胰腺癌組織富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白55基因的表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其臨床意義

金晶 陳穎 陳燕 許金芳 于齊宏 龐亞南 滿曉華 吳洪玉 呂順莉

1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學(xué)軍隊(duì)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，上海 200433

胰腺癌惡性程度高，5年生存率低，早期診斷困難，近年發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。我國(guó)國(guó)家癌癥中心2017年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌在我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率為第7位，女性第11位，占惡性腫瘤相關(guān)死亡率的第6位[1]，因此早期診治顯得尤為重要。近年來，越來越多的研究證實(shí)DNA的異常甲基化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，腫瘤細(xì)胞DNA總體甲基化水平低于正常細(xì)胞，但在某些特定區(qū)域如啟動(dòng)子區(qū)CpG島處于高甲基化狀態(tài)，可誘導(dǎo)基因突變、基因缺失，抑制基因表達(dá)，使抑癌基因喪失功能[2-4]。本研究應(yīng)用甲基化芯片雜交篩選出富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白55(leucine rich repeat containing 55，LRRC55)基因，觀察其在胰腺癌中的甲基化狀態(tài)，分析其mRNA表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，探討LRRC55基因參與胰腺癌發(fā)病的潛在機(jī)制，以期對(duì)胰腺癌早期診斷提供新靶標(biāo)。

材料與方法

一、標(biāo)本收集

收集2019年5月至2021年5月間海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科37例行手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的胰腺導(dǎo)管腺癌組織及其癌旁正常組織(距腫瘤2 cm之內(nèi))。隨機(jī)選取2例胰腺癌組織及癌旁組織行LRRC55基因甲基化檢測(cè)；記錄其余35例患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血CEA、CA19-9水平等指標(biāo)。另收集2例正常胰腺組織標(biāo)本，2例健康成人外周血標(biāo)本作為對(duì)照。標(biāo)本置于液氮中保存。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)aTu8988由德國(guó)Marburg Phillips大學(xué)分子生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所Elsasser博士惠贈(zèng)，人胰腺癌細(xì)胞株ASPC1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞株置含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、95%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株LRRC55基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化檢測(cè)

采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測(cè)LRRC55基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。以酚氯仿法抽提2例胰腺癌組織及癌旁組織、2株胰腺癌細(xì)胞株及2例正常成人外周血白細(xì)胞DNA，紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000，美國(guó))測(cè)定DNA純度和濃度。DNA亞硫酸氫鹽修飾和回收純化按EZ-DNA Kit試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司)說明書操作，置于-20℃保存。引物設(shè)計(jì)參考Pubmed GenBank中報(bào)告的LRRC55基因(GeneID：219527)序列，應(yīng)用methyl-primer express1.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。LRRC55甲基化正向引物序列為5′-GTAGGAAAATAGGTAGCGTTAGGTC-3′，反向引物序列為5′-AAAAAAACCGAAAATAATACCACG-3′，擴(kuò)增片段為130 bp；LRRC55-BSP正向引物序列為5′-GGTTTAGAAAAATGAGTTTG-3′，反向引物序列為5′-CCTTCATCCCAACATCCCTT-3′，擴(kuò)增片段為256 bp；內(nèi)參β-actin正向引物序列為5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′，反向引物序列為5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′。PCR反應(yīng)條件：BSP退火溫度為53.3℃，甲基化退火溫度為61.3℃，菌落PCR退火溫度為60℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)含0.5 mg/L溴化乙錠的1.8%瓊脂糖膠進(jìn)行鑒定，用復(fù)日FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)攝影。

四、胰腺癌組織LRRC55基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)35例胰腺癌及癌旁組織、2例正常胰腺組織中LRRC55基因mRNA的表達(dá)。采用TRizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度和濃度。取1 μg總RNA在20 μl反應(yīng)體系中一步法轉(zhuǎn)錄cDNA(美國(guó)Takara公司)。LRRC55引物和探針混合液購(gòu)自Thermo Fisher公司。以GAPDH作為內(nèi)參，正向引物序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物序列為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，由上海英駿生物有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值，采用2-△△Ct公式計(jì)算LRRC55 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。胰腺癌和癌旁胰腺組織間LRRC55基因mRNA表達(dá)量以M(Q1，Q3)表示，兩組間比較采用非參數(shù)配對(duì)秩和檢驗(yàn)法。采用Spearman法或Wilcoxn符號(hào)秩檢驗(yàn)分析LRRC55基因mRNA表達(dá)量與臨床特征間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株LRRC55基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平

LRRC55基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島在2例胰腺癌組織和2株胰腺癌細(xì)胞株(PaTu8988、ASPC)中為高甲基化狀態(tài)，平均甲基化率為53%、71%；在2例癌旁組織、2例正常胰腺組織和2例健康成人外周血標(biāo)本中為低甲基化狀態(tài)，平均甲基化率分別為8%、11%、9%(圖1)。

二、胰腺癌組織LRRC55基因 mRNA的表達(dá)

35例胰腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常胰腺組織LRRC55基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.21(0.02，1.00)、0.98(0.33，3.66)，胰腺癌組織mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，圖2)。

圖1 LRRC55基因在各樣本中BSP克隆測(cè)序結(jié)果比較

三、LRRC55基因mRNA表達(dá)量與胰腺癌臨床特征之間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織LRRC55基因mRNA表達(dá)與腫瘤分化、CEA(r=-0.423，P=0.011)顯著相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤部位及大小、CA19-9水平、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均無相關(guān)性(表1)。

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程，其中包括原癌基因及腫瘤抑制基因的改變、錯(cuò)配修復(fù)基因的突變、DNA甲基化和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等。DNA甲基化是影響基因表達(dá)的重要機(jī)制之一，與腫瘤發(fā)生有著密切聯(lián)系，腫瘤中DNA甲基化主要為總體甲基化水平降低和特定區(qū)域高甲基化[3,5-7]。基因總體甲基化水平降低導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、血管形成及細(xì)胞凋亡基因相應(yīng)的CpG島的甲基化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成[8-10]。在腫瘤細(xì)胞中CpG島DNA甲基化是較為顯著的異常表觀遺傳改變，發(fā)生高甲基化的特定區(qū)域一般是跨越管家基因和腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的CpG島區(qū)，作為表觀遺傳調(diào)控因子能夠誘導(dǎo)基因編碼區(qū)突變或使基因失活而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[11-13]。腫瘤早期即可表現(xiàn)為腫瘤抑制基因甲基化水平的升高，因此異常DNA甲基化認(rèn)為可用來評(píng)估癌癥前期進(jìn)展的潛在早期診斷生物標(biāo)志物[11]。

表1 胰腺癌組織LRRC55基因mRNA表達(dá)量與臨床特征之間的關(guān)系

筆者前期應(yīng)用甲基化芯片雜交篩選出LRRC55基因，該基因定位于11q12.1，有2個(gè)外顯子，是LRRCγ亞基家族的成員之一，可有效調(diào)節(jié)BK通道激活的電壓依賴性[14]。通道的激活可以同時(shí)受到膜電勢(shì)和胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)控，使鉀離子流出細(xì)胞外，細(xì)胞超極化，細(xì)胞興奮性降低，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生理功能。LRR結(jié)構(gòu)域在BK通道γ亞單位的表達(dá)、細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)和通道調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[15]。有研究顯示LRRC55在成人大腦內(nèi)側(cè)韁核、小腦和腦橋中表達(dá)升高，可能對(duì)神經(jīng)元興奮性具有獨(dú)特的影響[16]。LRRC55在局灶性節(jié)段性腎小球硬化、糖尿病腎病和膜性腎病患者腎小球足細(xì)胞中表達(dá)增加，同樣在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷小鼠模型中足細(xì)胞表達(dá)升高，可能通過增加足細(xì)胞BK通道電流密度產(chǎn)生相應(yīng)影響[17]。本研究結(jié)果表明LRRC55基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島在胰腺癌組織和細(xì)胞株中均呈高甲基化狀態(tài)，同時(shí)該基因mRNA在胰腺癌組織中呈低表達(dá)，并與腫瘤分化程度、血CEA水平明顯相關(guān)。DNA 甲基化是表觀遺傳最具有特征性的機(jī)制之一，可調(diào)控基因的特異性表達(dá)，抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因、激素受體基因和DNA修復(fù)基因等啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可使其表達(dá)降低或不表達(dá)，而癌基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化則使其表達(dá)升高，從而促進(jìn)腫瘤的形成。這表明LRRC55基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，導(dǎo)致其mRNA在胰腺癌中低表達(dá)，從而造成腫瘤分化程度的不同。

綜上所述，LRRC55基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)可能是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的早期事件，該基因可能是胰腺癌的潛在抑癌基因。LRRC55是否通過BK通道參與其中還需進(jìn)一步深入研究，探討該基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明金晶：研究操作、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫；陳穎、陳燕、于齊宏、龐亞南：研究指導(dǎo)、數(shù)據(jù)整理；許金芳：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；滿曉華、吳紅玉：研究操作；呂順莉：研究設(shè)計(jì)、研究指導(dǎo)、論文修改