不同產(chǎn)地金銀花中酚酸類含量的測定

張浩，葉靜，馬長宏，王海艷，叢鑫，王屾

（遼寧盤錦檢驗檢測中心·遼寧盤錦·124010）

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]。其性味甘，寒，氣清香，歸心、肺、胃經(jīng)，清熱而不傷胃，芳香透達(dá)亦能祛邪[2]。素有“中藥中的青霉素”之稱[3]，是清熱解毒的良藥。金銀花中的化學(xué)成分主要是有機酸類、黃酮類、三萜皂苷類、揮發(fā)油類、環(huán)烯醚萜類等[4-5]。金銀花廣泛應(yīng)用于臨床，主要治療風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱、癰腫疔毒等，具解熱、抑菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、保肝利膽、增強免疫力等功效[6-7]。尤其是在抗擊新型冠狀病毒疫情期間，其市場需求量十分巨大。現(xiàn)有文獻報道關(guān)于金銀花的質(zhì)量評價中，使用高效液相色譜法對金銀花單一成分（如綠原酸、咖啡酸、總黃酮、木犀草苷等）的含量測定和指紋圖譜的研究較多[8-11]。《中國藥典》2020年版規(guī)定，酚酸類含量為金銀花主要質(zhì)量控制指標(biāo)之一，酚酸類中綠原酸具抗菌、抗抑郁、抗氧化、保肝等生物活性[12]。因此，本研究為擴大金銀花藥用資源為出發(fā)點，對遼寧盤錦地區(qū)栽培種植的金銀花酚酸類的含量進行測定，并根據(jù)《中國藥典》2020年版金銀花項下的內(nèi)容及方法，同內(nèi)蒙古、甘肅、山東、河北、河南、吉林等常用6個產(chǎn)區(qū)的金銀花中綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩徇M行含量測定并進行對比，期望能夠為7個產(chǎn)區(qū)金銀花的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（日本島津公司，SPD-20A UVVIS檢測器）；PRO-DI-T超純水機（德國Sartorius公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；KQ3200DB型超聲波清洗器（江西贛儀科技有限公司）；0.45μm濾膜（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑與試藥

綠原酸對照品（純度為96.3%，批號：110753-202119）、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩釋φ掌罚兌葹?4.3%，批號：111782-201807）、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩釋φ掌罚兌葹?5.1%，批號：111894-202104）均購自中檢院；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；磷酸為色譜純。

1.3 樣品

金銀花樣品分別采收于內(nèi)蒙古、甘肅、山東、河北、河南、吉林、遼寧盤錦等7個地區(qū)，經(jīng)遼寧盤錦檢驗檢測中心主任中藥師張國友鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序見表1；柱溫為25℃；流速為0.7 mL·min-1；檢測波長為327 nm；對照品溶液和供試品溶液的進樣量均為2 μL；理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于10000。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

取綠原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸和4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸對照品，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇（75%）制成每1ml含0.28mg、0.15mg、44μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品，粉碎（過四號篩），約0.5 g，稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇（75%）50 mL，稱定，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30分鐘，放冷，再稱定，用甲醇（75%）補足，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下對照品溶液和供試品溶液適量，按照“2.1”項色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，見圖1。綠原酸對照品色譜圖中綠原酸保留時間為8.6 min，理論板數(shù)大于10000，3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸保留時間為24.0 min和4,5-二-O-咖啡?？鼘幩岜Ａ魰r間為27.3 min。

2.3.2 線性關(guān)系考察

分別精密稱取一定量的綠原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸和4，5-二-O-咖啡?？鼘幩釋φ掌酚?5 mL量瓶中，用甲醇（75%）定容至刻度，搖勻，配制成混合對照品母液。該母液中各對照品的濃度分別為綠原酸0.420 mg·mL-1、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩?.225 mg·mL-1和4，5-二-O-咖啡?？鼘幩?6 μg·mL-1。取上述混合對照品母液加甲醇（75%）進行梯度稀釋，獲得6個濃度梯度的溶液，然后按“2.1”項色譜條件進樣，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，如表1所示，表明線性關(guān)系良好。詳見表2。

表2 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3.3 精密度試驗

取質(zhì)量濃度為0.205 mg·mL-1綠原酸、0.110 mg·mL-13，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?4.036 μg·mL-14，5-二-O-咖啡酰奎寧酸溶液，按“2.1”項色譜條件下，連續(xù)進樣6次，得出峰面積。計算得出其RSD分別為1.12%、1.06%和1.23%。表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取樣品約0.5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項色譜條件下測定，計算得出綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩岬腞SD分別為1.23%、1.21%和1.29%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

取樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下，分別于0、4、8、12h進行測定，計算得出綠原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸和4，5-二-O-咖啡?？鼘幩岬腞SD分別為1.12%、1.02%和1.27%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

取吉林金銀花樣品0.25 g，共18份，分兩大組，兩大組分三個小組加綠原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸和4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸對照品（相當(dāng)于樣品濃度的80%、100%、120%）。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，另取“2.2.1”項下綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩釋φ掌啡芤哼M樣測定比照，按“2.1”項色譜條件下進樣，并計算出綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩岬汀⒅?、高3個濃度的加樣回收率。結(jié)果表明，綠原酸加樣回收率為99.0%～101.2%，平均回收率99.8%，RSD為1.02%；3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸加樣回收率為98.8%～101.5%，平均回收率100.6%，RSD為1.07%和4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸加樣回收率為99.2%～101.6%，平均回收率100.1%，RSD為1.09%。

2.4 樣品含有量測定

取7個產(chǎn)區(qū)的樣品，粉碎（過四號篩），精密稱取0.5 g，內(nèi)蒙古、甘肅、山東、河北、河南、吉林等6個產(chǎn)區(qū)各3份；遼寧盤錦產(chǎn)區(qū)取3批樣品，每批3份，共9份。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，另取“2.2.1”項下綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩釋φ掌啡芤?，按“2.1”項色譜條件下進樣，測得7個不同產(chǎn)區(qū)金銀花樣品中綠原酸含量大于1.5%；含酚酸類以綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡酰奎寧酸的總量計，均大于3.8%，結(jié)果符合《中國藥典》2020年版的規(guī)定。詳見表3。

表3 不同產(chǎn)區(qū)樣品中綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷辛繙y定結(jié)果（%，n=3）

3 討論

《中國藥典》2020年版一部項下規(guī)定金銀花中含綠原酸不得少于1.5%，含酚酸類以綠原酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩岬目偭坑?，不得少于3.8%[1]。結(jié)果表明，7個產(chǎn)區(qū)的金銀花樣品均符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的要求，其中河南的含量最高。

金銀花是醫(yī)學(xué)臨床上常用的中藥之一，有著“中藥中的青霉素”的美譽，作為夏季茶飲的材料之一，也受到了我國北方許多地區(qū)百姓的歡迎，由于其種類比較多，質(zhì)量間存在一定的不同，再加上生長區(qū)域、采集時間、加工炮制方法等對其成分的組成及含量均產(chǎn)生不同程度的影響。因此，建立科學(xué)合理的質(zhì)量評價體系對于金銀花的質(zhì)量控制十分重要。整體分析，《中國藥典》2020年版一部中對金銀花酚酸類中綠原酸的含量限度比較低，建議提高藥典標(biāo)準(zhǔn)。