丹參酮提取物對(duì)奶牛乳腺炎常見致病菌抑菌試驗(yàn)

陶 蕾，王廣宇，王明彥，陳彥亮，樊志強(qiáng)，郭 杰，梁 妍，高寶山

（1.蘭州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.三門峽廣宇生物制藥有限公司，河南 三門峽 472400；3.河南省中藥材生產(chǎn)技術(shù)推廣中心，鄭州 450000；4.蘭州大學(xué)，蘭州 730070；5.天津市武清區(qū)農(nóng)村社會(huì)事業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 301700）

丹參是中醫(yī)的一味常用中藥，在植物分型中屬于唇形科鼠尾草屬范圍，生長(zhǎng)地方較為廣泛，而在我國(guó)，盛產(chǎn)丹參的省份主要有河南、山西、河北等地[1]。丹參作為一種活血化瘀類藥物被廣泛應(yīng)用，近年來也得到了國(guó)外的認(rèn)可[2]，成功進(jìn)入《美國(guó)藥典》[3]。而丹參酮是丹參中提取出來的活性成分，該類成分具有較強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌功效，如耐藥金黃色葡萄球菌[4]。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展期間，奶牛發(fā)乳腺炎的問題是最為常見的問題，奶牛乳腺炎的發(fā)生原因較多，而最為常見的致病因素則為物理因素及各種細(xì)菌、微生物，這些因素會(huì)在一定程度上刺激到奶牛的乳腺，進(jìn)而逐步發(fā)展成為炎癥病變，尤其是細(xì)菌、病原微生物感染等，目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用抗生素是奶牛乳腺炎治療的最有效辦法。但隨著抗生素的大量應(yīng)用，耐藥性不斷產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了療效，同時(shí)，抗生素的使用會(huì)導(dǎo)致牛奶中蓄積藥物，還會(huì)對(duì)奶牛造成腸道菌群失調(diào)。而通過中藥有效成分能夠克服抗生素治療中的弊端，通過篩選抑菌作用強(qiáng)、對(duì)環(huán)境穩(wěn)定的中藥有效成分來防治奶牛乳腺炎，是綠色防控奶牛乳腺炎的一個(gè)重要課題。通過體外抑菌試驗(yàn)篩查各種有效成分，從而確定有效成分，為進(jìn)一步研制新獸藥打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試藥物

丹參酮提取物（隱丹參酮含量3%，丹參酮ⅡA 11%），三門峽廣宇生物制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 菌株

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、從乳腺炎患牛乳汁中分離鑒定的菌株。

枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）[ATCC 35666]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris）[CMCC（B）49027]、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）[ATCC 19615]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CICC 10419]，其來源為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏與管理中心、中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 培養(yǎng)基

①M(fèi)H營(yíng)養(yǎng)肉湯；②依據(jù)無菌檢查法配制的無菌生理鹽水；③營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；④MH營(yíng)養(yǎng)瓊脂；⑤營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；⑥麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，以上各種材料均購(gòu)置于廣東環(huán)凱微生物科技；LB Broth（Lennox，SIGMA）；北京索萊寶（Solarbio）科技提供的無菌脫纖維綿羊血。所用試劑均為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

本次所用儀器設(shè)備包含：①DW-86L338型立式超低溫保存箱；②HPsafe-1200LC型生物安全柜；③麥?zhǔn)媳葷峁?；④GHP-9160型隔水式培養(yǎng)箱；⑤LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器⑥HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱；⑦M(jìn)X-S型漩渦混合；⑧DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

2 方法

2.1 最小抑菌濃度MIC值的測(cè)定

最小抑菌濃度MIC值的測(cè)定[5-6]：測(cè)定方法為常量稀釋法，由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師開展操作，操作期間按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行測(cè)定，通過管碟法觀察其體外抑菌活性[7-8]。稀釋液為MH肉湯（Mueller-Hinton Broth）。

2.2 接種菌量的準(zhǔn)備

取各菌（細(xì)菌）的肉湯培養(yǎng)物先進(jìn)行稀釋處理，稀釋的標(biāo)準(zhǔn)為10倍，完成以上操作后進(jìn)行MH肉湯稀釋，直至達(dá)到含菌量為1×107cfu/mL范圍為止，并將以上培養(yǎng)物放于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境以備檢測(cè)。

2.3 試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法

在開展這一項(xiàng)試驗(yàn)過程中為了確保更加準(zhǔn)確的成功率和詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用2組對(duì)照的方式進(jìn)行，2組的稀釋方法一樣，選取22支規(guī)格大小為5 mL的無菌離心管平均分為2組，各組留存1#管，其他的離心管分別將2 mL的MH肉湯加入，鏈球菌的方式為添加2%的小牛血清的MH肉湯，在研究組1#管、2#管中分別加入丹參酮提取物配置的原液，添加的劑量為2 mL，之后記錄1#管為抗菌藥物原液，并確保1#管的質(zhì)量濃度為500 mg·mL-1。將2#管中的營(yíng)養(yǎng)肉湯中加入丹參酮提取物，輕輕搖晃使其均勻后吸取2 ml混合液推注到3#管，按照這種方式持續(xù)對(duì)藥液進(jìn)行稀釋，一直到10#管抽吸2 mL，并將其他離心管丟棄，完成以上操作之后，進(jìn)行對(duì)照藥液組中的11#管則屬于無藥液管。1#管中的藥物質(zhì)量濃度為500 mg·mL-1、2#管中的藥物質(zhì)量濃度為250 mg·mL-1、3#管中的藥物質(zhì)量濃度為125 mg·mL-1、4#管中的藥物質(zhì)量濃度為62.5 mg·mL-1、5#管中的藥物質(zhì)量濃度為31.25 mg·mL-1、6#管中的藥物質(zhì)量濃度為15.625 mg·mL-1、7#管中的藥物質(zhì)量濃度為7.81 mg·mL-1、8#管中的藥物質(zhì)量濃度為2.91 mg·mL-1、9#管中的藥物質(zhì)量濃度為1.95 mg·mL-1、10#管中的藥物質(zhì)量濃度為0.98 mg·mL-1。

2.4 接種

研究組1#管至11#管中控制加入的稀釋菌液為每次100 μL，而參考組的各離心管則不添加稀釋的菌液。完成稀釋操作之后將菌液放于37℃恒溫的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間為21 h左右。并對(duì)比分析2組藥物濃度相等的離心管，并作為初步判定結(jié)果，如果離心管內(nèi)的溶液顯示為渾濁狀態(tài)表示存在細(xì)菌生長(zhǎng)，如果離心管的溶液表現(xiàn)為清澈透明，則判定為離心管內(nèi)溶液沒有出現(xiàn)生長(zhǎng)的細(xì)菌，轉(zhuǎn)種將試驗(yàn)組與對(duì)照組各管內(nèi)的中藥與細(xì)菌的培養(yǎng)物，劃線接種至血瓊脂平板，放置在37℃恒溫的培養(yǎng)箱中孵育22 h左右。

2.5 結(jié)果判定

由試驗(yàn)者詳細(xì)地對(duì)血瓊脂平板上是否出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)行觀察和記錄，本次受試丹參酮提取物對(duì)該菌的最低抑菌濃度判定標(biāo)準(zhǔn)為：血瓊脂平板上沒有出現(xiàn)生長(zhǎng)細(xì)菌的離心管，并將以上的各菌重復(fù)3次，最終的平均值為最終測(cè)定水平。

2.6 管碟法

本次抑菌活性的測(cè)定方法為體外抑菌法[9-10]。詳細(xì)的測(cè)定方法主要分為以下3個(gè)步驟：（1）準(zhǔn)備好培養(yǎng)基平板，依據(jù)商品操作說明書規(guī)范配置水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，在121℃的高溫下滅菌15 min，直至溫度下降到55℃左右，將其傾注無菌平皿，從而保持瓊脂厚度4 mm。應(yīng)用5%的脫纖維綿羊血的MH瓊脂平板孵育鏈球菌。水解酪蛋白瓊脂平板使用前應(yīng)置35℃孵育30 min，試驗(yàn)人員應(yīng)對(duì)其表面進(jìn)行詳細(xì)檢查，查看是否處于干燥狀態(tài)，避免由于表面潮濕影響試驗(yàn)結(jié)果；

（2）確定最佳涂布濃度：具體的方法是通過用營(yíng)養(yǎng)肉湯（細(xì)菌）進(jìn)行稀釋處理，稀釋的范圍標(biāo)準(zhǔn)為各活化菌液10-1～10-5的10倍遞增方法，完成稀釋處理以后將其放置在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)22 h左右，之后檢測(cè)人員詳細(xì)觀察菌苔生長(zhǎng)狀況，并由此測(cè)得最合適的菌類涂布濃度；

（3）牛津杯加注丹參酮提取物藥液法：檢測(cè)人員應(yīng)用生理鹽水稀釋制備的菌液，稀釋的標(biāo)準(zhǔn)為涂布濃度，然后進(jìn)行MH瓊脂平板涂抹和接種操作，平板加蓋置放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，干燥3 min以上，最長(zhǎng)時(shí)間為15 min，并依次完成酒精燈微灼、瓊脂與受試丹參酮提取物藥液原液混合等操作。應(yīng)在此期間將2張滅菌濾紙覆蓋于牛津杯上，將杯蓋合上，水平放置平皿，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育22 h左右，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察。如果抑菌環(huán)直徑在10 mm以內(nèi)則判定結(jié)果為沒有抑菌效果，如果超過10 mm而低于15 mm則表示存在較弱的抑菌效果，超過15 mm并低于22 mm則判定為中等的抑菌效果，如果超過22mm則表示抑菌效果強(qiáng)。

3 結(jié)果與分析

丹參酮提取物的最小抑菌濃度（MIC）及抑菌強(qiáng)度結(jié)果觀察，見表1。

表1 丹參酮提取物最低抑菌濃度及抑菌圈直徑結(jié)果

通過以上結(jié)果可以看出，丹參酮提取物對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果存在差異，抑菌效果最強(qiáng)的為鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌，其次屬于金黃色葡萄球菌，抑菌效果處于中等范圍，抑菌效果相對(duì)較差的為腸桿菌。

牛津杯加注丹參酮提取物藥液的體外抑菌法結(jié)果與試管二倍稀釋法結(jié)果相一致，丹參酮提取物（500 mg·mL-1）對(duì)各種菌均有較好的抑菌效果，其中對(duì)鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌圈直徑介于22.5～25 mm區(qū)間；對(duì)腸桿菌的抑菌強(qiáng)度最低，抑菌圈直徑在20.0～22.0 mm之間。抑菌強(qiáng)度大小依次為：鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞腸桿菌。

4 討論

中藥具有一定的抑菌效果，藥物成分不同、藥物搭配方式不同也會(huì)產(chǎn)生不同的效果[5]，與抗生素等西藥相比，中醫(yī)的毒性更低，且長(zhǎng)時(shí)間使用一般也不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，優(yōu)勢(shì)較多。丹參酮提取物是中醫(yī)常用的補(bǔ)血補(bǔ)氣藥物，在奶牛乳腺炎治療中也同樣能夠發(fā)揮良好的活血化瘀、補(bǔ)血補(bǔ)氣功效，進(jìn)而使奶牛乳腺炎病情得以改善、奶牛的機(jī)體免疫力得以提升。本次體外抑菌試驗(yàn)研究中，丹參酮提取物具備很強(qiáng)的抑制鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌功效，其檢測(cè)所得的最低抑菌質(zhì)量濃度值均在125 mg·mL-1以內(nèi)，同時(shí)還具備一定抑制一般致病性腸桿菌和金黃色葡萄球菌的功效，抑菌效果最強(qiáng)的為鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌，其次屬于金黃色葡萄球菌，抑菌效果處于中等范圍，抑菌效果相對(duì)較差的為腸桿菌。

本次試驗(yàn)中，丹參酮提取物的抗菌活性與抗生素有一定差距，丹參酮提取物抑菌抗菌作用弱于抗生素的原因可能與本次測(cè)試期間的培養(yǎng)基狀態(tài)及所選取的細(xì)菌含量和狀態(tài)等因素有著密切的聯(lián)系，造成本次試驗(yàn)結(jié)果中的抑菌作用效果不明顯。

綜上所述，丹參酮提取物作為一種純中藥制劑，優(yōu)勢(shì)眾多，藥物生產(chǎn)流程較為簡(jiǎn)單，可降低藥物成本，并減少了使用期間的不良反應(yīng)，對(duì)于多種細(xì)菌均可產(chǎn)生良好的抑制效果，具有很大的開發(fā)價(jià)值。該藥物還可以與抗生素搭配使用，從而使藥物之間互相協(xié)同，提高藥物治療效果，宜積極推廣。