本氏煙NbMBF1c的克隆、表達(dá)及在TMV侵染過程中的功能

溫玉霞，張堅(jiān)，王琴，王靖，裴悅宏，田紹銳，樊光進(jìn)，馬小舟，孫現(xiàn)超

西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715

0 引言

【研究意義】煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬的典型代表種，可侵染十字花科、葫蘆科、茄科等植物并且危害嚴(yán)重。目前對(duì)于TMV的控制多以預(yù)防為主，而挖掘抗TMV的植物基因?qū)τ谶z傳育種至關(guān)重要。多蛋白橋梁因子 1（multiprotein bridging factor 1，MBF1）是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白，在細(xì)胞分化、脂類代謝、激素類物質(zhì)調(diào)節(jié)和組氨酸類物質(zhì)新陳代謝等過程中發(fā)揮重要作用。了解的抗病毒功能，對(duì)于抗病毒植株的遺傳育種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】MBF1是植物體內(nèi)一種非常保守的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生物脅迫與非生物脅迫中發(fā)揮著重要的功能。MBF1蛋白包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，C-末端的螺旋-折疊-螺旋結(jié)構(gòu)域是TBP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且該結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為在整個(gè)物種中都是保守的，N-末端是一個(gè)保守的鋅帶域，能夠與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合。在植物中，MBF1蛋白與植物的生長發(fā)育和響應(yīng)脅迫反應(yīng)相關(guān)。擬南芥中，過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥的早期開花和種子數(shù)量增加；在大豆中過表達(dá)，提高了大豆的產(chǎn)量。對(duì)熱脅迫下擬南芥的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)植株中兩種海藻糖-6-磷酸合成酶的相對(duì)表達(dá)量高于野生型植株，并且在熱脅迫后過表達(dá)植株中響應(yīng)脅迫反應(yīng)的信號(hào)分子海藻糖水平更高，提高了植物對(duì)非生物脅迫的抗性。同時(shí)MBF1蛋白在植物響應(yīng)生物脅迫也具有作用。擬南芥過表達(dá)植株中丁香假單胞菌（）的增殖低于野生型植物。此外，在擬南芥感染灰霉病菌（）后顯著上調(diào)表達(dá)，與野生型植株相比，過表達(dá)后病斑面積更小，并且抗病相關(guān)基因和顯著上調(diào)表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】能對(duì)包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的多種病原物產(chǎn)生抗性，但其對(duì)于病毒侵染是否具有調(diào)控作用尚未報(bào)道。筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，本氏煙（）沉默轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)下調(diào)，但其對(duì)于 TMV侵染的響應(yīng)尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用分子克隆得到全長，并利用生物信息學(xué)手段分析其蛋白特性。構(gòu)建NbMBF1c熒光蛋白融合表達(dá)載體，分析其亞細(xì)胞定位；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的組織表達(dá)與 TMV侵染脅迫表達(dá)，利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)與瞬時(shí)過表達(dá)分析對(duì)于TMV-GFP侵染的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析影響TMV侵染的機(jī)制，為茄科作物抗病毒育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2020—2021年在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫與植物病害生態(tài)防控實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與植物材料 大腸桿菌（）DH5、農(nóng)桿菌（）GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；VIGS沉默載體和煙草花葉病毒熒光標(biāo)記載體 TMV-GFP（pSDK661）由清華大學(xué)劉玉樂教授課題組饋贈(zèng)；pART27-N-eGFP、pART27-N-7*Myc載體由西北農(nóng)林科技大學(xué)單衛(wèi)星教授饋贈(zèng)。本氏煙在恒溫育苗箱中播種（25℃，16 h光照/8 h黑暗，75%相對(duì)濕度），培養(yǎng)至4—6葉期左右備用。

1.1.2 試劑和引物 DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司；TRIZOL、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真酶 PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自寶日醫(yī)生物工程（大連）有限公司；零背景平末端克隆載體Zero Background pTOPO-Blunt購自北京艾德萊生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SYBR Prime qPCR Set購自重慶葆光生物技術(shù)有限公司。引物和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。引物詳見表1。

表1 本研究所用到的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2 NbMBF1c的克隆與分析

使用TRIZOL法提取本氏煙總RNA，操作規(guī)程詳見https://www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/9108-9109.pdf。根據(jù)Sol Genomics Network茄科作物基因組數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）報(bào)道的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增。采用PrimeSTARGXL DNA Polymerase DNA聚合酶擴(kuò)增，操作詳見https://www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/R050A.pdf。將獲得的序列連至Zero Background pTOPO-Blunt并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5，操作方法詳見http://www.aidlab.cn/up_product/big/2017-4-1-10414853596.pdf。將陽性克隆菌液送至上海生工生物測(cè)序獲得序列。

運(yùn)用 ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析NbMBF1c的蛋白理化性質(zhì)，TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/）分析 NbMBF1c的跨膜區(qū)域；SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析NbMBF1c的保守結(jié)構(gòu)域；NCBI Blastp比對(duì)出與NbMBF1c序列相似性較高的其他物種MBF1c蛋白，利用 MEGA X軟件采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，根據(jù)模型推薦，BIC最小為3 741.994時(shí)模型參數(shù)設(shè)置為JTT+G,進(jìn)化樹的檢驗(yàn)使用自展檢驗(yàn)（Bootstrap method）法，檢驗(yàn)次數(shù)1 000次。

1.3 TMV-GFP接種

TMV接種步驟參考文獻(xiàn)[11]。取 0.1 g被TMV-GFP侵染的本氏煙葉片于研缽中，加入石英砂和pH 7.2—7.4的磷酸緩沖液研磨均勻。將獲得的勻漿在5 000×離心機(jī)中離心3 min，取上清進(jìn)行摩擦接種。每片葉片接種100 μL，每株植株接種第5、6葉位葉片。

1.4 NbMBF1c沉默載體的構(gòu)建及浸潤

沉默載體的構(gòu)建基于煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）改造的沉默體系。首先根據(jù)的全長，利用在線工具VIGS Tool（https://vigs.solgenomics.net/）獲得的最佳沉默片段，以此設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)H I和I的引物，將其連接在同樣酶切位點(diǎn)的pTRV2載體上，構(gòu)建pTRV2:NbMBF1c載體。以空載體pTRV2為對(duì)照，將 pTRV1和 pTRV2:轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，28℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)，利用重懸液（10 mmol·LMES，10 mmol·LMgCl，200 μmol·L乙酰丁香酮）重懸至OD=0.4，等比混合后靜止2 h并注射4葉期本氏煙。

1.5 NbMBF1c酵母載體和NbMBF1c融合表達(dá)載體構(gòu)建及浸潤

根據(jù)獲得的核苷酸序列全長和 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）TMV基因組的CP、MP和P50核苷酸序列設(shè)計(jì)攜帶酶切位點(diǎn)R I和I的引物，構(gòu)建基于pGADT7和pGBKT7的酵母載體，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)繁獲取質(zhì)粒，以p53（p53）和SV40 large T-antigen（T）為陽性對(duì)照，將待驗(yàn)證的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母 AH109菌株，在SD-WL上生長5 d后轉(zhuǎn)染SD-WLHA和SD-WHLA+X--Gal，驗(yàn)證二者的相互作用。設(shè)計(jì)攜帶酶切位點(diǎn)R I和I的引物，構(gòu)建基于pART27的eGFP:NbMBF1c和Myc:NbMBF1c融合表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 GV3101中，在攜帶壯觀霉素與利福平的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，利用重懸液（10 mmol·LMES，10 mmol·LMgCl，200 μmol·L乙酰丁香酮）重懸至 OD=0.8，靜止2 h后注射6葉期本氏煙。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用qTOWER2.0 real-time PCR（Analytikjena，Germany）和 SYBR Prime qPCR Set（重慶葆光生物，中國）分析靶基因的相對(duì)表達(dá)量。使用在線工具Primer3web（https://bioinfo.ut.ee/primer3/）設(shè)計(jì)基因特異性定量引物。選擇本氏煙作為內(nèi)參，使用2法定量計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)變化。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)和數(shù)據(jù)至少涉及3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS軟件student’s檢驗(yàn)（*0.01＜＜0.05，**0.001＜＜0.01，***＜0.001）和ANOVA單因素分析（LSD檢驗(yàn)，＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 NbMBF1c的克隆與分析

全長441 bp，編碼146個(gè)氨基酸。上傳至NCBI，獲得基因序列號(hào)ON009340。ProtParam預(yù)測(cè)顯示NbMBF1c理論分子量為16.15398 kD，理論等電點(diǎn)10.07，分子式為CHNOS。TMHMM 2.0分析顯示NbMBF1c蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)。SMART分析顯示 NbMBF1c蛋白有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域 HTH（helixturn-helix）。

根據(jù) NbMBF1c氨基酸序列，在 NCBI中通過Blastp比對(duì)出NbMBF1c的同源蛋白，下載17條不同物種 MBF1c的氨基酸序列利用ClustalX2進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)合GeneDoc繪制多序列比對(duì)圖（圖1-A），利用MEGA X軟件采用ML法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果如圖1-B所示，NbMBF1c與絨毛狀煙草（）MBF1c（XP_009614458.1）的親緣關(guān)系最近。

圖1 NbMBF1c和其他植物MBF1c氨基酸序列比對(duì)及其系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment and phylogenetic analysis of NbMBF1c and MBF1c from other plants

2.2 NbMBF1c的表達(dá)分析與亞細(xì)胞定位

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在本氏煙各組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在根中的表達(dá)量顯著高于其他組織，莖、葉和花中的表達(dá)量遞減，表明的表達(dá)具有組織特異性（圖2-A）。為了探究響應(yīng)TMV侵染的方式，對(duì)6葉期的本氏煙接種TMV-GFP并以接種PBS作為對(duì)照。選取接毒后3、5 d的接種葉和7 d的系統(tǒng)葉，提取其RNA并反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)的表達(dá)量。由圖2-B可以看出，TMV侵染后3、5和7 d，表達(dá)均極顯著高于 PBS對(duì)照，分別為對(duì)照的 47.59、499.54和 24.44倍，表明 TMV-GFP侵染后會(huì)誘導(dǎo)的表達(dá)，提示可能參與本氏煙抗TMV的響應(yīng)。

為明確NbMBF1c的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建基于pART27的eGFP:NbMBF1c瞬時(shí)表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，在本氏煙葉片表皮細(xì)胞中共表達(dá)eGFP:NbMBF1c+mCherry:00和eGFP:NbMBF1c+細(xì)胞核定位標(biāo)記mCherry:H2B，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察到eGFP:NbMBF1c與mCherry:00和細(xì)胞核定位標(biāo)記mCherry:H2B共定位，且利用ImageJ分析波爾遜共定位參數(shù)發(fā)現(xiàn) eGFP:NbMBF1c與 mCherry:00和 mCherry:H2B都有很好的重疊性，表明 eGFP:NbMBF1c融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（圖3-A）。但是對(duì)煙草接種TMV并不能引起eGFP:NbMBF1c的定位改變（圖3-B）。

圖2 NbMBF1c的表達(dá)分析Expression analysis of NbMBF1c

圖3 NbMBF1c的亞細(xì)胞定位和TMV侵染下NbMBF1c的定位變化Fig. 3 Subcellular localization of NbMBF1c and localization change of NbMBF1c after TMV infection

2.3 沉默NbMBF1c對(duì)TMV-GFP侵染的影響

為明確對(duì)TMV-GFP侵染的影響，構(gòu)建了 TRV介導(dǎo)的 VIGS載體 TRV:NbMBF1c。以TRV:00為對(duì)照，通過農(nóng)桿菌浸潤的方式對(duì)6葉期的本氏煙進(jìn)行沉默。沉默14 d后，定量結(jié)果表明TRV:NbMBF1c植株中表達(dá)量顯著低于對(duì)照植株，僅為對(duì)照植株的6.54%，說明被有效沉默（圖4-C）。相較于對(duì)照植株，沉默植株呈現(xiàn)矮化和開花延遲（圖4-A、4-B），提示在調(diào)控植物生長發(fā)育中可能具有重要作用。在沉默15 d時(shí)，對(duì)本氏煙摩擦接種TMV-GFP，并在紫外燈下觀察病毒侵染情況。由圖5-A可以看出，在2 dpi和 4 dpi時(shí)沉默植株接種葉上的綠色熒光數(shù)量明顯多于對(duì)照組，并且5 dpi時(shí)沉默植株系統(tǒng)葉上的綠色熒光顯著多于對(duì)照組，表明沉默促進(jìn)了TMV-GFP的侵染。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)接種葉（2 dpi）和系統(tǒng)葉（5 dpi）中TMV的含量，結(jié)果如圖5-B所示，沉默植株接種葉（2 dpi）和系統(tǒng)葉（5 dpi）中TMV-GFP表達(dá)量均顯著高于對(duì)照植株，分別為對(duì)照的37.4和19.2倍，與紫外燈下觀察結(jié)果一致。這些結(jié)果說明沉默促進(jìn)了 TMV-GFP侵染，揭示可能為植物抗病毒正調(diào)控因子。

圖4 沉默NbMBF1c表型及沉默效率檢測(cè)Fig. 4 Phenotype and silencing efficiency detection in NbMBF1c silenced plant

圖5 沉默NbMBF1c促進(jìn)TMV-GFP侵染Fig. 5 Silencing of NbMBF1c promotes TMV-GFP infection

2.4 過表達(dá)NbMBF1c對(duì)TMV-GFP侵染的影響

TMV-GFP侵染后的表達(dá)上升，而沉默促進(jìn)TMV-GFP侵染。為進(jìn)一步明確在 TMV侵染時(shí)的作用，構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pART27-7*Myc:NbMBF1c。以Myc:00作為對(duì)照，Myc:NbMBF1c瞬時(shí)表達(dá)48 h后，利用Western blot檢測(cè)Myc:NbMBF1c的表達(dá)情況，并接種 TMV-GFP，在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動(dòng)情況。結(jié)果顯示，約在16 kD處有一條特異條帶，與預(yù)期大小一致，而空載體無相應(yīng)條帶，說明 NbMBF1c蛋白在注射葉片中成功表達(dá)（圖6-B）。接種TMV-GFP 4 d時(shí)，瞬時(shí)過表達(dá)植株葉片上出現(xiàn)零星的綠色熒光，而對(duì)照處理綠色熒光開始鋪滿整片葉子。接種 5 d時(shí)，瞬時(shí)過表達(dá)植株葉片上熒光數(shù)量略微擴(kuò)大，而對(duì)照處理的綠色熒光已經(jīng)擴(kuò)散至系統(tǒng)葉（圖6-A）。對(duì)系統(tǒng)葉TMV-GFP含量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示表達(dá)Myc:NbMBF1c的植株系統(tǒng)葉中 TMV-GFP含量顯著低于對(duì)照，與觀察結(jié)果一致（圖6-C），表明瞬時(shí)過表達(dá)NbMBF1c抑制TMV-GFP侵染。綜合以上結(jié)果，得出 NbMBF1c作為植物正調(diào)控因子抑制 TMV-GFP侵染。

圖6 過表達(dá)NbMBF1c抑制TMV-GFP侵染Fig. 6 Overexpression of NbMBF1c inhibits TMV-GFP infection

2.5 NbMBF1c與TMV CP、MP和P50組分不互作，沉默NbMBF1c影響激素相關(guān)基因的表達(dá)

沉默顯著加快了TMV-GFP侵染（圖5），而瞬時(shí)過表達(dá)NbMBF1c則抑制了TMV-GFP侵染（圖6），表明NbMBF1c在本氏煙抵抗病毒侵染的過程中起著積極作用。筆者推測(cè)NbMBF1c可能與病毒直接作用，采用酵母雙雜交試驗(yàn)來驗(yàn)證此猜測(cè)，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)NbMBF1c與TMV CP、MP和P50并未在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生互作（圖7）。NbMBF1c是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其能與下游多個(gè)抗性基因啟動(dòng)子結(jié)合，因此筆者猜測(cè)可能會(huì)通過影響激素途徑來參加植物抗病毒。為驗(yàn)證此猜測(cè)，對(duì)沉默植株中脫落酸（abscisic acid，ABA）合成關(guān)鍵酶基因、脫落酸受體ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和蛋白激酶，茉莉酸（jasmonic acid，JA）合成關(guān)鍵酶基因茉莉酸信號(hào)受體的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，TRV:NbMBF1c中與ABA通路相關(guān)基因都顯著上調(diào)表達(dá)，、、和分別是對(duì)照表達(dá)量的1.71、1.67、4.62和2.05倍（圖8-A—8-D）。TRV:NbMBF1c中表達(dá)顯著高于對(duì)照組，較對(duì)照增加了1.29倍，但的表達(dá)較對(duì)照顯著下調(diào)，為對(duì)照的63%（圖8-E、8-F）。這些結(jié)果揭示可能通過調(diào)控ABA和JA通路來影響TMV-GFP侵染。

圖7 酵母雙雜交分析NbMBF1c與TMV病毒組分的互作Fig. 7 The interaction of NbMBF1c and TMV virus components was analyzed by Y2H

圖8 沉默NbMBF1c對(duì)ABA和JA相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 8 Effect of NbMBF1c silencing on expression of ABA and JA related genes

3 討論

3.1 MBF1c廣泛參與植物的脅迫反應(yīng)

在擬南芥、馬鈴薯、小麥、番茄等植物中，參與了植物的生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)。根據(jù)這些報(bào)道，利用RT-PCR技術(shù)獲得本氏煙全長序列441 bp，編碼146個(gè)氨基酸，命名為。MBF1家族蛋白是在植物中廣泛存在參與植物調(diào)節(jié)的一類共轉(zhuǎn)錄因子，小麥上和在根、葉片和籽粒中均有表達(dá)，主要在葉片中表達(dá)，而僅在根部中特異性表達(dá)；百合中的在葉中表達(dá)量最高，根中次之，鱗莖中最低；而本氏煙在根中表達(dá)量最高，莖、葉、花依次減少。構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，NbMBF1c與絨毛狀煙草MBF1c（XP_009614458.1）的親緣關(guān)系最近。這些來自其他物種共有HTH結(jié)構(gòu)域的MBF1c蛋白能受到多種非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)并且在提高植物抗逆能力上有積極作用。在多種非生物脅迫下，如熱脅迫、過氧化氫處理、干旱和鹽脅迫，的表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)；AtMBF1c作為轉(zhuǎn)錄因子還能通過與TPS5相互作用并與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)擬南芥海藻糖合成并正調(diào)控對(duì)灰霉病菌的防御反應(yīng)；在小麥上，受到小麥條銹菌（f. sp.）誘導(dǎo)高表達(dá)；過表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄具有抗病原細(xì)菌DC3000和尖鐮孢（）的能力。本研究表明，TMW侵染下極顯著上調(diào)表達(dá)（圖2-B），并且沉默促進(jìn)TMV-GFP侵染（圖5），而瞬時(shí)過表達(dá) NbMBF1c抑制TMV-GFP侵染（圖6），這些結(jié)果提示本氏煙的 NbMBF1c蛋白在植物病毒侵染過程中具有積極正調(diào)控作用。

3.2 TMV不能改變 NbMBF1c的亞細(xì)胞定位，并且NbMBF1c不通過與 TMV組分的互作來影響病毒侵染

在激光共聚焦顯微鏡下觀察本氏煙葉片表達(dá)的eGFP:NbMBF1c融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（圖3），這與其他物種MBF1c亞細(xì)胞定位結(jié)果一致。洋蔥表皮細(xì)胞定位試驗(yàn)顯示小麥的 TaMBF1c主要定位在細(xì)胞核，部分定位在細(xì)胞質(zhì)中；百合常溫下LIMBF1c定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，熱應(yīng)激下LIMBF1c主要定位在細(xì)胞核中；而擬南芥MBF1c-GFP融合蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中；值得注意的是，高溫脅迫下三者的 MBF1c都發(fā)生了定位改變，大部分聚集在細(xì)胞核，MBF1c在響應(yīng)熱應(yīng)激上起到了重要作用，但在本試驗(yàn)中，對(duì)煙草接種TMV并不能引起eGFP:NbMBF1c的定位改變（圖3）。

擬南芥AtMBF1a和AtMBF1b均能與番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）的運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein，MP）互作，煙草的NtMBF1a能與 ToMV和十字花科植物煙草花葉病毒（crucifer tobamovirus，CTMV-W）的MP蛋白發(fā)生互作。然而，本研究酵母雙雜交試驗(yàn)表明NbMBF1c與TMV病毒組分CP、MP和P50均不在酵母體內(nèi)互作（圖7），表明本氏煙NbMBF1c可能不通過與病毒組分直接互作參與抗病毒防御。

3.3 NbMBF1c通過調(diào)控植物激素的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)來抑制TMV侵染

植物激素是一類能調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的微量有機(jī)物質(zhì)，在非生物脅迫和生物脅迫中均發(fā)揮著重要作用。在沉默后，ABA合成關(guān)鍵酶基因脫落酸受體、ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和蛋白激酶均顯著上調(diào)表達(dá)，這一定程度上反映了ABA激素的升高。外施ABA可以促進(jìn)水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）侵染，沉默會(huì)抑制病毒的侵染，這說明ABA負(fù)向調(diào)節(jié)水稻對(duì)RBSDV的抗性。外施茉莉酸甲酯可以促進(jìn)TMV的侵染和移動(dòng)，的沉默降低了TMV的積累水平，在本氏煙上沉默能夠促進(jìn)病毒的侵染。這與本研究結(jié)果是一致的，即沉默后，茉莉酸合成途徑上調(diào)表達(dá)，茉莉酸信號(hào)通路上的受體下調(diào)表達(dá)（圖8-E、8-F），TMV積累增加。在植物激素抵抗病毒侵染中，茉莉酸和水楊酸（salicylic acid，SA）是一對(duì)拮抗激素。有研究表明，JA可以調(diào)節(jié) SA的產(chǎn)生，在本氏煙受到TMV-GFP侵染時(shí)，立即激活JA信號(hào)以建立早期的系統(tǒng)性抗性，隨后JA信號(hào)調(diào)控SA產(chǎn)生，激活SA信號(hào)，建立廣泛的系統(tǒng)抗性；擬南芥上，丁香假單胞菌誘導(dǎo)產(chǎn)生MeSA需要JA的生物合成，并依賴和介導(dǎo)的JA下游信號(hào)傳導(dǎo)。后續(xù)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默后，水楊酸通路的表達(dá)量沒有變化（圖8-G），筆者推測(cè)是由于表達(dá)量下調(diào)，JA信號(hào)傳遞給SA效率降低，SA不能在植株受到病毒侵染時(shí)起到可靠的防御作用。這些結(jié)果表明本氏煙通過影響ABA和JA信號(hào)途徑進(jìn)而調(diào)控寄主抗TMV。

4 結(jié)論

的表達(dá)受 TMV侵染誘導(dǎo)。NbMBF1c主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，能夠作為 TMV的抗性基因抑制病毒在本氏煙上的侵染。NbMBF1c不通過直接與 TMV組分互作來抑制病毒侵染，可以通過調(diào)控植物激素的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)來抑制病毒侵染。