馬鈴薯品種（系）田間晚疫病抗性評(píng)價(jià)和全基因組遺傳多樣性分析

李曉川，王朝海，周平，馬維，吳瑞，宋治豪，梅艷

畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，貴州畢節(jié) 551700

0 引言

【研究意義】晚疫病由致病疫霉菌（（Mont.）de Bary）引起，是馬鈴薯（L.）生產(chǎn)的第一大病害。貴州省所處的烏蒙山區(qū)由于氣候冷涼潮濕，易大規(guī)模爆發(fā)晚疫病。致病疫霉菌存在高度的變異性，簡(jiǎn)單的單個(gè)抗病基因?qū)朐耘喾N所帶來(lái)的晚疫病抗性，很容易被變異的致病疫霉菌克服。因此，研究馬鈴薯種質(zhì)的遺傳多樣性及抗病種質(zhì)基因組中可能影響抗性的遺傳區(qū)段，對(duì)馬鈴薯晚疫病抗性種質(zhì)創(chuàng)新與利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于馬鈴薯晚疫病抗性育種的研究，多集中在克隆具有晚疫病致病疫霉菌小種?；剐缘腞（Resistance）基因上，目前，已克隆獲得多個(gè)R基因，均是NBS-LRR類基因。但無(wú)論是具有專一的小種專化抗性的R基因（、、和），還是具有廣譜的小種?；剐缘腞基因，將單個(gè)抗病基因?qū)朐耘喾N后所具有的晚疫病抗性，在商業(yè)化種植后，均易被變異的致病疫霉菌克服。如，將廣譜抗性RB基因?qū)肱嘤脑耘喾NBiogold，田間種植1年后，便被晚疫病菌克服。馬鈴薯晚疫病的田間抗性被認(rèn)為具有相對(duì)的持久性，具有非小種?；钥剐?，其形成的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是由多個(gè)基因控制，認(rèn)為多個(gè)R基因的堆疊可以增強(qiáng)馬鈴薯晚疫病田間抗性表現(xiàn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】西南烏蒙山區(qū)是中國(guó)馬鈴薯晚疫病發(fā)病最為嚴(yán)重的地區(qū)，而利用此環(huán)境條件，對(duì)馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行田間晚疫病抗性評(píng)價(jià)，以及隨后進(jìn)行全基因組遺傳多樣性分析的研究相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)在晚疫病多發(fā)且發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)對(duì)馬鈴薯種質(zhì)進(jìn)行田間晚疫病抗性鑒定，獲得抗病種質(zhì)資源，運(yùn)用現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)分析種質(zhì)的遺傳多樣性及抗病種質(zhì)基因組內(nèi)可能影響抗性的遺傳區(qū)段，為馬鈴薯晚疫病抗性種質(zhì)創(chuàng)新與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯田間晚疫病抗性材料篩選及取樣

參加馬鈴薯田間晚疫病抗性篩選的材料，包括自家選育的中高代品系432份以及從各地搜集的馬鈴薯品種（系）458份（電子附表1）。于2018—2021年分別在貴州省畢節(jié)市威寧縣草海鎮(zhèn)鄭家營(yíng)村、卯關(guān)村，威寧縣雪山鎮(zhèn)團(tuán)崗村、安家營(yíng)村、法地村以及七星關(guān)區(qū)朱昌鎮(zhèn)王家沖村內(nèi)多點(diǎn)種植，每個(gè)品種（系）種植50株，種植過(guò)程不噴灑晚疫病防治藥劑，進(jìn)行田間晚疫病抗性鑒定?？剐圆牧虾Y選：以在晚疫病爆發(fā)一個(gè)月后，植株依然能夠存活的馬鈴薯品種（系）為抗病材料（貴州畢節(jié)一般在3月中下旬種植馬鈴薯，4月中下旬出苗，6月中下旬晚疫病爆發(fā)，7月中下旬可達(dá)到當(dāng)?shù)刂髟灾型硎祚R鈴薯品種生長(zhǎng)期90—100 d的要求）；以在發(fā)病10 d左右大部分植株死亡的馬鈴薯品種為感病材料；其余為半抗病材料。挑選待測(cè)序感病材料時(shí)，參考?xì)W洲馬鈴薯栽培種數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.europotato.org/quick_search.php）關(guān)于晚疫病抗性及其他農(nóng)藝性狀的數(shù)據(jù)，同時(shí)參考馬鈴薯系譜數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.plantbreeding.wur.nl/potatopedigree/index.html）的系譜學(xué)數(shù)據(jù)。取晚疫病抗感材料葉片，分別進(jìn)行混合，將樣品經(jīng)液氮速凍后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 dd-RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

將樣品送派森諾生物科技公司構(gòu)建 dd-RAD（double digest restriction site-associated DNA sequencing）簡(jiǎn)化基因組測(cè)序文庫(kù)。經(jīng)Illumina NovaSeq高通量平臺(tái)進(jìn)行2×150 bp的雙端測(cè)序。采用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，使用fastp對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾。采用 BWA-MEM 程序?qū)⑦^(guò)濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對(duì)馬鈴薯參考基因組（DM v6.1），采用GATK軟件包來(lái)進(jìn)行SNP的檢測(cè)及過(guò)濾，采用ANNOVAR軟件對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行注釋。

1.3 遺傳多樣性分析

采用GCTA軟件對(duì)SNP數(shù)據(jù)（去除MAF＜0.05的SNPs）進(jìn)行主成分分析。采用fastTree軟件中的Maximum likelihood算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹分支的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證（bootstrap，1 000 replications）。采用 Admixture軟件對(duì)分型獲得的SNP信息進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置K=2—20（即假設(shè)存在2—20個(gè)群體），計(jì)算cross-validation（cv）error值，模型選擇為混合模型，其余參數(shù)為軟件的默認(rèn)設(shè)置。根據(jù)不同K的cv值選擇群體個(gè)數(shù)。采用stacks程序包中的populations命令進(jìn)行群體遺傳多樣性參數(shù)的計(jì)算。

1.4 選擇性消除分析

采用 vcftools程序進(jìn)行選擇性消除參數(shù)的計(jì)算。利用代表不同田間晚疫病抗性群體的SNP標(biāo)記信息，以20 kb為窗口，5 kb為步長(zhǎng)分別計(jì)算π值，并計(jì)算代表不同窗口和步長(zhǎng)抗病種質(zhì)和感病種質(zhì) π值的比值。同時(shí)，選取相同長(zhǎng)度的窗口和步長(zhǎng)計(jì)算不同晚疫病抗性群體間的Fst值。最終獲得不同窗口和步長(zhǎng)的遺傳區(qū)段的π值比值和Fst值。其中，抗病和感病種質(zhì)之間π值比值小，代表相對(duì)于感病種質(zhì)，抗病種質(zhì)的這段染色體區(qū)域核苷酸多樣性低，是受選擇的遺傳區(qū)段，選取π值比值最小的5%的遺傳區(qū)段，并選取這些遺傳區(qū)段中Fst值最大10%的遺傳區(qū)段進(jìn)行后續(xù)分析，即選取占基因組0.5%的遺傳區(qū)段。通過(guò)基因本體論分析（gene ontology，GO）預(yù)測(cè)遺傳區(qū)段內(nèi)的基因。基因的氨基酸序列利用 Clustal Omega進(jìn)行多序列比對(duì)。進(jìn)化樹利用MEGA6軟件的Neighbor-Joining參數(shù)通過(guò)計(jì)算1 000次生成樹圖。

1.5 馬鈴薯抗晚疫病種質(zhì)全基因組關(guān)聯(lián)分析

以101個(gè)抗病種質(zhì)和21個(gè)感病種質(zhì)的群體SNP信息，利用GEMMA 0.98.1軟件的一般線性模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到各SNP位點(diǎn)與性狀關(guān)聯(lián)程度的值，并計(jì)算-log()，-log()值越大，表示 SNP位點(diǎn)與性狀的關(guān)聯(lián)程度越強(qiáng)。利用 CMplot繪制-log()和期望-log()的QQ圖以及-log()的曼哈頓圖。選擇-log()＞6的SNP位點(diǎn)周圍50 kb的基因組序列，通過(guò)基因本體論分析預(yù)測(cè)遺傳區(qū)段內(nèi)的基因。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯田間晚疫病抗性鑒定

將收集的馬鈴薯品種（系）經(jīng)2018—2021年在貴州省畢節(jié)市威寧縣和七星關(guān)區(qū)內(nèi)6個(gè)地點(diǎn)種植，進(jìn)行田間晚疫病抗性鑒定。有101個(gè)品種（系），在晚疫病爆發(fā)一個(gè)月后依然能夠存活，基本可以滿足當(dāng)?shù)刂髟缘闹型硎祚R鈴薯品種生長(zhǎng)期90—100 d的要求，確定為抗晚疫病品種。同時(shí)以在晚疫病爆發(fā)后10 d左右大部分植株死亡為標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定得到感病品種175個(gè)，進(jìn)一步從中挑選了薯?xiàng)l/薯片加工品種11個(gè)和優(yōu)秀親本9個(gè)（兩者間有重疊）及擁有其他優(yōu)良性狀的品種4個(gè)，共21個(gè)品種進(jìn)行下一步分析（表1）。

表1 122份馬鈴薯種質(zhì)資源和2d-RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序情況Table 1 The 122 potato germplasm and 2d-RAD simplified genome sequencing results

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 馬鈴薯種質(zhì)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

將122個(gè)（101個(gè)抗晚疫病馬鈴薯品種（系）以及21個(gè)感病品種）樣本進(jìn)行dd-RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。每個(gè)樣本各產(chǎn)生957 120 660—2 571 656 553 bp的測(cè)序數(shù)據(jù)。過(guò)濾掉低質(zhì)量測(cè)序片段（Reads）和不合格序列后，每個(gè)樣本各產(chǎn)生6 750 190—18 433 648個(gè)高質(zhì)量測(cè)序片段，其中，6 701 577—18 323 584個(gè)測(cè)序片段與參考基因組匹配（DM v6.1），占全部測(cè)序片段的99.28%—99.48%，覆蓋參考基因組15.32%—27.14%（表1）。共檢測(cè)到8 697 602個(gè)SNP，其中，在基因外顯子區(qū)域的有397 244個(gè)SNP，內(nèi)含子區(qū)域的有970 743個(gè)SNP，基因上下游1 kb內(nèi)有499 056個(gè)SNP，基因間區(qū)域有6 650 230個(gè)SNP（表2）。馬鈴薯12條染色體上，平均每1 Mb得到的SNP在2 828個(gè)以上（圖1）。

表2 122份馬鈴薯種質(zhì)資源SNP基因分型情況Table 2 SNP identification in the 122 potato germplasm

圖1 2d-RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序分型得到的SNP密度熱圖Fig. 1 SNP density heat map from 2d-RAD simplified genome sequencing

2.3 馬鈴薯種質(zhì)的遺傳多樣性分析

利用檢測(cè)到的SNP信息對(duì)122份馬鈴薯種質(zhì)進(jìn)行種群分析。首先，假定這些種質(zhì)資源由2—20個(gè)群體（population）組成（即K=2—20），利用Admixture軟件分析種群結(jié)構(gòu)，當(dāng)K=6時(shí)，cross-validation（cv）error值最小，但當(dāng)K=3—9時(shí)，cv值差別不大（圖2-A）。說(shuō)明這些種質(zhì)資源可能是由3—9個(gè)群體組成，但最可能由6個(gè)群體（population）組成（圖2-B）。同時(shí)，將群體的SNP信息簡(jiǎn)化為3個(gè)維度的信息，進(jìn)行主成分分析（PCA），將結(jié)果根據(jù)種群結(jié)構(gòu)分析得到的 6個(gè)群體，繪制三維散點(diǎn)圖（圖2-C），顯示雖然各群體成員有聚集在一起的趨勢(shì)，但界限并不明顯。進(jìn)一步繪制遺傳進(jìn)化樹（圖2-D），顯示這些種質(zhì)資源可以分成6個(gè)群體（population），群體內(nèi)又有親緣關(guān)系更近的資源聚集成亞群（sub-population），如，在群體Ⅱ中來(lái)源于云薯的品種（系）聚集在亞群3中，幾個(gè)著名的加工品種（如Atlantic、Shepody等）聚集在群體Ⅳ中，親本來(lái)源于國(guó)際馬鈴薯中心的幾個(gè)品系聚集在群體Ⅵ內(nèi)的亞群2和亞群3中。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)種群結(jié)構(gòu)的劃分與資源的晚疫病抗性并不相關(guān)。

圖2 122份馬鈴薯種質(zhì)資源的種群分析Fig. 2 Population structure analysis of the 122 potato germplasm

進(jìn)一步利用種群結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性分析。在6個(gè)群體內(nèi)平均核苷酸多樣性值（π），范圍為0.2055—0.2572（表3），說(shuō)明群體內(nèi)樣本間的遺傳差異較大，范圍為0.156909—0.187336（表4），說(shuō)明群體間遺傳分化程度也較大。6個(gè)群體內(nèi)的期望雜合度（e）范圍為0.187—0.2297，觀測(cè)雜合度（o）范圍為0.0829—0.1186（表3），觀測(cè)雜合度均小于期望雜合度。同時(shí)6個(gè)群體內(nèi)的近交系數(shù)（Fis）范圍為0.2412—0.3554（表3），說(shuō)明6個(gè)群體內(nèi)存在近交的現(xiàn)象。通過(guò)進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)盡管101份馬鈴薯抗晚疫病種質(zhì)和21份感病種質(zhì)存在較豐富單核苷酸遺傳多樣性，但在選育這些種質(zhì)資源的過(guò)程中存在著親緣關(guān)系較近親本相互雜交的情況。

表3 群體內(nèi)的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters within the population

表4 群體間群體分化指數(shù)（Fst）的矩陣Table 4 The matrix of fixation index (Fst) among populations

2.4 馬鈴薯種質(zhì)選擇性消除分析

以分離基因組內(nèi)可能影響馬鈴薯晚疫病抗病性狀的遺傳區(qū)段進(jìn)行選擇性消除分析。選取抗病和感病種質(zhì)之間 π值比值最小的 5%的遺傳區(qū)段，并進(jìn)一步選取這些遺傳區(qū)段中Fst值最大的10%的遺傳區(qū)段進(jìn)行后續(xù)分析，共獲得993個(gè)遺傳區(qū)段，合并相鄰的遺傳區(qū)段后，共有745個(gè)遺傳區(qū)段，其中，最大的遺傳區(qū)段長(zhǎng)75 kb（圖3-A）。這些遺傳區(qū)段中共包含507個(gè)基因，通過(guò)GO基因功能預(yù)測(cè)，膜的組成部分有最多數(shù)目的基因；與防御反應(yīng)相關(guān)的有14個(gè)基因；許多基因預(yù)測(cè)擁有分子結(jié)合功能，如：ATP結(jié)合、ADP結(jié)合、DNA結(jié)合、氨基酸結(jié)合、鋅離子結(jié)合、鐵離子結(jié)合等（圖3-B）。在這些基因中，還發(fā)現(xiàn)了 4個(gè)擁有晚疫病抗?。≧）基因結(jié)構(gòu)域特性的NBS-LRR類基因（圖3-C），與已知的晚疫病抗病基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與、的序列相近；、和與/、和的序列相近。

圖3 選擇性清除分析Fig. 3 Selective sweep analysis

2.5 馬鈴薯種質(zhì)全基因組關(guān)聯(lián)分析

以101個(gè)抗病種質(zhì)和21個(gè)感病種質(zhì)的群體SNP信息，進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到各SNP位點(diǎn)與性狀關(guān)聯(lián)程度的-log()。在QQ圖右側(cè)，部分SNP位點(diǎn)的觀測(cè)-log()與期望-log()發(fā)生偏離（圖4-B），說(shuō)明與總體SNP位點(diǎn)不同，這部分SNP的觀測(cè)-log()不符合正態(tài)分布，表明這部分SNP位點(diǎn)附近的染色體區(qū)域可能受到了選擇。在曼哈頓圖中，與晚疫病抗性性狀關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的9個(gè)SNP位點(diǎn)（-log()＞6）分布于馬鈴薯的不同染色體上（圖4-A）。在這些SNP位點(diǎn)周圍50 kb的基因組范圍內(nèi)，共有69個(gè)基因，其中，41個(gè)基因可以依據(jù)細(xì)胞成分、生物過(guò)程及分子功能通過(guò)GO預(yù)測(cè)得到基因功能。在41個(gè)基因中，12個(gè)基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)為質(zhì)體的組成成分，15個(gè)基因預(yù)測(cè)參與到應(yīng)激反應(yīng)，12個(gè)基因預(yù)測(cè)參與清除過(guò)氧化物自由基的過(guò)程，4個(gè)基因預(yù)測(cè)參與半胱氨酸合成，3個(gè)基因預(yù)測(cè)參與跨膜運(yùn)輸（圖4-C）。

圖4 全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig. 4 Genome-wide association analysis

3 討論

3.1 dd-RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序是馬鈴薯基因分型的有效手段

構(gòu)建dd-RAD簡(jiǎn)化基因組文庫(kù)首先通過(guò)對(duì)參考基因組進(jìn)行分析，選取合適的限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，因此，在樣本間基因組DNA酶切位置基本相同，并且可以在基因組內(nèi)獲得位置間隔相對(duì)均勻的待測(cè)序片段。相比較于一些利用物理手段進(jìn)行基因組 DNA片段化的文庫(kù)構(gòu)建方法，dd-RAD是一種可預(yù)測(cè)的文庫(kù)構(gòu)建方法。文庫(kù)構(gòu)建完成后，通過(guò)2×150 bp的雙端測(cè)序，得到150 bp的測(cè)序片段，相對(duì)于其他利用限制性內(nèi)切酶構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的方法，如：2b-RAD只得到36 bp的測(cè)序片段，dd-RAD得到的測(cè)序片段長(zhǎng)度更長(zhǎng)，因此，將測(cè)序片段比對(duì)到參考基因組上時(shí)，比對(duì)結(jié)果更加可靠，分型結(jié)果也更加準(zhǔn)確。本研究利用 dd-RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，對(duì)122份馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，測(cè)序片段覆蓋了參考基因組 15.32%—27.14%，共檢測(cè)到8 697 602個(gè)SNP標(biāo)記。在馬鈴薯12條染色體上，平均每1 Mb含有2 828個(gè)SNP以上（圖1）。馬鈴薯的連鎖不平衡（LD）衰減值最小為600 kb，平均在2—4 Mb，表明本研究的SNP密度足以滿足要求。

3.2 群體結(jié)構(gòu)分析揭示馬鈴薯種質(zhì)資源之間的遺傳關(guān)系

群體結(jié)構(gòu)分析能夠揭示馬鈴薯種質(zhì)資源之間的遺傳關(guān)系。研究表明，通過(guò)群體結(jié)構(gòu)分析，可以將普通栽培種、安第斯栽培種及野生種區(qū)分開。并且，部分來(lái)源相同、育種地相近的種質(zhì)，可以在群體結(jié)構(gòu)分析中聚集在一起。如，DUAN等研究表明大部分中薯系列品種聚集在一個(gè)類群中。WANG等研究表明不同時(shí)間引入中國(guó)的國(guó)外品種、來(lái)源于國(guó)際馬鈴薯中心的種質(zhì)資源、以及中國(guó)不同地區(qū)選育的馬鈴薯品種分別聚集在不同的亞群。與這些研究類似，本研究來(lái)源于云薯的種質(zhì)聚集在群體Ⅱ的亞群3中，親本來(lái)源于國(guó)際馬鈴薯中心的幾個(gè)品系聚集在群體Ⅵ的亞群 2和亞群3中（圖2-D)。

群體結(jié)構(gòu)分析可以在一定程度上區(qū)分薯?xiàng)l、薯片加工品種與其他普通栽培種，本研究幾個(gè)著名的加工品種（如大西洋（Atlantic）、夏坡蒂（Shepody）等）聚集在群體Ⅳ中（圖2-D）。但種質(zhì)種群結(jié)構(gòu)的劃分與種質(zhì)的晚疫病抗性并不相關(guān)（圖2-D），這可能是由于晚疫病抗性基因在群體里屬于稀有位點(diǎn)，它們的選擇與否與群體結(jié)構(gòu)之間沒(méi)有必然聯(lián)系。

同時(shí)，為了緩解馬鈴薯遺傳基礎(chǔ)狹窄的問(wèn)題，可以根據(jù)群體結(jié)構(gòu)，分析種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系，并在雜交育種中選擇親本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)。例如，本研究所涉及的幾個(gè)易感晚疫病品種Agria、Desiree、Innovator、Felsina、Nicola和Superior，它們除了擁有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀外，更重要的是它們具有較高的一般配合力，是國(guó)際范圍內(nèi)近期作為直接親本育成品種數(shù)最多的幾個(gè)品種，可以在親本選配中選擇群體Ⅵ內(nèi)的種質(zhì)雜交。同時(shí)，本研究中所涉及的種質(zhì)，尤其是感病種質(zhì)較少，可以利用在不同研究中相同種質(zhì)所處的種群結(jié)構(gòu)位置，分析其他研究中的種質(zhì)與本研究種質(zhì)間的親緣關(guān)系。如通過(guò)相同品種（Favorite、Desiree、中薯17號(hào)）分析與189份不同晚疫病抗性的普通栽培種、安第斯栽培種及野生種之間的親緣關(guān)系。通過(guò)相同的云薯系列品種，分析與292份不同時(shí)間引入中國(guó)的國(guó)外品種、來(lái)源于國(guó)際馬鈴薯中心的種質(zhì)資源、以及中國(guó)不同地區(qū)選育的馬鈴薯品種之間的關(guān)系。通過(guò)相同品種（Atlantic、Favorita、Katahdin）分析與209份中國(guó)育成的品種之間的親緣關(guān)系。

3.3 馬鈴薯田間抗晚疫病種質(zhì)資源擁有較豐富的單核苷酸多態(tài)性但在其選育過(guò)程中存在近交現(xiàn)象

馬鈴薯作為營(yíng)養(yǎng)器官繁殖的作物，其品種選育經(jīng)歷的有性雜交過(guò)程十分有限。系譜學(xué)研究顯示，有記錄的馬鈴薯雜交育種始于一個(gè)智利普通栽培品種Rough Purple Chili，它的后代與歐洲品種雜交后，表現(xiàn)突出，從此馬鈴薯雜交育種開始得到重視并廣泛應(yīng)用。美國(guó)馬鈴薯協(xié)會(huì)列出北美177個(gè)應(yīng)用于生產(chǎn)的品種，其中，156個(gè)品種含有Rough Purple Chili的血緣。在全世界育成的有記錄的4 397個(gè)品種中，15個(gè)直接親本育成的品種數(shù)占總品種數(shù)的 14.9%；523個(gè)有記錄的中國(guó)品種中，8個(gè)直接親本育成的品種數(shù)占總品種數(shù)的27.34%。因此，馬鈴薯存在著種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)狹窄的問(wèn)題。在本研究中，通過(guò)利用122份馬鈴薯種質(zhì)的群體 SNP信息，可以將這些種質(zhì)資源分成6個(gè)群體（圖2）。6個(gè)群體內(nèi)的觀測(cè)雜合度均小于期望雜合度，并且 6個(gè)群體內(nèi)的近交系數(shù)（Fis）為 0.2412—0.3554（表3），說(shuō)明選育這些種質(zhì)的過(guò)程中存在近交的現(xiàn)象，也反映了這些種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)狹窄的問(wèn)題。同時(shí)，馬鈴薯作為基因組高度雜合的多倍體，本身?yè)碛休^豐富的單核苷酸多態(tài)性。在6個(gè)群體內(nèi)，反映群體內(nèi)樣本間平均遺傳多樣性差異程度的平均核苷酸多樣性值（π）為0.2055—0.2572（表3），反映群體間的分化程度群體分化指數(shù)（Fst）為 0.156909—0.187336（表4），說(shuō)明田間抗晚疫病種質(zhì)資源擁有較豐富的單核苷酸多態(tài)性。

3.4 選擇性清除分析和關(guān)聯(lián)分析有助于分離影響農(nóng)藝性狀染色體區(qū)段

選擇性清除分析利用在受選擇的遺傳區(qū)段中，遺傳多樣性降低并且遺傳分化升高，來(lái)分離影響農(nóng)藝性狀的染色體區(qū)段。本研究以20 kb為窗口5 kb為步長(zhǎng)，在基因組相同位置，分別計(jì)算不同晚疫病抗性馬鈴薯種質(zhì)間平均核苷酸多樣性（π）值比值和群體分化指數(shù)（Fst）值。相較于其他類似的研究，本研究選擇了相對(duì)較小的窗口計(jì)算π值和Fst值，一方面是因?yàn)楹?jiǎn)化基因組測(cè)序只對(duì)部分基因組進(jìn)行了基因分型，過(guò)大的窗口可能平均化已測(cè)序和未測(cè)序遺傳區(qū)段的單核苷酸多態(tài)性信息，并導(dǎo)致結(jié)果不能反映該區(qū)段的真實(shí)情況；另一方面本研究種群結(jié)構(gòu)的劃分與其晚疫病抗性并不相關(guān)，選擇較小的窗口更能精細(xì)化區(qū)分遺傳區(qū)段的受選擇情況。以 π值比值極小及Fst值極大，選擇可能影響晚疫病抗性的745個(gè)遺傳區(qū)段進(jìn)一步分析，這些遺傳區(qū)段中共包含507個(gè)基因，其中，有14個(gè)基因可能參與防御反應(yīng)，更為重要的是有4個(gè)類基因，1個(gè)與的序列相近，另外3個(gè)與擁有廣譜晚疫病抗性、和的序列相近（圖3-C），其中，/克隆自馬鈴薯野生種，是克隆的第一個(gè)具有廣譜晚疫病抗性的基因，和克隆自馬鈴薯野生種，是的同源基因。說(shuō)明選擇性清除分析有助于分離影響晚疫病性狀的遺傳區(qū)段。

關(guān)聯(lián)分離利用連鎖不平衡，使用自然群體挖掘與性狀相關(guān)聯(lián)的基因，在馬鈴薯中也有廣泛的應(yīng)用。例如，通過(guò)分析抗黃瘟病（）基因的等位基因座，在雙倍體及四倍體馬鈴薯群體中，對(duì)抗黃瘟病性狀與SNP標(biāo)記之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，克隆出了一個(gè)抗黃瘟病的基因。同樣也有研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量、淀粉含量、抗旱等性狀進(jìn)行了研究。在本研究中，得到了 9個(gè)可能與晚疫病性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，在它們周圍的50 kb的基因組范圍內(nèi)，有15個(gè)基因預(yù)測(cè)參與應(yīng)激反應(yīng)，有12個(gè)基因預(yù)測(cè)參與清除過(guò)氧化物自由基，這些基因可能參與了晚疫病侵染后的細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程（圖4-C）。

4 結(jié)論

dd-RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序可以在馬鈴薯基因組中分型到數(shù)量較多分布相對(duì)均勻的SNP標(biāo)記。馬鈴薯田間抗晚疫病種質(zhì)資源擁有較豐富的單核苷酸多態(tài)性但在其選育過(guò)程中存在近交的現(xiàn)象。選擇性清除和關(guān)聯(lián)分析有助于分離影響晚疫病抗病性狀的遺傳區(qū)段。