，-折疊和-轉(zhuǎn)角相對含量增加；高強(qiáng)度超聲還可以影響凡納濱對蝦的理化和功能特性，提高其抗氧化能力和游離氨基酸含量；同時蛋白平均粒徑也隨著超聲時間的延長而減小，體外蛋白消化率則會因為超聲處理而增加，表明高強(qiáng)度超聲處理產(chǎn)生的空化作用、剪切力和湍流力等作用對蝦肌肉蛋白產(chǎn)生影響，可以有效降低蝦蛋白的致敏性，改變蝦蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性以及提高其潛在的營養(yǎng)價值。