兩種SD大鼠酒精依賴自由飲模型的建立

李 齊 安子宜 董澤嵩 劉洪鳳 李 姝 畢鵬翔 霍楠楠 朱曉峰*

（1.牡丹江醫(yī)學院生化教研室，黑龍江 牡丹江，157011；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯，154000；3.開灤總醫(yī)院檢驗科，河北 唐山，063001；4.麗水市中心醫(yī)院檢驗科，浙江 麗水 323000；5.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院神經科，黑龍江 牡丹江，157011）

酒精依賴綜合征，是現(xiàn)今最為常見的物質依賴疾病之一。到目前為止，酒精依賴的患病人數(shù)僅次于尼古丁依賴綜合征，已經成為全球第二大的成癮物質，全球大約有4.9%（約2.4億）的人群受到影響。因為酒精病死的人數(shù)約占總病死人數(shù)的5.9%。根據2015年全球疾病研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)達國家的致殘致死的5個重要原因之一就是酒精依賴。中國流行病學研究顯示，我國酒精依賴和濫用問題也在日益增多，酒精依賴的研究也隨之增多?，F(xiàn)今國內外最常使用的構建酒精依賴大鼠模型的模式主要包括灌胃、自由飲、腹腔注射等方式。本研究通過大鼠自由飲方式，構建了2種不同酒精濃度的酒精依賴大鼠模型，為酒精依賴綜合征的相關研究提供了科學模型方面的實驗根據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本研究選取6周齡、體質量180～200 g、SPF級雄性SD大鼠30只，購于牡丹江醫(yī)學院動物房[SYXK（黑）2019-003]。動物模型構建及其相關檢測在牡丹江醫(yī)學院SPF級實驗動物中心鼠類實驗室[SYXK（黑）2019-006]進行。全部大鼠的飼養(yǎng)和使用都按《國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南》進行操作，并且符合牡丹江醫(yī)學院實驗動物管理條例。

1.1.2 試劑及儀器

無水乙醇（生產企業(yè)：深圳邁瑞公司）；高架十字迷宮（生產企業(yè)：上海移數(shù)信息科技有限公司）；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（生產企業(yè)：成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 酒精依賴大鼠模型的構建

將30只大鼠單籠飼養(yǎng)，室溫維持在22～24 ℃，光照/黑暗周期為12 h/12 h，環(huán)境濕度55%左右。實驗之前使用隨機數(shù)表法將大鼠分為3組，每組10只，即對照組（a組），10%自由飲酒精依賴模型組（b組）和20%自由飲酒精依賴模型組（c組）。3組大鼠均每周更換墊料，并對其體質量進行稱量記錄。其中a組雙瓶蒸餾水自由飲喂養(yǎng)。b組在適應性喂養(yǎng)1周后，開始建模喂養(yǎng)，實驗過程中飲食正常，飲水則是每個籠內放置2個飲水瓶。2個水瓶分別是10%酒精溶液和蒸餾水，構建模型期間，每天早上8：00分別測量飲酒量（mL/24 h）和飲水量（mL/24 h），并記錄飲酒及飲水的數(shù)據。為了避免形成位置偏差，每天必須要交替更換酒瓶和水瓶的位置。所有蒸餾水和10%酒精溶液必須更新1次/d，持續(xù)造模4周，共28 d。c組同b組一樣，在適應性喂養(yǎng)1周后，開始建模喂養(yǎng)，實驗過程中飲食正常，飲水則是每個籠內放置2個飲水瓶。第1天8：00雙瓶分別為20%酒精溶液和蒸餾水，第2天8：00分別測量飲酒量（mL/24 h）和飲水量（mL/24 h），并且將裝20%酒精的水瓶替換為蒸餾水瓶，即第2 天大鼠飲用的是雙瓶蒸餾水，如此反復進行交替。為了避免形成位置偏差，每次必須要交替更換水瓶和酒瓶的位置。所有蒸餾水和20%酒精溶液必須更新1次/d，持續(xù)造模4周，共28 d。

1.2.2 酒精偏好的測定

構建模型成功后，計算b組和c組的酒精偏好。計算酒精偏好主要是為了掌握大鼠每天消耗的酒精量占了總液體（酒精+蒸餾水）的消耗量百分比，也就是酒精偏好（%）=酒精的消耗總量（mL）/（酒精的消耗總量+水的消耗總量）（mL）×100%。

1.2.3 高架十字迷宮檢測（Elevated plus maze，EPM）

在最后1次飲酒24 h后，把30只大鼠放置在室溫恒定（24 ℃）、室內光線昏暗恒定的測試實驗室中，全程保持安靜，對3組大鼠完成高架十字迷宮的測試。十字高架位于地面上方的65 cm處，由2條開放臂、2條閉合臂以及中央區(qū)共同組成。點擊EPM測試系統(tǒng)，設置本次測試實驗的參數(shù)（包括開放臂和閉合壁進入次數(shù)、開放臂和閉合壁滯留時間、動物運動總距離等），完畢后，把大鼠放置在設備“十”字正中央位置，每只大鼠的測試時間為3 min。每次檢測完畢后，一定要使用乙醇棉球對整個設備擦拭，然后再繼續(xù)進行下一只大鼠測試。實驗參數(shù)：開放臂進入次數(shù)（OE，次）：即大鼠進入到EPM任意一條開放臂的次數(shù)，每次活動的開始是以該鼠的4個爪都進入到開放臂內或者大鼠軀體約有80%進入臂內開始，在實驗中途有1個爪從該開放臂中完全撤出即認為本次的進入活動結束；開放臂滯留時間（OT，s）：即大鼠進入到開放臂中所停留的時間；總路程（cm）：即大鼠在十字高架中行動的總距離。數(shù)據分析使用EPM自帶的動物行為學軟件完成。大鼠進入任意一條開放臂的次數(shù)越少，在開放臂里滯留的時間越短，則說明大鼠焦慮情況越加的嚴重。

1.2.4 水迷宮測試（Morris water Maze，MWM）

Morris水迷宮圓形的水池池壁，黑色的池底，在水池的四周掛避光的窗簾，對實驗區(qū)域光線進行遮擋。水池根據實驗等分成為四個區(qū)域（即四個象限）。第一象限的中間放置一個水面以下0.5 cm 的平臺，平臺可以被拆除。每次實驗都需要將大鼠移開，并用吹風機將其吹干，放回籠內。Morris水迷宮可以用來檢測酒精自由飲模型的學習與記憶能力（包括空間探索實驗和定位航行實驗）。定位航行實驗需要連續(xù)進行4 d，固定時間段訓練，2次/d，每次訓練時間間隔15 min，游泳訓練時間為60 s/次，每次訓練要從池壁4個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池。如果大鼠在60 s內能夠找到平臺，就讓它呆在平臺上30 s，加強大鼠的學習記憶；如果60 s內未找到平臺，就把它用工具引導到平臺上并且使其停留30 s。以大鼠每天每次到達路徑長度（游泳距離）和平臺的時間（潛伏期）進行測量，如果游泳距離和潛伏期越短，則說明其學習能力越強?？臻g探索實驗是需要在定位航行實驗結束之后24 h進行，對動物空間位置記憶的保持能力進行測量，只需要進行1次。定位航行實驗和本次實驗的差異在于要將水面高度調節(jié)到預定的高度之后需要移除平臺，大鼠在目標象限的對側放出，游泳時間延長為120 s。在空間探索實驗中，記錄大鼠在目標象限的停留時間和穿越目標象限的次數(shù)。穿越平臺次數(shù)越多，在平臺所在象限游泳停留時間越長，就說明大鼠學習能力越強。

1.2.4 酒精戒斷綜合征評分（scores of ethanol withdrawal syndrome，EWS）

根據Motaghine-jad M等的方法，在最后1次飲酒24 h后對3組大鼠進行改良酒精戒斷行為學的觀測評分，30只大鼠都需要在同一環(huán)境下進行評分觀測。觀測項目包括了5個項目和總評分，即刻板行為、激惹性、尾巴強直、異常姿勢和聽源性癲癇發(fā)作情況以及總評分，其中5個項目相加為總評分，每個項目的評分增高說明戒斷的癥狀在加重。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 10%酒精依賴模型組和20%酒精依賴模型組的體質量、飲酒量和飲酒偏好

2.1.1 3組大鼠體質量比較

實驗前，3組大鼠體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=1.206，P=0.315）。實驗結束時，飲酒組（b組和c組）與對照組（a組）大鼠體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.905，P=0.416）。見圖 1。

圖1 3組大鼠體質量變化情況

2.1.2 建模期內3組大鼠飲酒量、飲水量和酒精偏好

在雙瓶（酒精+蒸餾水）自由飲喂養(yǎng)模式下，b組在經歷了連續(xù)28次雙瓶自由飲，在最后7 d的酒精攝入量（16.80±0.63）mL/24 h保持穩(wěn)定，飲水量（11.90±0.39）mL/24 h穩(wěn)定，酒精偏好穩(wěn)定在（57.74±1.83）%，差異無統(tǒng)計學差異（F=1.762，P=0.121）。見圖2（A和B）。c組在經歷了14次循環(huán)（28 d）間歇性雙瓶飲時，酒精的攝入量逐步增多，直至達到平臺期（16.65±1.31）mL/24 h，而飲水量伴隨著飲酒量的增多而減低，直至穩(wěn)定在了（10.30±0.98）mL/24 h，酒精偏好增加至（61.77±2.81）%。見圖3（C和D）。

圖2A b組大鼠最后7 d飲酒量、飲水量

圖2B b組大鼠最后7 d酒精偏好變化

圖3C c組大鼠飲酒量、飲水量

圖3D c組大鼠酒精偏好變化

2.2 高架十字迷宮測試（EPM）比較各組行為學變化

在b、c組最后1 d飲酒后24 h，對3組大鼠進行EPM檢測。與a組比較，2組模型組在EPM測試中，其開放臂探索次數(shù)和時間均明顯減少，b組開放臂探索次數(shù)更少，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.946，P＜0.05），開放臂探索時間更短，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.021，P＜0.05）；c組開放臂探索次數(shù)更少，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.589，P＜0.01），開放臂探索時間更短，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.045，P＜0.05）。3組大鼠總運動距離分別為（999.12±3.24）cm、（1 001.01±3.95） cm 和（999.98±3.67）cm，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.680，P=0.515）。以上結果說明，酒精依賴大鼠在酒精戒斷后能夠出現(xiàn)焦慮行為，但酒精對大鼠的運動能力無明顯的影響。高架十字迷宮的測試結果。見表1。

表1 3組大鼠高架十字迷宮實驗結果比較 （）

2.3 3 組大鼠水迷宮實驗結果

2.3.1 3 組大鼠游泳總距離和潛伏期比較

在定位航行實驗進行中，與a組相比，b組、c組大鼠記憶和學習能力明顯下降，其游泳總距離明顯變短，潛伏期也明顯縮短，其中實驗第2天，b組、c組與a組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=-4.344，P＜0.05；t=-2.320，P＜0.05）；實驗第3天，b組、c組與a組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=-4.321，P＜0.05；t=-2.964，P＜0.05）；實驗第 4天，b組、c組與a組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=-5.090，P＜0.05；t=-4.117，P＜0.05）。見表 2、表 3。

表2 3組大鼠在4 d實驗日潛伏期比較 （，s）

表3 3組大鼠在4 d實驗日游泳總距離比較 （，cm）

2.3.2 3組大鼠穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間比較

實驗第5天，MWM進行空間探索實驗，與a組比較，b組、c組在目標象限（即第一象限）滯留時間變少，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.254，P＜0.05；t=4.011，P＜0.05）；與 a組比較，b組、c組平臺穿越次數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.517，P＜0.05；t=3.591，P＜0.05）。見表4。

表4 3組大鼠目標象限滯留時間和穿越平臺次數(shù)比較 （）

2.4 酒精戒斷評分對大鼠的戒酒癥狀的評價

b組、c組在飲酒期間很溫順，不容易被激惹，并很少會出現(xiàn)攻擊性行動。與a組（2.50±0.71）分比較，b組（11.05±0.97）分、c組（12.10±0.99）分在戒酒24 h的戒斷總評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=-23.681，P＜0.05；t=-24.878，P＜0.05）。見圖 4。

圖4 3組大鼠的酒精戒斷綜合征評分比較

3 討論

構建成功的實驗動物模型是進行科學研究的第一個非常關鍵的步驟。國內外在構建酒精依賴模型的時候多會選用灌胃、腹腔注射以及自由飲的方法，各有優(yōu)缺點。根據文獻分析，酒精依賴的大鼠模型假如用自由飲模式進行模型的構建，則會避免對大鼠腹腔連續(xù)注射酒精而引起的感染，以及灌胃大鼠致使的上消化道不適，從而降低了造模大鼠的死亡率。同時，自由飲構建酒精依賴模型更符合人的飲酒方式，更適合做后續(xù)酒精依賴實驗研究。但是自由飲模型也有缺陷，即動物對酒精的喜好影響了模型的構建。因此，本研究選擇雄性大鼠進行實驗，在構建模型后，對模型進行行為學測試，篩選出已經成功的模型。目前自由飲構建模型的方法很多，本研究選用大鼠來制備10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型組和20%雙瓶自由間歇性飲酒模型組。結果表明，以上2種不同的制備模型方法都能達到實驗要求，10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型組在最后7 d的酒精攝入量保持穩(wěn)定，酒精偏好穩(wěn)定，該實驗的結果和Sona Khan M等構建動物自由飲模型的結果接近；20%雙瓶自由間歇性飲酒模型組在通過28 d間歇性酒精造模，其酒精攝入量在逐步增多，最后到達平臺期，該實驗的結果和Hwa L S等構建動物自由飲模型的結果相類似。EPM中2組模型組與對照組相比較發(fā)現(xiàn)，在開放臂中探索時間與次數(shù)均明顯降低。在水迷宮實驗中，大鼠記憶和學習能力明顯降低，即說明長時間的飲酒，會導致記憶和學習能力明顯下降。通過自愿飲酒量的增加，以及酒精偏好的增加，提示了本實驗已經成功建立大鼠的酒精依賴模型，大鼠的行為學測試也說明自由飲的造模效果很好。

綜上所述，10%持續(xù)自由飲和20%間斷自由飲的建模方法均可以進行酒精依賴的后續(xù)相關的動物實驗研究。