4T1細胞成瘤的乳腺癌小鼠模型臨床轉(zhuǎn)化過程中的幾個問題

劉梓昕牛東芹王 東

(江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,武漢 430056)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)在報告中指出,2020年乳腺癌成為全球發(fā)病率最高的癌癥[1]。我國情況也不容樂觀,2020年乳腺癌新發(fā)病例約42萬,死亡約12萬。在眾多乳腺癌亞型中,三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)的治療最為困難[2-4],因其不表達或低表達人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)、雌激素受體(estrogen receptor, ER)和孕激素受體(progesterone receptor, PR)而難以從分子靶向等現(xiàn)代療法中受益[5-6],化療成為當(dāng)前較為有效的治療方法[7]。蒽環(huán)類與鉑類藥物是治療TNBC的主要選擇,其中鉑類藥物在臨床實踐中被推選為治療TNBC的優(yōu)選方案[8-9]。但是這并非是最優(yōu)方案,與其他亞型乳腺癌相比,其治療手段有待拓展、療效有待提高。

順鉑是鉑類藥物的典型代表,為第一個被FDA批準用于治療惡性腫瘤的鉑類藥物[10],然而,耐藥性和嚴重的毒副作用使順鉑的應(yīng)用大打折扣[11-12]。近年來,通過結(jié)構(gòu)修飾或者開發(fā)納米藥物[13]等方法來克服鉑類藥物的不足成為臨床前研究的熱點。但無論使用哪種方法都要經(jīng)過動物模型的驗證,因此,正確選取動物模型和準確造模是藥物獲得臨床應(yīng)用的關(guān)鍵[14-17]。但是,在具體實踐中即使對于同一種動物模型,不同課題組的造模手段也會存在較大差異,這為客觀評價實驗效果帶來諸多偏差。為了推進動物模型選擇和構(gòu)建的同質(zhì)化,本文僅以順鉑參與的使用4T1細胞株構(gòu)建的TNBC異體移植瘤模型為例,論述與分析實驗研究中存在的問題并提出解決方案。

1 4T1細胞株的應(yīng)用中存在的問題及討論

4T1細胞株是由Fred Miller等學(xué)者分離得到的可移植型乳腺癌細胞[18],因其惡性程度高易成瘤,自發(fā)向肺、肝、腦等部位轉(zhuǎn)移成為廣泛使用的移植瘤細胞。此外,4T1細胞移植瘤模型的生長狀態(tài)及轉(zhuǎn)移部位非常類似于人類晚期乳腺癌,成為評估晚期乳腺癌藥物的良好模型。筆者統(tǒng)計了近年來4T1細胞在有順鉑參與的藥效實驗中的使用情況(表1),并從細胞的種類、使用濃度、分散介質(zhì)等方面進行總結(jié)。

表1 4T1細胞在異體移植瘤模型中的應(yīng)用統(tǒng)計Table 1 Application statistics of 4T1 cells in xenograft tumor model

由表可見,研究者在細胞的選用方面非常統(tǒng)一,絕大多數(shù)采用未經(jīng)熒光素酶轉(zhuǎn)染的細胞系進行相關(guān)研究,植瘤前細胞分散介質(zhì)的選擇上也比較一致,然而細胞數(shù)目與注射濃度在各研究中呈多樣化。首先,在細胞類型選擇方面兩個亞類的4T1細胞被使用。就傳統(tǒng)的4T1細胞而言,移植瘤的大小通過測量腫瘤的長徑和短徑尺寸計算而來,不同實驗者對同一腫瘤的測量結(jié)果無法從客觀上統(tǒng)一。而熒光素酶轉(zhuǎn)染的細胞從一定程度上克服了上述缺點,可實現(xiàn)熒光定量測定,結(jié)果直觀明了,具備更強的說服力,但其過渡依賴于貴重儀器,加之細胞構(gòu)建方面費用較高未被廣泛采用。筆者認為在采取適當(dāng)措施的情況下,比如始終由同一測量者進行實驗,傳統(tǒng)4T1細胞即可滿足實驗精度要求。

其次,在細胞數(shù)目方面尚未有統(tǒng)一標準。從統(tǒng)計結(jié)果來看,細胞數(shù)目的使用范圍在3×104～1×107個/只小鼠之間,跨度可達300倍以上,這必然會影響藥效評價,不利于臨床轉(zhuǎn)化。因此,確立相對統(tǒng)一的細胞使用數(shù)目十分必要與急迫。但這并不是容易解決的事情,細胞數(shù)目的選擇還涉及到移植瘤的類型(原位或皮下)、植瘤方式(直接注射或者手術(shù)植入)、實驗?zāi)康?抑制轉(zhuǎn)移或者抑制原發(fā)灶)等多方面的問題。作為一個折中方案,(0.3～1.0)×106個/只小鼠的細胞數(shù)目值得考慮。

第三,在確認細胞數(shù)目的前提下,細胞濃度對植瘤效果也有顯著影響。其影響往往是隱性的,比如細胞被懸浮在分散介質(zhì)中有自發(fā)聚集沉淀的傾向,細胞濃度越大沉淀可能越快;細胞過密也會影響自身活性,最終導(dǎo)致移植瘤不均一。細胞濃度由細胞使用數(shù)目與注射體積確定,在一般的移植瘤模型中注射體積多為100 μL,因此細胞濃度在107級別及以下較為合理。為了保證模型均勻、藥效評價客觀,在實驗過程中仍需注意某些問題:(1)最好將細胞按每只小鼠的注射量單獨分裝;(2)臨注射前輕柔吹打使細胞充分分散;(3)在盡量短的時間內(nèi)用完細胞,防止活性降低影響成瘤。

最后,細胞分散介質(zhì)對成瘤有一定影響但不如其他因素重要,研究中使用PBS者較多,無血清的培養(yǎng)基與生理鹽水[28]也能滿足植瘤需要。鑒于多篇參考文獻沒有明確給出所用介質(zhì),筆者不能做更詳細的評價。

筆者課題組曾以1×105個/只小鼠的4T1細胞進行脂肪墊原位植瘤研究某種銅(Ⅱ)配合物的藥效學(xué)實驗,實驗共使用30只BALB/c小鼠,通過手術(shù)切開小鼠第4、5對乳頭附近的皮膚暴露脂肪墊注射100 μL 4T1細胞。在注射后的第2天觀察并測量腫瘤體積,30只小鼠均成功植入腫瘤,平均體積為(90±9)mm3,第4天觀察平均體積為(260±71)mm3,在第16天處死小鼠后檢測肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),發(fā)現(xiàn)所有小鼠都有明顯肺轉(zhuǎn)移,說明植瘤成功且成功率100%。在另外的實驗中,筆者以尾靜脈注射觀察肺轉(zhuǎn)移,在4T1細胞低至3×104個/只小鼠的數(shù)量時也能很好的發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,且成功率也為100%。4T1細胞易成瘤的特性為乳腺癌的藥效學(xué)評價提供了極大的方便,然而,作為科研人員即使在使用4T1這種容易造模的細胞時也應(yīng)該仔細選擇成瘤的最佳條件以,從而避免實驗偏差或資源浪費。

2 4T1異體移植瘤模型中實驗動物操作的問題及討論

在乳腺癌異體移植瘤模型中,BALB/c小鼠為近交系品種,具備遺傳背景一致,對4T1細胞沒有免疫排異,植瘤成功率高的特點[30-31],成為使用最為普遍實驗動物[32-33]。筆者對表1所列文獻的小鼠使用情況進行總結(jié)(表2)。

由表可知,除Zhou等[26]使用BALB/c裸鼠外,其余研究均使用BALB/c小鼠建立移植瘤模型,這是由所使用的細胞株決定的。Zhou等[26]使用熒光素酶轉(zhuǎn)染的4T1細胞,裸鼠方便成像觀測。也有研究者將4T1細胞植入BALB/c裸鼠以對比普通BALB/c小鼠的成瘤狀況,為合理選擇實驗動物提供理論依據(jù)[34]。至于小鼠的年齡與體重則由植瘤方式和位置決定,多數(shù)研究采用4～6周齡、體重18～22 g的小鼠,然而這并非最佳選擇。如果構(gòu)建皮下瘤模型,4～6周齡的小鼠足以滿足要求;若是制作原位瘤采取脂肪墊注射的方法,此時小鼠的乳腺發(fā)育不夠充分,接種時容易漏掉細胞。顯然,7～8周齡的小鼠更適合原位脂肪墊注射。鑒于4T1細胞為乳腺癌細胞系,脂肪墊注射比皮下植瘤在模擬病 理 狀 態(tài) 上更加合理,由此而得出的藥效學(xué)評價才能更客觀和科學(xué)[15]。即使在這樣的前提下,筆者發(fā)現(xiàn)在造模過程中仍然存在較為嚴重的偏差,比如表2中多數(shù)研究者通過直接注射的方法造模。然而,這種方法不能準確的將細胞植入脂肪墊內(nèi),筆者曾以臺盼藍對小鼠直接脂肪墊注射然后剖開檢測注射效果,結(jié)果表明部分臺盼藍泄漏至皮下組織。因此,筆者建議采取手術(shù)暴露脂肪墊的方式植瘤,這樣可以保證均一和精確的模型構(gòu)造。在減少小鼠創(chuàng)傷保證植瘤有效的前提下,Tavera-Mendoza等[35]提出了一種微創(chuàng)手術(shù)乳腺原位植瘤的方法,圖1列出了操作流程。在注射體積的問題上,等于或少于100 μL的注射量是正確的選擇,否則將面臨細胞泄漏的難題。

表2 4T1異體移植瘤模型中實驗動物操作狀況Table 2 Operation status of experimental animals in 4T1 xenograft tumor model

3 在4T1異體移植瘤中順鉑的使用問題及討論

鉑類藥物以形成DNA-鉑交聯(lián)物干擾DNA復(fù)制而抑制腫瘤增殖[8],因其對攜帶乳腺癌易感基因1/2(Breast Cancer gene 1/2, BRCA 1/2)突變的細胞敏感[36],被推薦為晚期TNBC患者的救治藥物,這些患者約75%攜帶BRCA 1/2突變。順鉑是最早開發(fā)的鉑類藥物,但其副作用大,應(yīng)用受限,所以多種結(jié)構(gòu)優(yōu)化的鉑類藥物如卡鉑[37]、奧沙利鉑[38]等先后應(yīng)用于臨床。目前,仍有較多鉑類化合物正處于臨床前研究階段[10],如Cheng等[39]報道了反式鉑與DNA的作用,Muhammad等[40]研究了含有生物素的Pt(Ⅳ)配合物對乳腺癌細胞的抑制作用。納米化的鉑類藥物也處于不斷被開發(fā)的過程并取得突出進展,曾沛玉等[41]制備了一種含順鉑前藥的介孔硅納米粒,任玉雙等[42]進行了順鉑前藥接枝修飾硫代DNA及其自組裝靶向納米藥物研究。順鉑在這些研究中通常當(dāng)做陽性對照來使用,規(guī)范的給藥方式及劑量是衡量新藥藥效的基礎(chǔ),然而在實踐中存在較多問題,筆者對順鉑在4T1細胞移植瘤中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行總結(jié),表3展示了研究中存在的某些問題。

表3 順鉑在4T1異體移植瘤中的應(yīng)用現(xiàn)狀Table 3 Application status of cisplatin in 4T1 xenograft tumor

注:a:腹部乳腺和乳頭;b:在第四個乳頭下方作小于3 mm(外部和尾部)的切口;c:暴露脂肪墊;d:細胞注射體積小于120 μL;e:脂肪墊復(fù)位;f:用組織粘合劑密封切口。圖片來自于參考文獻[35]。圖1 小鼠乳腺原位注射乳腺癌細胞的微創(chuàng)手術(shù)Note.a, Abdominal mammary gland and nipple.B, Small incision 3 mm (external and caudal) below the fourth nipple.c, Exposed fat pad.d, Exposed fat pad can be injected with a volume 120 μL.e, Fat pad is allowed to go back to its position.f, Incision is sealed using tissue adhesive.The pictures are from reference[35].Figure 1 Less invasive procedure for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland

順鉑是當(dāng)前臨床使用的抗腫瘤藥物,在乳腺癌治療中常規(guī)劑量為75 mg/m2[43],在聯(lián)合治療中的用量常為25 mg/m2[44],另有文獻報道大劑量順鉑療法,其用量為150 mg/m2[45]。按照等效劑量換算[46],小鼠對應(yīng)的等效劑量分別為25、8.3、50 mg/kg。然而,在實際動物實驗中小鼠的使用劑量通常為1、2、3 mg/kg,這可能是由小鼠對順鉑的耐受劑量決定的。所以,在選擇劑量的同時有必要評價藥物對實驗動物的毒副作用,在相對安全的劑量下從事藥效學(xué)研究。在藥物劑量表達方式上也存在影響藥效評估的問題,大多數(shù)研究以化合物本身為度量標準,個別文獻則以鉑元素的質(zhì)量為度量標準,Zhou等[26]和Sengupta等[27]以1或3 mg /kg鉑元素的劑量給藥,忽略了配體對藥物活性的影響,顯然不符合臨床用藥標準,但是從實驗?zāi)康纳蟻砜催@又是合理的,因為二者均采用納米藥物提高順鉑的活性,順鉑被偶聯(lián)在高分子聚合物上。在動物實驗中另外一項不規(guī)范在于給藥頻次,從表3的數(shù)據(jù)可知,即使相同的給藥劑量,不同研究者的給藥頻次相差較大,這些偏差都應(yīng)該以符合臨床用藥的標準予以校正。第三,各研究者在初次給藥標志與療程的問題上也遠沒有達到統(tǒng)一,筆者認為初次給藥時間設(shè)定在移植瘤模型造模成功之后較為合理,即腫瘤大小在50～100 mm3之間即可實施給藥,總給藥時間則由藥物長期毒性實驗確定。在給藥方式上,多數(shù)研究者使用腹腔注射,少數(shù)報道采用尾靜脈注射,這是實驗?zāi)康臎Q定的,例如納米藥物需尾靜脈注射,作為對照的順鉑也應(yīng)采取尾靜脈注射的方式,在這一點上研究者們意見一致。在4T1細胞移植瘤藥效學(xué)研究的實驗中,順鉑的使用存在諸如劑量、頻次、初次給藥時間與療程不統(tǒng)一的問題,作為研究者應(yīng)充分考慮動物實驗與臨床應(yīng)用有效轉(zhuǎn)化的問題。

4 結(jié)語

常見的乳腺癌荷瘤小鼠模型包括皮下瘤、原位瘤和肺轉(zhuǎn)移等模型。由于模型的多樣性和實驗?zāi)康牡牟煌?所以在構(gòu)建的模型方面并沒有一個統(tǒng)一的參數(shù),筆者僅就文獻報道和個人經(jīng)驗做一個大體的總結(jié),以供讀者探討。在構(gòu)建皮下瘤模型中,(3～5)×105細胞/小鼠較為合理,植瘤5～9 d可達到給藥標準,且早期不會出現(xiàn)腫瘤迅速生長的現(xiàn)象,便于延長治療周期及提高療效;原位瘤則無需注射過多細胞,以(0.5～1)×105細胞/小鼠較好;尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型注射細胞相對較多,以(0.5～1)×106細胞/小鼠較為理想,若細胞注射過多則會導(dǎo)致肺組織損傷嚴重,小鼠過早死亡。就注射體積而言,應(yīng)特別注意將脂肪墊造模的注射體積控制在100 μL以內(nèi),以防止泄露;其他的植瘤方式可將體積控制在200 μL以下。細胞濃度則由細胞數(shù)目與注射體積決定。在分散介質(zhì)的選擇上相對寬松,3種造模方式均可選擇PBS和無血清培養(yǎng)基,但是在注射腫瘤細胞時要注意不能一次在注射器中吸取過多細胞,可保持在5只注射量以下,并及時更換注射器,防止注射期間細胞聚沉吸附到注射器壁上,從而避免植瘤不均一。在小鼠選擇上,以4～6周齡的小鼠居多,但脂肪墊注射最好選擇7～8周齡的小鼠,此時小鼠性成熟脂肪墊發(fā)育完善方便注射。如何選擇實驗條件最終由實驗?zāi)康拇_定,考察物質(zhì)的腫瘤抑制作用可選用皮下或脂肪墊植瘤,而肺轉(zhuǎn)移則可以選用尾靜脈造模。

臨床前藥物評價是銜接臨床應(yīng)用與基礎(chǔ)研究的橋梁[47],而動物實驗扮演著不可或缺的角色,準確而客觀的動物實驗包括細胞選擇、動物選擇、造模與給藥觀測等多個流程,每一步都可能對藥效學(xué)研究產(chǎn)生重大影響。筆者以順鉑參與的使用4T1細胞株構(gòu)建的TNBC異體移植瘤模型為例總結(jié)了研究中存在的問題,這些問題涉及到實驗的每一個流程,從而使得動物實驗中取得良好抗腫瘤效果的化合物在臨床試驗中屢屢失效,由此可見一斑。截至2020年7月,小鼠腫瘤生物學(xué)數(shù)據(jù)庫顯示至少有19242篇研究論文與小鼠腫瘤模型有關(guān),僅由美國國立衛(wèi)生研究院資助的正在進行的人源性異種移植瘤相關(guān)研究的總預(yù)算達到1.16億美元之多。臨床試驗的失敗沉重打擊了藥物開發(fā)的積極性,Yuan等[48]針對腫瘤模型探討了臨床試驗失敗的原因,在184個人源性異種移植瘤模型中有170個感染了小鼠病毒,這很可能導(dǎo)致該模型的評價藥效的可靠性。除了實驗過程存在偏差外,有些文獻報道缺失相關(guān)信息,甚至是細胞數(shù)目、給藥劑量、初次給藥標志以及療程等重要信息,這給不同研究者的交流帶來很多不確定性,進而影響實驗評價的客觀性。全世界每年開展大量癌癥移植瘤模型相關(guān)動物實驗,錯誤設(shè)定實驗條件將浪費大量人力、財力,而且給臨床轉(zhuǎn)化制造不可估量的困難,這就要求科研工作者慎重選擇動物模型,以權(quán)威的參考文獻為指導(dǎo),嚴格執(zhí)行實驗流程,客觀評價實驗結(jié)果。新化合物進入臨床研究的前提是動物實驗,而動物實驗的關(guān)鍵則在于統(tǒng)一而準確的操作規(guī)范,只有糾正實驗偏差動物實驗的數(shù)據(jù)才能更好的為臨床轉(zhuǎn)化服務(wù)。