基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)研究化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎活性成分作用機(jī)制研究※

楊 柳 李 澤 高云霄 賈雪梅 郭榆西 李博林 楊 倩△ 張 彤

(1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2019級碩士研究生，河北 石家莊 050091；2.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2020級博士研究生，河北 石家莊 050091；3.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2021級博士研究生，河北 石家莊 050091；4.河北省中醫(yī)院脾胃病三科,河北 石家莊 050011；5.河北省中西醫(yī)結(jié)合胃腸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050011；6.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊 050011)

慢性萎縮性胃炎是一種病因尚未完全明確，癥狀沒有特異性，胃鏡難以早期診斷，并有一定癌變風(fēng)險(xiǎn)的疾病，極大地威脅著人們的健康。由于發(fā)病機(jī)制不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療上缺乏特效藥物，一般以根除幽門螺桿菌，對癥使用促胃腸動力、消化酶制劑、胃黏膜保護(hù)劑、抑酸藥物，或加用抗焦慮、抑郁藥物治療，效果不甚理想。中醫(yī)在治療慢性萎縮性胃炎方面有著能截?cái)嗖∏榘l(fā)展，甚至逆轉(zhuǎn)萎縮的獨(dú)特優(yōu)勢[1-2]。國醫(yī)大師李佃貴潛心中醫(yī)臨床50余年，提出了“濁毒理論”，并采用化濁解毒法，以化濁解毒方(藥物組成：茵陳、黃連、藿香、佩蘭、茯苓、砂仁、黃芩、半夏、厚樸、白花蛇舌草)[3-4]治療慢性萎縮性胃炎，取得了良好的療效[5-7]。在學(xué)習(xí)和傳承李佃貴大師化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的過程中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)研究是從傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論進(jìn)行討論，缺乏現(xiàn)代藥理機(jī)制的研究，或?qū)蝹€(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行研究，不符合中藥復(fù)方多中心、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過對現(xiàn)有藥物、疾病數(shù)據(jù)庫的檢索，靶點(diǎn)預(yù)測、富集分析，可以得到“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”的相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)闡釋中藥復(fù)方治療疾病的機(jī)制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)分析化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)、物質(zhì)基礎(chǔ)等，以為后續(xù)的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.com/)，UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)，TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)，RCSB PDB數(shù)據(jù)庫 (https://www1.rcsb.org/)，Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，DAVID數(shù)據(jù)庫 (https://david.ncifcrf.gov/)。Cytoscape 3.7.1軟件，PyMol，AutoDock，RStudio。

1.2 方法

1.2.1 化濁解毒方有效成分篩選 通過TCMSP以化濁解毒方中的10味中藥為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL) ≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得化濁解毒方中發(fā)揮作用的有效成分。

1.2.2 化濁解毒方有效成分作用靶點(diǎn)的收集 借助DrugBank數(shù)據(jù)庫獲取化濁解毒方有效成分的作用靶點(diǎn)，獲得有效成分潛在靶點(diǎn)信息。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫中，選取已被驗(yàn)證的人類蛋白，將蛋白名統(tǒng)一規(guī)范為基因名稱。

1.2.3 慢性萎縮性胃炎靶點(diǎn)獲取 以“Chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、CTD和TTD數(shù)據(jù)庫查找與慢性萎縮性胃炎相關(guān)的靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，獲得與慢性萎縮性胃炎有關(guān)的靶點(diǎn)。

1.2.4 潛在作用靶點(diǎn)的獲取 利用Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺制作得到慢性萎縮性胃炎靶點(diǎn)與化濁解毒方有效成分作用靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，視為潛在作用靶點(diǎn)。

1.2.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將藥物、藥物的有效成分及潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)示意圖，使用Network Analyzer插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯W(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小用度(Degree)值表示，Degree值的成分為主要有效成分。

1.2.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的潛在作用靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲得可信度>0.7的PPI信息，將所得文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件可視化，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到各靶點(diǎn)的Degree值，Degree值排名靠前的可能是核心靶點(diǎn)。并使用Cytoscape 3.7.1中MCODE插件功能對所得PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行聚類分析，設(shè)置K-core值>4。

1.2.7 富集分析 將上述篩選得到的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，對潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，并運(yùn)用RStudio軟件將數(shù)據(jù)可視化。

1.2.8 分子對接驗(yàn)證 將篩選得到的主要有效成分與PPI分析得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。檢索RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中靶點(diǎn)蛋白，并保存為PDB格式，在TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得有效成分的MOL2格式文件，使用PyMol對蛋白質(zhì)進(jìn)行刪除水分子、加氧去氫后，在AutoDock中與主要有效成分進(jìn)行分子對接，計(jì)算得出它們之間的結(jié)合能，并運(yùn)用PyMol將其結(jié)合方式可視化。

2 結(jié)果

2.1 化濁解毒方有效成分篩選結(jié)果 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共得到符合OB≥30%、DL≥0.18篩選標(biāo)準(zhǔn)的有效成分有84個(gè)，其中茵陳含有13個(gè)，黃連含有11個(gè)，藿香含有7個(gè)，佩蘭含有7個(gè)，茯苓含有6個(gè)，砂仁含有8個(gè)，黃芩含有32個(gè)，厚樸含有2個(gè)，半夏含有11個(gè)，白花蛇舌草含有5個(gè)。有些有效成分同時(shí)存在于2種或2種以上的藥物中，如槲皮素同時(shí)存在于茵陳、黃連、藿香、白花蛇舌草中，芫花素同時(shí)存在于茵陳和藿香中。結(jié)果見表1。

表1 化濁解毒方有效成分篩選結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 化濁解毒方有效成分作用靶點(diǎn)收集結(jié)果 通過DrugBank數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到化濁解毒方84個(gè)有效成分的作用靶點(diǎn)，再將這些靶蛋白導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫中，只取已得到驗(yàn)證的人類蛋白，并將蛋白名統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為基因名，最終得到105個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

2.3 慢性萎縮性胃炎靶點(diǎn)獲取及潛在作用靶點(diǎn)獲取結(jié)果 從GeneCards、CTD、TTD 3個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選出647個(gè)慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)，與化濁解毒方的105個(gè)作用靶點(diǎn)取交集，獲得40個(gè)交集靶點(diǎn)，分別為白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、原癌基因JUN、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、血管內(nèi)皮生長因子 A(VEGFA)、腫瘤蛋白53(TP53)、CC趨化因子配體2(CCL2)等。見圖1。

圖1 藥物與疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果 將化濁解毒方的藥物、藥物有效成分及40個(gè)潛在作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。使用Network Analyzer插件對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，在84個(gè)與潛在作用靶點(diǎn)相互作用的有效成分中，槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素及黃芩苷元的Degree值>10，推測這7個(gè)成分是化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的主要有效成分。一種成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)說明了中藥成分整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，多種成分共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象呈現(xiàn)了化濁解毒方重點(diǎn)治療的特點(diǎn)。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(PTGS1)和PTGS2均被多種化合物作用，許多研究發(fā)現(xiàn)，PTGS1和PTGS2在慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[8]。證明本次靶點(diǎn)預(yù)測的方向與現(xiàn)有的研究方向相吻合。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果 將化濁解毒方與慢性萎縮性胃炎40個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING，選取可信度>0.7的蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.1軟件對其進(jìn)行可視化，排除1個(gè)沒有關(guān)聯(lián)關(guān)系的蛋白，PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)中包含39個(gè)節(jié)點(diǎn)，189條邊，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)蛋白，蛋白與蛋白的作用通過線來呈現(xiàn)，線條越多的蛋白說明其參與的生物過程越多。超過平均Degree值9.45的靶點(diǎn)蛋白有16個(gè)，這16個(gè)靶點(diǎn)蛋白可能在慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。將16個(gè)核心靶點(diǎn)按照Degree值大小排序(見表2)。同時(shí)使用Cytoscape 3.7.1的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，其中有1組蛋白的K-core值為4，證明其中的蛋白有著更為緊密的聯(lián)系，它們可能執(zhí)行著同一個(gè)生物過程(見圖4)。在其分析中發(fā)現(xiàn)其包含白細(xì)胞介素相關(guān)因子、抑癌基因、生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)溶解酶，與炎癥、癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，說明化濁解毒方與“炎-癌轉(zhuǎn)化”密切相關(guān)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)聚類分析圖

表2 Degree值排名靠前的靶點(diǎn)蛋白 例

2.6 GO功能富集分析結(jié)果 通過DAVID數(shù)據(jù)庫的GO 富集分析功能，獲得 101個(gè)生物學(xué)過程(BP)(P<0.01)，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、基因表達(dá)的正調(diào)控、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、基因表達(dá)負(fù)調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、對脂多糖的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化、轉(zhuǎn)錄DNA模板、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等方面。17個(gè)細(xì)胞組分(CC) (P<0.05)，包括細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞表面、細(xì)胞器膜、線粒體、小窩、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)等。19個(gè)分子功能(MF)(P<0.01)，包括酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、類固醇結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚活動、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活序列特異性DNA結(jié)合、單胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合、受體信號蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇激素受體活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性等方面。運(yùn)用Rtools將分析結(jié)果按照P值由大到小排序，并將排名前15的條目可視化。見圖5。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

2.7 KEGG 通路富集分析 通過 DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得58條通路(P<0.01)，包括癌癥信號通路TNF信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、膀胱癌、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、T細(xì)胞受體信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體信號通路、核因子κB(NF-κB)信號通路、Toll樣受體信號通路、甲型流感、Ras信號通路、MAPK信號通路。按照P值由大到小排序，并將排名前30 的通路進(jìn)行可視化處理(見圖6)。相關(guān)性較大的癌癥信號通路圖見圖7。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖7 化濁解毒方對慢性萎縮性胃炎作用的癌癥通路靶基因的 KEGG 通路分析

2.8 分子對接結(jié)果 核心靶點(diǎn)IL-6、TNF、MAPK1、VEGFA、PTGS2在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫檢索獲取得到的晶體結(jié)構(gòu)ID依次為：4CNI、2E7A、4IZ5、5F19、4DEQ，與主要有效成分進(jìn)行分子對接。結(jié)果顯示，主要有效成分與核心靶點(diǎn)分子對接的結(jié)合能數(shù)值均為負(fù)值(見表3)，與TNF蛋白的結(jié)合能較高，其中異鼠李素和黃芩苷元通過氫鍵與TNF蛋白結(jié)合，見圖8。提示核心靶點(diǎn)與主要有效成分可以實(shí)現(xiàn)理論上的空間對接。

表3 分子對接結(jié)合能 kcal /mol

圖8 主要有效成分與核心靶點(diǎn)分子對接模式

3 討論

慢性萎縮性胃炎常伴有幽門螺桿菌感染，胃黏膜長期遭受損害易向腸上皮化生、假幽門腺化生、異型增生發(fā)展。有研究表明，有1/50的慢性萎縮性胃炎、1/39的腸上皮化生以及1/19的異型增生患者在20年內(nèi)發(fā)展為胃癌[9]。故慢性萎縮性胃炎的治療策略應(yīng)以抑制“炎-癌轉(zhuǎn)化”為主。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多以對癥治療為主，尚未研發(fā)出針對“炎-癌轉(zhuǎn)化”靶點(diǎn)的特效藥物。國醫(yī)大師李佃貴認(rèn)為，濁毒是慢性萎縮性胃炎發(fā)生發(fā)展的重要因素。現(xiàn)代人工作壓力大，生活節(jié)奏快，常有七情內(nèi)傷損礙肝之疏泄，飲食不節(jié)中傷脾胃運(yùn)化，導(dǎo)致肝木過旺克伐脾土，土虛則水侮。水谷入胃，消于脾陽，現(xiàn)脾陽虛衰，水谷滯于胃腸，中焦不暢，不能上通下達(dá)，日久則濕積不化而成濁，郁而不解而成熱，熱壅血瘀而成毒，終致濁毒內(nèi)蘊(yùn)。濁毒作為病理產(chǎn)物可損害胃黏膜，而濁毒致病具有起病緩慢、癥狀隱匿、病程較長、反復(fù)發(fā)作和纏綿難愈的特點(diǎn)，最終導(dǎo)致慢性萎縮性胃炎。故李佃貴治療慢性萎縮性胃炎多從截?cái)酀岫镜纳扇胧?，方以化濁解毒方。方中以藿香、佩蘭、砂仁芳香之品醒脾運(yùn)脾，化濁辟穢；茵陳、黃連、黃芩、白花蛇舌草清熱化濁解毒；濕濁易化為痰濁，故加半夏以祛痰滌濁解毒；濁毒日久常伴腑氣不通，故加厚樸以通腑降濁；全方以攻逐為主，又加入茯苓以顧護(hù)脾胃之氣。

本研究發(fā)現(xiàn)，化濁解毒方的有效活性成分共84個(gè)，對應(yīng)靶點(diǎn)105個(gè)，與慢性萎縮性胃炎相關(guān)的共同靶點(diǎn)40個(gè)。通過對“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析，得到Degree值>10的有效成分7個(gè)，它們可能是化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的主要有效成分。其中槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、異鼠李素和黃芩苷元同屬黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、消除自由基、抗氧化及抑制腫瘤的作用[10-15]。研究還發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[16]。β-谷甾醇和豆甾醇同屬植物甾醇。β-谷甾醇可降低胃黏膜損傷，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體氧自由基(OFR)清除能力，提升血清一氧化氮含量，抑制TNF-α等炎癥因子的聚集和釋放有關(guān)[17]。豆甾醇在體外具有較強(qiáng)的抗氧化作用[18]?？梢钥闯觯瘽峤舛痉降闹饕行С煞种饕ㄟ^抑制炎癥、抗氧化和促進(jìn)病變細(xì)胞的凋亡起到治療慢性萎縮性胃炎的作用。

接下來，通過對潛在靶點(diǎn)作用的分析來討論化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制。PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，16個(gè)靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。JUN作為一種原癌基因，其編碼的JUN蛋白可形成同源二聚體或與Fos蛋白結(jié)合形成異源二聚體，即為體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子激活物蛋白-1(AP-1)，AP-1可調(diào)控多種細(xì)胞因子、生長因子及炎癥介質(zhì)的釋放，對多種轉(zhuǎn)錄因子如 NF-κB等有著調(diào)控作用，也是多條信號傳導(dǎo)通路中重要的效應(yīng)分子，因而與炎癥、腫瘤等多種疾病有關(guān)[19]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析得出，化濁解毒方的多種有效成分可以作用于JUN蛋白，可能起到了抑制炎癥發(fā)展，使具有癌變傾向的細(xì)胞凋亡的作用。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族中6個(gè)亞型中的一員，是重要的促血管生長因子，VEGF蛋白作為配體作用于VEGF受體后可通過激活磷酯酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)信號通路、MAPK信號通路的方式調(diào)控血管內(nèi)皮的增殖和分化[20]。PTGS2編碼的環(huán)氧化物酶2(COX-2)可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素E2(PGE2)，PGE2可以通過環(huán)磷酸腺苷/環(huán)磷酸腺苷依賴蛋白激酶依賴性蛋白(cAMP/PKA)信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)VEGF的表達(dá)[21]。又有研究表明，幽門螺桿菌感染可使癌前病變中PTGS2的基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)VEGF的表達(dá)[22]。慢性萎縮性胃炎多伴有幽門螺桿菌感染，因而化濁解毒方可以通過抑制PTGS2的表達(dá)，進(jìn)而抑制VEGF的分泌，阻止血管內(nèi)皮增殖、分化。癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移需要血管增生以提供營養(yǎng)，所以抑制血管增生是預(yù)防慢性萎縮性胃炎向胃癌轉(zhuǎn)變的重要方式?；瘽峤舛痉酵ㄟ^作用于PTGS2阻斷了VEGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制了血管增生，減少了病變組織的營養(yǎng)供能，起到間接抑制癌變，發(fā)揮治療的作用。MMP-1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的間質(zhì)膠原酶，與Ca2+、Zn2+等金屬離子結(jié)合后，可以溶解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白質(zhì)，其表達(dá)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[23]。幽門螺桿菌的毒力因子可以通過誘導(dǎo)MAPK/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的激活影響宿主上皮MMP-1的表達(dá)，從而破壞抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障[24]?；瘽峤舛痉娇赡茏饔糜贛MP1，使得MMP1基因表達(dá)下調(diào)，通過保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)從而抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

GO功能富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與靶點(diǎn)最多的BP為RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控。真核生物蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種蛋白的共同參與，其非常重要的一組即為轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體[25]。RNA聚合酶Ⅱ由7～10個(gè)亞基形成，其中核心啟動子是RNA聚合酶與普通轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，二者結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體后才能在正確的位置開始轉(zhuǎn)錄[26]。化濁解毒方可導(dǎo)致RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控，發(fā)揮間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。

KEGG通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化濁解毒方通過多條通路來干預(yù)慢性萎縮性胃炎的進(jìn)展。癌癥信號通路是多條與癌癥相關(guān)的通路的集合，通過對幾條通路的分析可以看出，化濁解毒方作用于癌癥信號通路中的MAPK信號通路和HIF-1信號通路。MAPK 是真核生物中一組具備高度保守結(jié)構(gòu)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被認(rèn)為是細(xì)胞生理學(xué)和免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞因子。其將從細(xì)胞質(zhì)接收到的信號傳遞至細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具備一系列的生物功能，包括細(xì)胞增殖、分化及凋亡、應(yīng)激、炎癥、先天免疫等[27-28]。MAPK信號通路有3條主要的途徑，即MAPK經(jīng)典通路、JUK/p38 MAPK通路、ERK5/MAPK信號通路?；瘽峤舛痉街饕饔糜贛APK經(jīng)典通路。各種細(xì)胞因子均可激活MAPK信號通路，激活Ras通路，進(jìn)而促進(jìn)MAPK的級聯(lián)激活[29]。通過研究KEGG通路發(fā)現(xiàn)，化濁解毒方的有效成分可作用于上游的ERK抑制MAPK信號通路，調(diào)整細(xì)胞周期，使病變或癌變的胃黏膜細(xì)胞凋亡，起到治療的作用。HIF-1是一種表達(dá)于細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子，是由HIF-1α和HIF-1β共同組成的異源二聚體，其中HIF-1α在有氧環(huán)境下被泛素-蛋白酶水解復(fù)合體降解，因而只有在缺氧環(huán)境下HIF-1α的降解被抑制時(shí)，HIF-1才可以表達(dá)活性，故又被稱為低氧誘導(dǎo)因子-1[30]。HIF-1信號通路主要通過腫瘤血管的生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程及抗腫瘤細(xì)胞凋亡參與腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[31]。HIF-1可以促進(jìn)VEGF的分泌，VEGF則可以刺激腫瘤血管生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞大量生長和增殖[32]。動物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HIF-1α可以通過上調(diào)Slug基因的表達(dá)，促使腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的發(fā)生[33]；HIF-1信號通路通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄從而抵抗腫瘤細(xì)胞凋亡，增加腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[34-35]。通過HIF-1信號通路圖可以看出，化濁解毒方的有效成分通過作用于VEGF從而抑制HIF-1信號通路的部分作用。

通過分子對接發(fā)現(xiàn)，化濁解毒方的主要有效成分與TNF的結(jié)合最為緊密。TNF可以通過直接殺傷作用、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，也可以通過作用于IL-1、IL-8、IL-12、IL-18等炎癥因子調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[36]。故化濁解毒方可能有良好的抑制“炎-癌轉(zhuǎn)化”的作用。

本研究旨在發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接的優(yōu)勢，對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行歸納研究，初步預(yù)測化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的有效成分、潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制。結(jié)果顯示，84個(gè)有效成分作用的105個(gè)靶點(diǎn)內(nèi)有40個(gè)靶點(diǎn)與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)?；瘽峤舛痉降挠行С煞滞ㄟ^干預(yù)這些靶點(diǎn)可以起到抗炎、抗氧化、正向調(diào)控細(xì)胞凋亡、負(fù)向調(diào)控血管內(nèi)皮增生、保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)等作用，進(jìn)而發(fā)揮治療作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，化濁解毒方可作用于30條信號通路，部分可能與慢性萎縮性胃炎的防治相關(guān)，為日后的實(shí)驗(yàn)研究、靶向藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。但由于生化研究發(fā)展日新月異，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所使用的數(shù)據(jù)庫通常更新緩慢，且方法尚未完善；分子對接技術(shù)只能驗(yàn)證其在空間結(jié)構(gòu)的楔合度，所以得到的結(jié)論在可信度上存疑，有待于更新、更好的數(shù)據(jù)方法或動物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。