IL-15過(guò)表達(dá)對(duì)豬骨骼肌細(xì)胞成肌分化的影響

邢明杰，顧憲紅，王梟鴻，郝月

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

0 引言

【研究意義】肉類是人類最重要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一，其含有脂肪、維生素和大量的礦物質(zhì)元素，在維持人類的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和健康中發(fā)揮著重要作用。骨骼肌的質(zhì)量約占機(jī)體體重的40%—50%，因此肌肉細(xì)胞的分化和增殖與豬的生長(zhǎng)速度密切相關(guān)。我國(guó)是世界上最大的肉類消費(fèi)國(guó)，生豬的產(chǎn)量占世界的一半，豬肉消費(fèi)量更是占世界的46%。在過(guò)去的幾十年里，提高生豬生長(zhǎng)速度和肌肉質(zhì)量一直是養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要關(guān)注點(diǎn)。而骨骼肌的生長(zhǎng)和發(fā)育直接影響豬肉的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此了解骨骼肌的生長(zhǎng)機(jī)制十分重要。【前人研究進(jìn)展】骨骼肌不僅是最大的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，還是一種內(nèi)分泌器官，它在收縮過(guò)程中將數(shù)百種肌肉細(xì)胞因子分泌到血液中。其中一些可以通過(guò)內(nèi)自分泌/旁分泌的方式在肌肉細(xì)胞中發(fā)揮局部作用，或以內(nèi)分泌的方式對(duì)遠(yuǎn)處的組織發(fā)揮作用。IL-15作為一種細(xì)胞因子，通過(guò)與IL-15受體特異性結(jié)合，在自身免疫和惡性腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，因此IL-15的失調(diào)會(huì)對(duì)宿主造成不利影響。早期的研究發(fā)現(xiàn)，IL-15是刺激骨骼肌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要合成因子。在肌萎縮和炎性等條件下，IL-15可抑制骨骼肌蛋白質(zhì)的水解，維持骨骼肌的質(zhì)量。同時(shí)，IL-15通過(guò) JAK3/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4（GLUT4）的轉(zhuǎn)錄和膜轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)PPARδ、PGC-1α和PGC-1β的活性，有利于線粒體的生物合成和脂肪酸氧化，從而增強(qiáng)骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。小鼠、人類和牛骨骼肌培養(yǎng)物的研究表明，添加重組IL-15可以誘導(dǎo)肌管的肥大表型，增加收縮蛋白的積累，促進(jìn)肌球蛋白重鏈（MHC）的累積和骨骼肌質(zhì)量的增加。IL-15可以直接作用于已分化的肌管，促進(jìn)肌細(xì)胞的增生和肥大，并調(diào)控骨骼肌蛋白沉積。IL-15參與肌肉與脂肪組織的代謝，QUINN提出IL-15軸信號(hào)可以改變動(dòng)物的胴體組成，是肉類生產(chǎn)和研究的一個(gè)新機(jī)制。隨后印遇龍團(tuán)隊(duì)和陳杰團(tuán)隊(duì)分別在豬體外和體內(nèi)的研究佐證了這一觀點(diǎn)，即IL-15抑制豬胴體脂肪沉積，改變胴體組成，可以作為研究畜牧業(yè)肉品質(zhì)調(diào)控的一個(gè)靶點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于IL-15對(duì)骨骼肌的作用研究主要集中在嚙齒動(dòng)物（小鼠）和人類醫(yī)學(xué)上，且多是通過(guò)外源添加IL-15的方法來(lái)增加其在細(xì)胞中的表達(dá)，而關(guān)于IL-15的表達(dá)對(duì)豬骨骼肌成肌細(xì)胞作用的報(bào)道鮮見(jiàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外誘導(dǎo)成肌分化模型，模擬豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，通過(guò)改變豬骨骼肌成肌細(xì)胞中 IL-15的表達(dá)水平，研究 IL-15的過(guò)表達(dá)對(duì)豬骨骼肌成肌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間及地點(diǎn) 試驗(yàn)于2019年 7—12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2 細(xì)胞株 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離凍存。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO）；熒光倒置顯微鏡（Nikon）；通用酶標(biāo)儀（Biotek）；流式細(xì)胞儀（Miltenyi Biotec）；數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）等。

1.1.4 主要試劑 骨骼肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)基，胎牛血清，山羊血清和 0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RIPA裂解液，電泳液，電轉(zhuǎn)液和 TBS購(gòu)自北京索萊寶公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自晶彩公司；Protease inhibitor cocktail購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒購(gòu)自北京康為公司；RNA快速提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara寶生物公司；All-in-OneTM qPCR Mix，購(gòu)自GeneCopoeia公司；IL-15 ELISA試劑盒購(gòu)自Novus公司；CCK-8試劑盒（Cell counting Kit-8）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；IL-15一抗，caspase-3一抗和α-SMA一抗均購(gòu)自Abcam公司；GAPDH一抗，羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；陰性對(duì)照病毒Ubi-MCS-3FLAG-CBh- gcGFP-IRES-puromycin購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

1.2.1.1 分離培養(yǎng) 將一周齡仔豬動(dòng)脈放血致死，用75%的酒精擦拭全身消毒，無(wú)菌條件下分離仔豬大腿骨骼肌，置于含有雙抗（青霉素-鏈霉素）的 PBS中反復(fù)漂洗3—5次，用眼科剪將組織剪成1 mm大小，加入0.25% Trypsin在37℃水浴條件下消化30 min，然后用完全培養(yǎng)基中和消化液。將所得的組織混合物過(guò)100 μm篩網(wǎng)后，收集濾液進(jìn)行1 500 r/min離心10 min，棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入T-25培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)，每隔24 h換液。

1.2.1.2 誘導(dǎo)分化 取第二代的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種于L-多聚賴氨酸鋪底的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合度為50%—60%左右時(shí)，加入DMEM（低糖）+2%山羊血清的分化培養(yǎng)基，分化5 d。每2—3 d換液，期間不斷觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 過(guò)表達(dá) GV-492-IL-15慢病毒載體的構(gòu)建按照吉?jiǎng)P基因提供的過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建和包裝手冊(cè) Verision4.0（https://www.genechem.com.cn/public/static/uploads/data_download/ 1576639299905887.pdf）的方法構(gòu)建慢病毒過(guò)表達(dá)載體GV-492-IL-15（圖1）。該載體攜帶綠色熒光蛋白（GFP）及HI/I酶切位點(diǎn)。利用限制性內(nèi)切酶獲得線性化載體，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶。設(shè)計(jì)引物（引物信息如表1所示），從吉?jiǎng)P基因公司的質(zhì)粒文庫(kù)中釣取目的基因，目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中目的基因IL-15 GenBank登錄號(hào)為NM_214390。擴(kuò)增后的目的基因產(chǎn)物交換入線性化表達(dá)載體，交換反應(yīng)產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞菌液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取，并送至上海吉?jiǎng)P基因公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中，通過(guò)Western Blot進(jìn)行質(zhì)粒表達(dá)檢測(cè)，最后用實(shí)時(shí)定量 PCR（qRTPCR）法進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)。

圖1 GV492載體圖譜Fig. 1 GV492 vector profiles

表1 PCR引物信息Table 1 The primer information of PCR

1.2.3 IL-15過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染 收獲分化后的豬骨骼肌成肌細(xì)胞，消化后以1.0×10個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日待細(xì)胞貼壁后，換液。加入1 mL完全培養(yǎng)基，再分別加入20 μL對(duì)照慢病毒與GV492-IL-15重組慢病毒（MOI=100），混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，處理細(xì)胞 72 h，形成空白細(xì)胞（Control）、空載體對(duì)照（IL-15-）和轉(zhuǎn)染 GV492-IL-15重組慢病毒（IL-15+）3個(gè)試驗(yàn)處理組。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量 PCR（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞IL-15基因的表達(dá) 使用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min。收集細(xì)胞，檢測(cè)IL-15基因表達(dá)。采用TRNzol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作均按照說(shuō)明書進(jìn)行。使用 NanoDrop?ND-2000測(cè)定RNA濃度和純度之后，進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳。之后采用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。使用Applied Biosystems StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR分析。使用Ct（2）方法計(jì)算相關(guān)RNA表達(dá)。qRT-PCR中使用的所有引物均在北京Invitrogen公司合成，其中序列信息如表2所示。

表2 qRT-PCR引物信息Table 2 The primer information of qRT-PCR

1.2.5 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-15目的蛋白和active caspase-3蛋白的表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡方法根據(jù)文獻(xiàn)[27]的方法操作，將預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，去除多余的培養(yǎng)基，然后用含有蛋白酶抑制劑（PMSF，終濃度為1 mol·L）的裂解液（RIPA）提取蛋白，冰上裂解20 min。將裂解液在4℃下以13 000 r/min離心20 min，收集上清液進(jìn)行分析。用BCA法檢測(cè)上清液中的蛋白濃度。通過(guò)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)（20 μg），并轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)膜完成后以麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察效果并做好標(biāo)記，再用含3%脫脂奶粉室溫輕搖孵育30 min。加入3%脫脂奶粉稀釋的一抗（IL-15，1∶2 000稀釋，active caspase-3，1∶500稀釋），4℃孵育過(guò)夜。隨后與二抗（山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10 000）室溫下輕搖孵育40 min，TBST洗膜6次，每次3 min。Western Blot條帶用ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-15水平 通過(guò)離心法收集培養(yǎng)物上清液的樣品，以 1 500 r/min離心 10 min以除去細(xì)胞碎片。根據(jù)Novus公司說(shuō)明書檢測(cè)上清液中IL-15的含量。加入終止液30 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm的吸光度值，并設(shè)定540 nm或570 nm作為校正波長(zhǎng)。復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。最后通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對(duì)數(shù)與相應(yīng) OD值對(duì)數(shù)生成曲線，通過(guò)回歸分析確定最佳擬合曲線，通過(guò)樣本的OD值，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到樣本中IL-15濃度。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 參考梁亞冰等的方法，使用無(wú) EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌后，以75%的預(yù)冷乙醇固定過(guò)夜，1 000 r/min離心10 min棄乙醇，用含PI 100 μg·mL和RNAase 200μg·mL的染液溫育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞峰，其熒光信號(hào)經(jīng)流式細(xì)胞儀Multicycle細(xì)胞周期分析軟件處理。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用 AnnexinⅤ-PI雙標(biāo)染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。使用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心 5 min。加入1×AnnexinV 結(jié)合液重懸細(xì)胞后加入 5 μL Annexin V-FITC、5μL PI混勻，室溫避光下培養(yǎng)15 min，隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 使用 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。按照說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，細(xì)胞以每孔1×10個(gè)接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，每孔設(shè)置4個(gè)重復(fù)。每孔添加10 μL CCK-8，然后將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)1 h。通過(guò)酶標(biāo)儀分別于4、8、12和24 h讀取450 nm處OD值。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 26.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±SE表示。組間比較使用單因素方差分析，以＜0.05表示差異顯著。文中圖形均采用 GraphPad Prism 8.0（美國(guó)GraphPad Software 公司）繪制。

2 結(jié)果

2.1 豬骨骼肌成肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)成肌分化

取仔豬大腿骨骼肌肉組織進(jìn)行無(wú)菌分離培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行換液，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)（圖2-A、B），細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，可見(jiàn)呈現(xiàn)出梭形或紡錘形態(tài)。隨后加入分化培養(yǎng)基進(jìn)行成肌分化，最終呈現(xiàn)出誘導(dǎo)分化后的管狀細(xì)胞（圖2-C—E）。

圖2 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞及成肌分化Fig. 2 Skeletal muscle satellite cells and differentiated myoblasts

2.2 慢病毒載體的構(gòu)建

將測(cè)序鑒定后正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)可觀察到明顯的熒光（圖3-A），說(shuō)明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常、目的質(zhì)粒熒光標(biāo)記基因表達(dá)正常。經(jīng)Western Blot檢測(cè)，可以觀察到20 kD附近處有明顯特征條帶（圖3-B），其大小和目的基因融合蛋白相吻合。表明質(zhì)粒過(guò)表達(dá)成功。

圖3 目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果Fig. 3 Results of 293T cells transfected with target plasmid

2.3 骨骼肌細(xì)胞鑒定

將分化成熟的成肌細(xì)胞，進(jìn)行α-SMA單克隆抗體免疫熒光染色。視野中90%的細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，胞漿染成紅色，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞（圖4）。

圖4 豬骨骼肌成肌細(xì)胞α-SMA染色鑒定Fig. 4 Identification of porcine skeletal muscle myoblast cells by α-SMA staining

2.4 IL-15目的基因表達(dá)以及IL-15蛋白檢測(cè)

分別用Western Blot和qRT-PCR方法檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)IL-15的蛋白和mRNA表達(dá)。與其他組相比，轉(zhuǎn)染 IL-15病毒組顯示出更高的蛋白和 mRNA表達(dá)（＜0.05，圖5-A—C），證明細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染IL-15過(guò)表達(dá)慢病毒。隨后又用 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-15的分泌情況（圖5-D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著，即目標(biāo)蛋白IL-15沒(méi)有被分泌到細(xì)胞外。

圖5 GV-492-IL-15慢病毒載體的過(guò)表達(dá)Fig. 5 Overexpression effects of GV-492-IL-15

2.5 IL-15過(guò)表達(dá)對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響

通過(guò) CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)等試驗(yàn)進(jìn)一步研究IL-15過(guò)表達(dá)對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖6所示。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-15過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力顯著升高（＜0.05）（圖6-A）。與空白細(xì)胞和空載體組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染IL-15過(guò)表達(dá)慢病毒載體的細(xì)胞，G1期細(xì)胞比例顯著下降，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高（＜0.05，圖6-B）。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)IL-15可促進(jìn)豬骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖。

圖6 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布圖Fig. 6 Cell proliferation and cell cycle distribution diagram

2.6 細(xì)胞凋亡分析

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行Annexin V-FITC/PI測(cè)定，檢測(cè) IL-15的過(guò)表達(dá)對(duì)豬骨骼肌成肌細(xì)胞凋亡水平的影響。其中Q1區(qū)域?yàn)闄C(jī)械損傷細(xì)胞，Q2（FITC+/PI+）區(qū)域?yàn)橥砥诘蛲龌驂乃兰?xì)胞，Q3（FITC+/PI-）區(qū)域?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞，Q4（FITC-/PI-）區(qū)域?yàn)榛罴?xì)胞（圖7-A）。結(jié)果顯示，IL-15的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞早期凋亡的影響差異不顯著，但可以抑制細(xì)胞的晚期凋亡。與對(duì)轉(zhuǎn)染空載體組相比，細(xì)胞凋亡由1.03%下降到 0.04%，且差異極顯著（＜0.001）（圖7-B）。

圖7 細(xì)胞凋亡分析Fig. 7 Apoptosis analysis

隨后又采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的caspase-3蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IL-15的過(guò)表達(dá)使caspase-3蛋白有下降的趨勢(shì)，但差異不顯著（＞0.05）（圖7-D）。

3 討論

骨骼肌不僅是肉類的重要組成部分，其正常的功能對(duì)畜禽的健康也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌還是一種分泌器官。PEDERSEN等將收縮活動(dòng)或其他的刺激下而產(chǎn)生、表達(dá)和釋放的，并發(fā)揮自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌功能的細(xì)胞因子、趨化因子或其他肽（5—20 kD）歸類為“肌肉因子”。最近的研究已經(jīng)確定了600多種的肌肉因子，然而人們對(duì)于這些大多數(shù)肌肉因子的生物活性功能還未充分定性，因此仍需要進(jìn)行廣泛的研究才能深入了解其作用于肌肉的相關(guān)機(jī)制。目前研究比較多的肌肉因子有 IL-6、IL-8、IL-15、Irisin（鳶尾素）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 21（FGF21）等。

3.1 IL-15過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建

在過(guò)去的研究中，研究人員采用直接向培養(yǎng)的細(xì)胞中添加超生理水平的 IL-15進(jìn)行研究。由于IL-15的半衰期比較短（小于 40 min），因此需要不斷向培養(yǎng)物中添加 IL-15才能滿足試驗(yàn)需求，這樣不僅工作量大，還造成試驗(yàn)成本的提高。慢病毒載體則是將目的基因轉(zhuǎn)移并整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的有效工具，它有能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂的和未分裂的細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，因此在細(xì)胞和基因治療中廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)采用吉?jiǎng)P基因研發(fā)的GV492慢病毒載體，構(gòu)建 IL-15過(guò)表達(dá)的慢病載體，轉(zhuǎn)染豬骨骼肌成肌細(xì)胞，利用基因工程體外研究 IL-15的過(guò)表達(dá)對(duì)豬骨骼肌成肌細(xì)胞的影響，也為以后的研究提供思路和原材料。

3.2 IL-15的作用機(jī)理

IL-15是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞因子，與大多數(shù)其他細(xì)胞因子不同的是，IL-15是以分泌形式和細(xì)胞內(nèi)形式發(fā)揮作用的。在正常情況下主要定位在細(xì)胞內(nèi)（包括細(xì)胞核），但是TNF-α的存在以時(shí)間依賴性地誘導(dǎo) IL-15Rα和 IL-15向細(xì)胞核外輸出。TNF抑制染色體區(qū)域維持因子 1（chromosomal region maintenance 1，CRM1）對(duì)IL-15Rα和IL-15的核定位，并且在ADP-核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor 6，ARF6）的參與下促進(jìn)IL-15的胞吐作用。在本試驗(yàn)中用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-15的水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 IL-15慢病毒組細(xì)胞上清液中 IL-15的含量并未發(fā)生顯著變化。這說(shuō)明骨骼肌在正常（未受到不良刺激）生理?xiàng)l件下，IL-15的產(chǎn)生是定位在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮作用的。因此下一步的研究應(yīng)關(guān)注當(dāng)豬骨骼肌細(xì)胞遭受到如TNF-α或其他外界不利刺激時(shí)，IL-15是否會(huì)分泌到細(xì)胞膜外并發(fā)揮作用。

3.3 IL-15對(duì)骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響

骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化是胚胎發(fā)育過(guò)程中骨骼肌正常發(fā)育所需的關(guān)鍵過(guò)程，是產(chǎn)后骨骼肌再生所需的關(guān)鍵過(guò)程，也是損傷或運(yùn)動(dòng)后肌肉修復(fù)的必要條件。IL-15能降低多種類型細(xì)胞的凋亡，如上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，和神經(jīng)元細(xì)胞等，是一種抗凋亡因子（脂肪組織除外）。關(guān)于 IL-15對(duì)骨骼肌凋亡的抑制機(jī)制，通過(guò)試驗(yàn)給荷瘤小鼠施用IL-15，導(dǎo)致TNF-α受體含量顯著減少，提示IL-15可能通過(guò)影響TNF-α信號(hào)來(lái)減少肌肉萎縮過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)損失和細(xì)胞凋亡，保存肌肉質(zhì)量。然而PISTILLI等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向大鼠長(zhǎng)期注射 IL-15可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞凋亡，可能是IL-15 的抗凋亡特性對(duì)細(xì)胞類型或存在的肌肉病理程度具有特異性。在TIE等對(duì)草魚的研究中，將IL-15描述為一種促凋亡因子，然而在試驗(yàn)草魚宰殺后，隨著肌肉細(xì)胞的凋亡并沒(méi)有伴隨有 IL-15轉(zhuǎn)錄水平的升高而增加，說(shuō)明 IL-15在骨骼肌中可能不是促凋亡因子。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-15的過(guò)表達(dá)對(duì)正常骨骼肌細(xì)胞早期凋亡沒(méi)有顯著的影響，但是對(duì)晚期凋亡有明顯的抑制作用，說(shuō)明 IL-15可抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡。隨后檢測(cè)了細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的 caspase-3蛋白的含量變化。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 IL-15過(guò)表達(dá)慢病毒后，caspase-3蛋白的含量變化不大。這可能是由于IL-15對(duì)正常條件下的成肌細(xì)胞的作用有限，只有當(dāng)細(xì)胞受到不良刺激下才會(huì)顯示出顯著的作用。

3.4 IL-15對(duì)骨骼肌細(xì)胞增殖的影響

IL-15最初是基于其支持自然殺傷（NK）T淋巴細(xì)胞增殖而被分離出來(lái)，通過(guò)激活PI3K/Akt、Ras/Raf和JNK/AP1等一系列信號(hào)通路可能有助于IL-15對(duì)細(xì)胞分化和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，IL-15可通過(guò)JAK-STAT通路促進(jìn)成纖維/成脂前體細(xì)胞（FAP）的增殖，其中顯著抑制FAP細(xì)胞的成脂分化，促進(jìn)肌肉慢性損傷后的肌管再生。前人在肌肉細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中觀察到，添加IL-15可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成/降解速率，促進(jìn)肌管的肥大和收縮蛋白的積累，被認(rèn)為是一種合成代謝細(xì)胞因子，不會(huì)刺激成肌細(xì)胞的增殖或分化。而本研究的結(jié)果則顯示，在豬骨骼肌成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá) IL-15基因，可顯著增加細(xì)胞活力。

細(xì)胞增殖和凋亡與細(xì)胞周期息息相關(guān)，已知細(xì)胞周期分為G0/G1、S和G2/M期，G0/G1期為細(xì)胞處于阻留的狀態(tài)，S期為DNA合成時(shí)期，G2/M為有絲分裂期。在本研究中，IL-15的過(guò)表達(dá)阻滯在G0/G1期的成肌細(xì)胞顯著低于對(duì)照組，而處于 S期和 G2/M期的成肌細(xì)胞則顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞顯著增加，在 IL-15的作用下，成肌細(xì)胞分裂速度加快，細(xì)胞周期的分布明顯改變。綜合CCK-8、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的結(jié)果，說(shuō)明過(guò)表達(dá) IL-15基因能夠顯著影響豬骨骼肌成肌細(xì)胞的功能。

4 結(jié)論

本研究分離豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞，并利用轉(zhuǎn)染構(gòu)建的IL-15過(guò)表達(dá)慢病毒載體，成功獲得IL-15過(guò)表達(dá)的豬骨骼肌成肌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在正常生理?xiàng)l件下，IL-15是定位在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮作用的，其過(guò)量表達(dá)可以抑制豬骨骼肌成肌細(xì)胞的晚期凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。研究明確了IL-15對(duì)豬骨骼肌細(xì)胞成肌分化的具體調(diào)控作用，為進(jìn)一步開展 IL-15在豬細(xì)胞成肌分化中的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。