H9N2亞型AIV NA基因多聚腺苷酸化信號位點對病毒復制的影響

羅鈺雯，夏 靜，李念靈，李永新，申玉璽，李淑蕓，陳 雯，樊順怡，崔 敏， 黃 勇

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype of Avian influenza virues，H9N2 AIV)于1966年在美國威斯康星州首次被分離，至今蔓延全球，此病毒造成禽類呼吸困難，產(chǎn)蛋量下降。H9N2 AIV致病性較低，但其易與其他病原體混合感染禽類，導致病情加重，從而造成巨大的經(jīng)濟損失。H9N2 AIV在我國廣泛流行，在雞、鴨、鵪鶉、野雞、鷓鴣、鴿子、白鷺和豬等動物中均已分離到。遺傳進化分析表明，在我國雞群中病毒主要流行亞型為Y280-like，而G1-like亞型僅在鵪鶉等珍禽中流行。此外，H9N2 AIV還可突破物種屏障，造成人的感染。截至2020年，世界衛(wèi)生組織(WHO)和中國疾病預防控制中心(CDC)共報告50例人感染H9N2的病例，且主要屬于Y280-like亞型，所幸暫無人傳人的報道。H9N2病毒除了可以從禽直接感染人之外，還可通過豬、寵物狗等其他中間哺乳動物感染人。此外，H9N2 AIV還為H5N1、H1N1、H7N10等AIV亞型提供內部基因。因此，H9N2 AIV成為具有大流行潛力的流感病毒之一。

流感病毒的基因組由8段負鏈RNA組成，基因組RNA(vRNAs)是病毒mRNA和cRNA在感染細胞中合成的模板。病毒mRNAs是vRNAs的不完全拷貝。在vRNA的3′端啟動mRNA合成，以從宿主mRNAs搶奪的10～13個核苷酸的含帽片段作為引物，mRNA合成終止于距vRNA 5′端尿苷殘基16個核苷酸的延伸處，最后加入poly(A)尾。研究表明，在甲型AIV RNA 5′端附近的一段尿嘧啶(U)是病毒mRNA合成的多腺苷化位點。在AIV的轉錄過程中，vRNA5′端末始終與RNA依賴的RNA聚合酶復合體相結合，而vRNA模板則以3′到5′的方向通過聚合酶復合體。由于5′末端存在5～7個堿基U，于是反復拷貝堿基U，從而產(chǎn)生一個poly(A)尾。vRNA模板的5～7個堿基U形成的聚腺苷酸化信號對于病毒基因的轉錄至關重要。當vRNA模板的5′末端發(fā)生突變時，失去與聚合酶的結合作用或導致結合能力減弱時，就會抑制聚腺苷酸化過程。而當vRNA模板的5′端一連串U被替換為A時，就會轉錄產(chǎn)生帶有poly(U)尾巴的mRNA轉錄本，因此不能由細胞核輸出到細胞質中。

本實驗室于2014年從四川省德陽市的蛋雞場分離一株H9N2 AIV，命名為A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)。該分離株臨床上可引起雞群明顯的呼吸困難，剖檢可見嚴重的氣管和肺出血，發(fā)病率約40%?；蜻z傳進化分析顯示，A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)屬于Y280-like亞型h9.4.2.5分支。對近年來H9N2 AIV分離株的全基因組核苷酸序列分析顯示，基因5′端多聚腺苷酸化信號位點處具有多樣性，多為5個(U)或6個(U)連續(xù)的堿基U，而其他基因則為單一的U結構。因此，本研究以該分離株為骨架，構建H9N2反向遺傳操作系統(tǒng)，同時對基因5′端多聚腺苷酸化信號位點5個或6個堿基U是否影響病毒的生物學特性進行了初步的探究。

1 材料與方法

1.1 毒株與載體

A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)(以下簡稱CQY-H9N2)AIV由本實驗室分離保存；pHW2000質粒購于淼靈質粒平臺。

1.2 菌種、細胞與實驗動物

TOP10感受態(tài)細胞購自上海擎科生物科技有限公司；MDCK細胞由四川省自貢市疾病預防控制中心提供；293T細胞由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院豬病研究中心提供；SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.3 主要試劑

PrimeSTAR Max Premix (2×)、Premix(TaKaRaVersion 2.0 plus dye)、5×PrimeScript RT Master Mix、QuickcutⅠ限制性核酸內切酶、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit均購自TaKaRa公司；Gel&PCR Clean Up Kit購自OMEGA公司；SE無縫克隆和組裝試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；質粒小提試劑盒、無內毒素質粒小提中量試劑盒購自TIANGEN公司；FBS胎牛血清購自PAN公司；脂質體轉染試劑盒Lipofectamine3000 Reagent Protocol購自ThermoFisher公司。

1.4 病毒的擴繁

將本實驗室保存的CQY-H9N2株稀釋1 000倍，采用絨毛尿囊腔接種法接種于9～10日齡的SPF雞胚。棄去24 h內死亡雞胚，連續(xù)培養(yǎng)72 h后無菌收集絨毛尿囊液，并按照已建立的檢測方法對尿囊液進行病毒檢測。

1.5 病毒RNA的提取及目的片段的擴增

病毒RNA的提取方法按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒說明書進行，從200 μL陽性尿囊液中抽提病毒的總RNA后立即沸水浴3 min，冰水浴2 min，隨后進行反轉錄。反轉錄體系為RNA 5 μL，5 × PrimeScript RT Master Mix 4 μL，ddHO補足至20 μL。反應程序為37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。以此 cDNA 為模板，使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶和表1中的克隆引物分別擴增CQY-H9N2的8個片段：2、1、、、、、、，目的片段純化回收后，由生工生物工程(上海)股份有限公司成都分公司進行測序，序列信息上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號：MW493190-MW493196、MW493229。

1.6 重組質粒的構建

為減少克隆步驟，以及避免目的片段中IIs型內切酶位點B I和I的沉默突變，本研究采用同源重組的方法將CQY-H9N2的八段基因分別克隆入pHW2000質粒中。質粒采用PCR擴增的方式線性化，質粒擴增引物為pHW2000F：CCCCCCCAACTTCGGAGGTC和pHW2000R：AATAACCCGGCGGCCCAAAA。使用SE無縫克隆和組裝試劑盒將回收的線性化質粒和1.5節(jié)中獲得的目的片段進行同源重組，載體與目的片段的摩爾比為1∶(2～4)，37 ℃連接30 min后將重組子轉化至 TOP10 感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)20 h后進行菌落PCR鑒定。菌落PCR陽性菌置于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，采用無內毒素質粒提取試劑盒抽提質粒，單酶切鑒定無誤后將質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，每個片段測3個樣本，選取無突變的質粒保存?zhèn)溆?表1)。

表1 同源重組法構建重組質粒的引物

1.7 細胞轉染與病毒拯救

將293T細胞培養(yǎng)于12孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長至85%～90%時進行轉染。轉染步驟按照Lipofectamine3000 Reagent Protocol說明書進行，具體如下：取2個無菌的EP管，編號為A和B。A管中加入1.87 μL Lipofectamine3000 Reagent和62.5 μL opti-MEM培養(yǎng)基，靜置5 min；B管中加入8個重組質粒(每種質粒200 ng)和5 μL Lipofectamine3000和62.5 μL opti-MEM培養(yǎng)基。將A和B管混合后室溫靜置孵育15 min。用預熱的opti-MEM培養(yǎng)基清洗細胞2～3次，將AB混合液加入至細胞中，于37 ℃、5% CO的細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入1 mL opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24～36 h。收集細胞和上清液，反復凍融3次后離心，將上清接種于密度為90%的MDCK細胞中，培養(yǎng)6 h后加入終濃度為2 μg·mL的TPCK-Trypsin，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細胞和上清液連續(xù)盲傳3代后，收集細胞上清進行血凝試驗和RT-PCR檢測。拯救成功的病毒分別命名為rCQYU-H9N2與rCQYU-H9N2。

1.8 病毒的基因組測序

將拯救的CQY-H9N2毒株進行基因組序列測定，以確定病毒在拯救過程中是否發(fā)生突變。具體操作方法參考1.5節(jié)進行。

1.9 EID50、TCID50和MOI的測定

rCQY-H9N2毒株與親本毒株的TCID和EID的測定參照Reed-Muench法進行。

1.10 生長曲線的比較

將 MDCK 細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞形成單層后用預熱的opti-MEM培養(yǎng)基清洗3次，將病毒以10TCID的劑量接種于6孔板中，放入細胞培養(yǎng)箱中吸附1 h，用 PBS 清洗3次后加入2 μg·mLTPCK-Trypsin opti-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以10EID的病毒劑量接種10日齡SPF雞胚，在37 ℃下孵育。分別在接種MDCK和雞胚后2 、4 、6 、12 、24 、36 、48 、72 h 收取細胞上清或絨毛尿囊液，進行熒光定量測定其核酸拷貝數(shù)，然后繪制病毒的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 目的片段的PCR擴增結果

提取病毒的總RNA，反轉錄獲得病毒的cDNA，然后通過聚合酶鏈式反應擴增目的基因片段。結果顯示，通過RT-PCR擴增出的2、1、、、、、、目的片段的大小與目標序列是相同的(圖1)。

M1， DL2000 DNA Marker； M2， DL5000 DNA Marker； NS～PB2，引物NS～PB2的PCR擴增產(chǎn)物。M1， DL2000 DNA Marker； M2， DL5000 DNA Marker； NS-PB2，PCR products of primer NS-PB2.圖1 A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2) 毒株全基因RT-PCR結果Fig.1 A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2) strain whole-genome RT-PCR result

2.2 構建重組質粒及拯救病毒

將純化的目的片段與pHW2000載體同源重組后，轉化至TOP10感受態(tài)細胞中。提取質粒并測序，通過序列比對可知，本研究構建的8個質粒核苷酸序列均無突變。通過脂質體轉染的方法將這8個重組質粒轉染293T細胞后并在MDCK上盲傳3代，細胞出現(xiàn)變圓、脫落，形成空斑病變(圖2)，成功獲得拯救病毒rCQYU-H9N2與rCQYU-H9N2。

A，正常 MDCK 細胞；B，接種500 μL 的rCQYU5-H9N2在48 h MDCK 細胞 CPE；C，接種500 μL 的rCQYU6-H9N2在48 h MDCK 細胞 CPE；D，接種500 μL 的CQY-H9N2 在48 h MDCK細胞CPE。A， Normal MDCK cells； B， MDCK cells were inoculated with 500 μL rCQYU5-H9N2 influenza virus CPE at 48 h； C， MDCK cells were inoculated with 500 μL rCQYU6-H9N2 influenza virus CPE at 48 h；D， MDCK cells were inoculated with 500 μL CQY-H9N2 influenza virus CPE at 48 h.圖2 rCQY-H9N2在 MDCK 細胞培養(yǎng)中的細胞病變Fig.2 Cytopathy of rCQY-H9N2 in MDCK cell culture

2.3 rCQY-H9N2 毒株的鑒定和其與親本毒株血凝效價 、EID50和TCID50 的測定

rCQYU-H9N2毒株的血凝效價、EID和TCID滴度與親本毒株無明顯差異，但高于rCQYU-H9N2株(表2)。

表2 病毒生物學特性

2.4 rCQY-H9N2 毒株與親本病毒在MDCK和雞胚上生長曲線比較

rCQY-H9N2 (rCQYU-H9N2和rCQYU-H9N2)與親本毒株在雞胚和MDCK上均可高效復制，其生長曲線無顯著性差異，結果見圖3。

A， 病毒在MDCK細胞中的生長曲線；B，病毒在雞胚中的生長曲線。拷貝數(shù)以單位體積(1 μL)核酸拷貝數(shù)量的指數(shù)對數(shù)值表示。A，Growth curves of virus on MDCK cells； B， Growth curves of virus on chicken embryo. Copy number was expressed as the logarithm of the number of nucleic acid copies per unit volume (1 μL).圖3 病毒在雞胚和MDCK細胞中的生長曲線Fig.3 Growth curves of virus on chicken embryo and MDCK cells

3 討論

在克隆過程中，由于流感病毒為分段RNA病毒，經(jīng)典方法采用B Ⅰ雙酶切線性化質粒與目的片段。但是由于B Ⅰ酶切效率較低且該質粒需要進行雙酶切，因此盡管延長酶切時間，增大酶量，仍然會有環(huán)狀質粒存在，且酶切后由于黏性末端的存在，線性質粒易產(chǎn)生自連，這使得克隆過程中假陽性率高，嚴重干擾試驗結果。此外，由于多數(shù)流感病毒基因組含有II型酶切位點B Ⅰ和Ⅰ，因此，較多研究采用沉默突變方法改變基因組序列，耗時耗力。本試驗采用PCR擴增線性化質粒和同源重組克隆，在一定程度上減少了質粒自連以及酶切效率低的問題，陽性克隆效率為50%～90%。轉染細胞選擇方面，大多文獻使用293T細胞與MDCK細胞混合培養(yǎng)進行轉染，本試驗發(fā)現(xiàn)，二者混合培養(yǎng)，MDCK細胞對293T細胞的生長具有抑制作用，293T細胞活性差，從而無法達到轉染條件。因此，本試驗僅采用293T細胞進行轉染，且在293T細胞培養(yǎng)期間不添加經(jīng)典方法中的TPCK-Trypsin，以確保293T細胞的活性。

我們成功構建出A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014反向遺傳操作平臺，并利用該平臺初步探究了基因5′末端多聚腺苷酸化信號位置連續(xù)的U與U對病毒生物學特性的影響。研究結果表明，H9N2 AIV基因5′末端多聚腺苷酸化信號連續(xù)的U或U對病毒的轉染沒有影響，這與Li等的研究結果相同。而HA、EID與TCID結果顯示的rCQYU-H9N2滴度低于rCQYU-H9N2與親本毒株，與Li等的研究結果略有差異。

流感病毒的vRNA是轉錄產(chǎn)生mRNA和復制產(chǎn)生cRNA并最終合成子代病毒vRNA的模板。從vRNA模板5′端開始到多聚腺苷酸化信號位點有16個堿基(16 nt)，與3′末端互補配對形成柄狀結構，研究表明這16個堿基至關重要，寡核苷酸(U)群僅向5′端遷移一位(16 nt → 15 nt)可顯著降低多聚腺苷酸化水平。在準確合成cRNA的過程中，流感病毒RNA聚合酶必須在復制時選擇忽略多聚腺苷酸化信號。在Li等的研究中，vRNA 5′端多聚腺苷酸化信號位點U轉錄生成的mRNA比U多出13%，因此，我們推測，流感病毒的vRNA模板5′端多聚腺苷酸化信號位點U的個數(shù)越多，復制時RNA聚合酶反復拷貝vRNA的U段錯誤合成poly(A)的幾率越大。在某些情況下，病毒RNA聚合酶在合成cRNA時可能做出了錯誤的選擇，從而導致在U段停止復制。這種情況可能發(fā)生的比較頻繁，在大多數(shù)情況下，RNA聚合酶的錯誤合成poly(A)將形成無功能的cRNA模板，而這種cRNA模板無法合成子代病毒的vRNA，從而導致病毒滴度降低。