馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性動態(tài)監(jiān)測及藥效驗證

路粉，孟潤杰，吳杰，趙建江，李洋，畢秋艷，韓秀英，李敬華，王文橋?

1河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實驗室，河北保定 071000；2保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北保定 071051；3濱州職業(yè)學(xué)院，山東濱州 256603

0 引言

【研究意義】由致病疫霉（）引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，該病發(fā)生范圍廣、流行速度快，大流行時可造成馬鈴薯減產(chǎn) 20%—50%，嚴(yán)重制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。我國對馬鈴薯晚疫病的防治主要依賴化學(xué)防治，抗藥性的產(chǎn)生是馬鈴薯晚疫病化學(xué)防治中的重要問題。從20世紀(jì) 90年代初開始我國大量使用霜脲氰·代森錳鋅防治馬鈴薯晚疫病，至今已有20余年歷史。明確馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰（cymoxanil）的抗性動態(tài)和霜脲氰及其混劑的田間防治效果，分析晚疫病菌對霜脲氰的敏感性變化與其田間防治效果之間的關(guān)系，對晚疫病防治中合理選藥用藥具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生產(chǎn)中主要采用抗病育種、化學(xué)防治和生物防治等措施防治馬鈴薯晚疫病?；瘜W(xué)防治具有防治效果高、見效快等特點(diǎn)，常用藥劑除了代森錳鋅、百菌清、氟啶胺等非內(nèi)吸性殺菌劑外，還有苯基酰胺類甲霜靈、精甲霜靈，苯甲酰胺類氟吡菌胺，乙酰基肟類霜脲氰，氨基甲酸酯類霜霉威，QoI類嘧菌酯、吡唑醚菌酯、噁唑菌酮，羧酸酰胺類烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、氟嗎啉和哌啶基噻唑異噁唑啉類氟噻唑吡乙酮等多種內(nèi)吸性殺菌劑及混劑。據(jù)報道，馬鈴薯晚疫病菌已對甲霜靈、精甲霜靈和氟吡菌胺等藥劑產(chǎn)生了不同水平的抗性。霜脲氰是 1976年由美國杜邦公司（現(xiàn)為科迪華農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司）開發(fā)，對植物病原卵菌具有良好防治效果。霜脲氰對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的抑制活性明顯高于對孢子囊釋放游動孢子、孢子囊和休止孢萌發(fā)的抑制活性，并且可以抑制馬鈴薯晚疫病菌RNA和DNA的合成，但具體作用機(jī)理尚不明確。SUJKOWSKI等發(fā)現(xiàn)墨西哥 75株馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰均表現(xiàn)敏感；HAMLEN等研究發(fā)現(xiàn)，在霜脲氰應(yīng)用 16年后，全球范圍采集的238株馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的敏感性未下降；PéREZ等研究發(fā)現(xiàn)，在多年使用精甲霜靈混劑和霜脲氰混劑防治馬鈴薯晚疫病的秘魯和厄瓜多爾采集的58株晚疫病菌對精甲霜靈產(chǎn)生高抗，而對霜脲氰明顯較為敏感；王文橋等通過紫外誘變和藥劑馴化均未獲得馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的抗性突變體；袁善奎等研究表明，在內(nèi)蒙古和黑龍江應(yīng)用霜脲氰近 10年后，未檢測到對其敏感性下降的馬鈴薯晚疫病菌菌株，通過紫外誘變也未獲得抗性突變體；王晨等檢測發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯晚疫病菌51個黑龍江菌株中有10個菌株對霜脲氰低抗，1個菌株中抗，其余為敏感菌株。此外，意大利和法國應(yīng)用霜脲氰與銅制劑或代森錳鋅混劑防治葡萄霜霉病20多年，檢測發(fā)現(xiàn)葡萄霜霉病菌（）對霜脲氰的敏感性呈輕微下降趨勢?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】河北、內(nèi)蒙古和吉林一季作馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)使用霜脲氰及混劑防治晚疫病已有20余年，近年來晚疫病菌對霜脲氰的敏感性變異和霜脲氰單劑及其混劑對晚疫病的田間防治效果尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】檢測2011—2019年采自河北、內(nèi)蒙古和吉林北方一季作區(qū)的824株馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的敏感性，通過比較不同年份和不同省（自治區(qū)）采集分離的菌株對霜脲氰的平均EC、平均抗性倍數(shù)、抗性頻率和抗性指數(shù)，分析馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性發(fā)展動態(tài)；通過田間藥效試驗，驗證霜脲氰單劑及其混劑對馬鈴薯晚疫病的防治效果，為馬鈴薯晚疫病菌的抗藥性治理和馬鈴薯晚疫病的高效化學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2011—2019年，于河北省承德市圍場滿族蒙古族自治縣（簡稱圍場縣）和張家口市沽源縣、張北縣，內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟多倫縣、赤峰市喀喇沁旗和呼倫貝爾市海拉爾區(qū)及吉林省松原市寧江區(qū)、延邊朝鮮族自治州敦化市，每個市（縣）選擇 3—5個馬鈴薯集中種植區(qū)采集新鮮馬鈴薯晚疫病病葉，共分離鑒定到824個菌株（表1）。

表1 2011—2019年河北、內(nèi)蒙古和吉林馬鈴薯晚疫病菌菌株采集分離情況Table 1 Strains of P. infestans of potato collected and separated in Hebei, Inner Mongolia and Jilin from 2011 to 2019

1.1.2 供試馬鈴薯 田間種植感病品種‘費(fèi)烏瑞它’用于藥效試驗。

1.1.3 供試藥劑 95%霜脲氰原藥，上海杜邦農(nóng)化有限公司（現(xiàn)為科迪華農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司）。將原藥用丙酮溶解，加入無菌水將其制備成1 g·L母液，用于馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的敏感性測定。20%霜脲氰SC，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；80%代森錳鋅 WP，美國陶氏益農(nóng)公司（現(xiàn)為科迪華農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司）；72%霜脲氰·代森錳鋅WP，美國杜邦公司（現(xiàn)為科迪華農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司）；52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG，甘肅華實農(nóng)業(yè)科技有限公司；68%精甲霜靈·代森錳鋅WG，先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司。用于田間藥效試驗。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（rye sucrose agar，RSA）：黑麥70 g，蔗糖20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的敏感性測定 將1.1.3中制備好的霜脲氰母液用無菌水系列稀釋后定量加入RSA培養(yǎng)基中，制成含霜脲氰為1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg·mL的平板并設(shè)空白對照和溶劑對照，采用菌絲生長速率法檢測晚疫病菌對霜脲氰的敏感性。

1.2.2 馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的敏感型劃分和抗性指數(shù)計算 參照馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰敏感基線（（0.20±0.06）μg·mL），按照“馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測技術(shù)規(guī)程（DB13/T 1420—2011）”的分級標(biāo)準(zhǔn)劃分晚疫病菌各菌株對供試藥劑的抗性等級并計算抗性倍數(shù)，參考ZHAO等的方法計算抗性指數(shù)。

1.2.3 殺菌劑田間藥效試驗 河北省圍場縣克勒溝鎮(zhèn)孢子溝村馬鈴薯種植區(qū)長期使用霜脲氰混劑等殺菌劑防治晚疫病，該地晚疫病菌對霜脲氰表現(xiàn)為敏感和低抗。2018—2019年在該地開展霜脲氰單劑及其與代森錳鋅或噁唑菌酮混劑對晚疫病田間藥效驗證試驗，施藥劑量參考各藥劑的推薦劑量，試驗共設(shè)5個藥劑處理，設(shè)清水為對照（表2）。晚疫病零星發(fā)生時，采用背負(fù)式手動噴霧器（新加坡利農(nóng)，Jacto-HD 400型）進(jìn)行莖葉噴施，施藥量900 L·hm，共施藥3次，間隔期7 d。每處理4次重復(fù)，小區(qū)面積為100 m，采用隨機(jī)區(qū)組排列。

表2 霜脲氰等5種藥劑田間藥效試驗施藥劑量Table 2 The recommended dosages of cymoxanil and the other four fungicides in field efficacy trial

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 按照“農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則（一）殺菌劑防治馬鈴薯晚疫?。℅B/T17980.34—2000）”的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病害級別，計算病情指數(shù)與防治效果。施藥前調(diào)查病情基數(shù)，因極零星發(fā)病，病情基數(shù)視為0。

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件進(jìn)行分析，采用最小顯著性差異法（LSD）對供試菌株平均EC、平均抗性倍數(shù)及田間試驗各處理防治效果進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性發(fā)生的時間動態(tài)

2011—2019年從河北、內(nèi)蒙古和吉林馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集分離到的824株晚疫病菌對霜脲氰較為敏感，2011和2017年僅檢測到敏感菌株，2012—2016年和2018—2019年檢測到敏感和低抗菌株，未檢測到中抗和高抗菌株。2011—2019年中每年采集分離到的菌株對霜脲氰的平均 EC為 0.06—0.44 μg·mL，平均抗性倍數(shù)為0.29—2.18，2012—2016年抗性菌株頻率為1.90%—58.57%，2018年和2019年抗性菌株頻率分別為20.83%和88.14%，抗性指數(shù)為0.25—0.47。晚疫病菌對霜脲氰的平均EC、平均抗性倍數(shù)、抗性頻率和抗性指數(shù)隨著監(jiān)測年限不斷波動，整體上呈現(xiàn)先增長后下降再增長的低位平穩(wěn)趨勢（表3）。

表3 2011—2019年河北、內(nèi)蒙古和吉林馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的抗性時間動態(tài)Table 3 Temporal dynamics of resistance of P. infestans to cymoxanil in Hebei, Inner Mongolia and Jilin from 2011 to 2019

2011—2019年河北、內(nèi)蒙古和吉林3個地區(qū)晚疫病菌對霜脲氰的平均EC分別為0.05—0.47、0.07—0.40 和 0.06—0.44 μg·mL，平均抗性倍數(shù)分別為 0.25—2.35、0.33—1.98和0.28—2.18，抗性指數(shù)分別為0.25—0.48、0.25—0.48和 0.25—0.44。2011、2014和 2017年在河北僅檢測到敏感菌株，其他年份抗性菌株頻率為5.77%—90.48%；2011、2016和2017年在內(nèi)蒙古僅檢測到敏感菌株，其他年份抗性菌株頻率為4.17%—90.00%；2011、2016和2017年在吉林僅檢測到敏感菌株，其他年份抗性菌株頻率為 2.70%—77.78%（圖1）。

圖1 2011—2019年河北、內(nèi)蒙古和吉林馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的敏感性變異動態(tài)Fig. 1 Sensitivity variation dynamics of P. infestans to cymoxanil in Hebei, Inner Mongolia and Jilin from 2011 to 2019

2.2 馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性發(fā)生的空間動態(tài)

河北、內(nèi)蒙古和吉林 3個地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的平均 EC分別為 0.18、0.18、0.17 μg·mL，平均抗性倍數(shù)分別為 0.91、0.90、0.85，抗性菌株頻率分別為22.22%、18.75%、16.61%，抗性指數(shù)分別為0.31、0.30、0.29。3個地區(qū)之間晚疫病菌對霜脲氰的平均EC和平均抗性倍數(shù)無顯著性差異，河北晚疫病菌抗性菌株頻率高于內(nèi)蒙古和吉林，3個地區(qū)晚疫病菌對霜脲氰抗性指數(shù)相近，均處于低位（表4）。

表4 河北、內(nèi)蒙古和吉林馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的抗性空間動態(tài)Table 4 Spatial dynamics of resistance of P. infestans to cymoxanil in Hebei, Inner Mongolia and Jilin

2.3 殺菌劑田間防治效果

2018年田間藥效試驗結(jié)果顯示20%霜脲氰SC、72%霜脲氰·代森錳鋅 WP和 52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG對馬鈴薯晚疫病的防治效果為81.5%—83.9%，顯著高于80%代森錳鋅WP的防治效果（76.9%）。80%代森錳鋅WP的防治效果顯著高于68%精甲霜靈·代森錳鋅WG的防治效果（61.8%）。2019年田間藥效試驗結(jié)果顯示72%霜脲氰·代森錳鋅WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰 WG對馬鈴薯晚疫病的防治效果分別為87.1%和85.2%，顯著高于20%霜脲氰SC的防治效果（81.8%）。20%霜脲氰SC的防治效果顯著高于80%代森錳鋅 WP的防治效果（79.4%）。80%代森錳鋅WP對晚疫病的防治效果顯著高于68%精甲霜靈·代森錳鋅WG的防治效果（69.3%）（表5）。

表5 霜脲氰及其混劑對馬鈴薯晚疫病的田間防治效果Table 5 Control efficacy of cymoxanil and the mixed fungicides containing cymoxanil in controlling potato late blight in the fields

3 討論

3.1 馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性變異時空動態(tài)

河北、內(nèi)蒙古和吉林北方馬鈴薯一季作區(qū)使用霜脲氰混劑防治晚疫病逾20年，在2011和2017年僅檢測到敏感菌株，2012—2016年和2018—2019年檢測到敏感和低抗菌株，與王晨等對黑龍江省的檢測結(jié)果較為一致。不同年度間晚疫病菌對霜脲氰抗性頻率和抗性指數(shù)雖有波動，但整體上抗性水平和抗性指數(shù)維持低位。國內(nèi)外及本研究抗性監(jiān)測結(jié)果均表明馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性發(fā)展緩慢，印證了室內(nèi)致病疫霉對霜脲氰抗性風(fēng)險低的評估結(jié)果。究其原因，可能是由于霜脲氰對馬鈴薯晚疫病菌作用機(jī)制獨(dú)特，且與生產(chǎn)中現(xiàn)用的嘧菌酯、烯酰嗎啉和氟噻唑吡乙酮等高效藥劑及已產(chǎn)生抗性問題的甲霜靈和氟吡菌胺之間不存在交互抗性，導(dǎo)致晚疫病菌對霜脲氰不容易產(chǎn)生抗性。另外，還可能與生產(chǎn)中普遍采用霜脲氰與持效期較長的其他殺菌劑（代森錳鋅、噁唑菌酮等）混用，并與100 g·L氰霜唑SC、50%氟啶胺SC、687.5 g·L氟吡菌胺·霜霉威SC、50%烯酰嗎啉WP、69%烯酰嗎啉·代森錳鋅WG和23.4%雙炔酰菌胺SC等多種作用機(jī)理的高效殺菌劑交替使用，降低了霜脲氰使用頻率及其對晚疫病菌群體的選擇壓力有關(guān)。

3.2 霜脲氰及其混劑對馬鈴薯晚疫病田間藥效驗證

對于已知作用靶標(biāo)位點(diǎn)藥劑的抗性研究，可通過比較抗性菌株與敏感菌株藥劑作用靶標(biāo)位點(diǎn)是否發(fā)生氨基酸突變進(jìn)行驗證。霜脲氰直接作用機(jī)理不清，田間馬鈴薯晚疫病菌對其是否產(chǎn)生抗性只能通過田間藥效試驗驗證。

河北省圍場縣為我國北方一季作馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，當(dāng)?shù)赝硪卟【鷮姿`抗性菌株出現(xiàn)頻率高達(dá)100%，且均為高抗菌株。目前生產(chǎn)中，每個生長季防治晚疫病用藥4—6次，主要采用代森錳鋅、氫氧化銅、烯酰嗎啉、霜脲·錳鋅、氟吡菌胺·霜霉威、噁唑菌酮·霜脲氰等藥劑交替使用。河北省圍場縣克勒溝鎮(zhèn)孢子溝村馬鈴薯種植區(qū)晚疫病菌在 2011—2019年僅檢測到對霜脲氰的敏感菌株和低抗菌株，未發(fā)現(xiàn)中高抗菌株。在該地進(jìn)行霜脲氰及其混劑對晚疫病的田間藥效試驗，發(fā)現(xiàn) 20%霜脲氰 SC、72%霜脲氰·代森錳鋅 WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG對馬鈴薯晚疫病防治效果良好，與該試驗點(diǎn)晚疫病菌對霜脲氰較為敏感的抗性監(jiān)測結(jié)果一致。對照藥劑 68%精甲霜靈·代森錳鋅WG對馬鈴薯晚疫病的防治效果較差，亦與該試驗點(diǎn)晚疫病菌對甲霜靈產(chǎn)生高抗的監(jiān)測結(jié)果一致。田間藥效試驗結(jié)果表明 20%霜脲氰 SC、72%霜脲氰·代森錳鋅WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG在甲霜靈高抗地區(qū)可替代 68%精甲霜靈·代森錳鋅 WG防治馬鈴薯晚疫病。

3.3 馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性風(fēng)險管理策略

室內(nèi)試驗或應(yīng)用霜脲氰混劑防治馬鈴薯晚疫病的田間實踐均表明霜脲氰用于馬鈴薯晚疫病防治存在較低抗性風(fēng)險，與殺菌劑抗性行動委員會（FRAC）將霜脲氰列為中低抗性風(fēng)險藥劑一致。但是，馬鈴薯晚疫病菌被認(rèn)定為中抗性風(fēng)險病原菌，本文研究結(jié)果及王晨等的研究顯示在我國河北、內(nèi)蒙古、吉林和黑龍江等北方馬鈴薯一季作區(qū)已出現(xiàn)對霜脲氰的低抗及極少數(shù)中抗晚疫病菌菌株，因此不能忽視馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的抗性風(fēng)險管理。建議繼續(xù)監(jiān)測馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰的抗性動態(tài)；在掌握田間抗性發(fā)展動態(tài)基礎(chǔ)上，推廣應(yīng)用霜脲氰與嘧菌酯、烯酰嗎啉、氟吡菌胺、氰霜唑和氟噻唑吡乙酮等新型高效藥劑的混劑，并將72%霜脲氰·代森錳鋅WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG等混劑與嘧菌酯、烯酰嗎啉、氟噻唑吡乙酮、氰霜唑和氟吡菌胺·霜霉威等新型高效藥劑交替使用，避免在發(fā)病較重時鏟除性施藥；限制每個生長季節(jié)每種中高抗性風(fēng)險藥劑的使用不超過兩次；開展以利用抗性品種、高壟大畦栽培和交替、混合使用不同作用機(jī)制藥劑為核心措施的綜合防治，減少霜脲氰等內(nèi)吸性藥劑的使用頻率，降低抗性選擇壓。

4 結(jié)論

河北、內(nèi)蒙古和吉林北方一季作區(qū)馬鈴薯晚疫病菌群體對霜脲氰敏感性下降緩慢，總體上保持敏感，抗性水平較低。不同年份間晚疫病菌對霜脲氰抗性頻率波動很大，抗性指數(shù)波動平緩，長期處于低位。不同地區(qū)間河北晚疫病菌對霜脲氰抗性頻率高于內(nèi)蒙古和吉林，3個地區(qū)抗性指數(shù)相近。馬鈴薯晚疫病菌對霜脲氰抗性監(jiān)測結(jié)果與霜脲氰單劑及其與代森錳鋅或噁唑菌酮混劑對晚疫病藥效驗證結(jié)果較為一致。在馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈和精甲霜靈產(chǎn)生抗性的地區(qū)，霜脲氰單劑及72%霜脲氰·代森錳鋅WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰 WG等霜脲氰混劑可作為精甲霜靈·代森錳鋅的替代藥劑使用。