2種芳香萬壽菊精油的GC-MS分析與抑菌活性研究

陳品品，陳日忠，馬曉娟，劉 靚，蔡錦玲，莊衛(wèi)東

（1.泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建泉州 362212；2.福建泉州東潤園農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，福建泉州 362018）

芳香萬壽菊（A.Gray）又名墨西哥龍蒿、檸檬萬壽菊，為菊科萬壽菊屬（L.）多年生草本亞灌木，原產(chǎn)于美洲中部以及墨西哥等地。芳香萬壽菊花期較長，全年都有花朵，花盛期在9月中旬至次年3月上旬，花朵具有明亮的黃色，葉背有豐富的油腺點(diǎn)（圖1）。植株與花朵散發(fā)著濃郁的百香果清香，葉片和花朵皆可食用，嫩葉泡茶可作飲料，能降火去燥，還可用于廚房烹調(diào)，也適合作插花材料，是建設(shè)香草觀光園和香化工程的優(yōu)秀品種，近幾年備受歡迎。

圖1 芳香萬壽菊花和葉

萬壽菊屬植物中萬壽菊（L.）的研究報(bào)道較多。萬壽菊葉、花均含精油，其主要化學(xué)成分有葉黃素、黃酮、α-三聯(lián)噻吩和萜類等，具有抗氧化、抗菌、殺蟲等多種生物學(xué)活性。萬壽菊莖葉乙醇提取物具有鎮(zhèn)痛抗炎活性。但尚未有對芳香萬壽菊精油成分進(jìn)行分析和抑菌效果研究的報(bào)道。

本文首次以泉州地區(qū)引進(jìn)種植的芳香萬壽菊的花、葉為研究對象，利用水蒸氣蒸餾法提取精油，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析比較其化學(xué)組成，并比較2種精油對匍枝根霉（）、 鏈 格 孢（）、灰葡萄孢菌（）、粉紅單端孢（）和意大利青霉（）5種真菌的抑制效果，旨在為進(jìn)一步開發(fā)和利用芳香萬壽菊精油抑菌劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

試驗(yàn)材料：采集自泉州市農(nóng)業(yè)科技園區(qū)（E118°38'～119°05'，N24°29'～25°15'）香藥植物資源引種圃內(nèi)長勢良好的芳香萬壽菊的花和葉，整個(gè)田間隨機(jī)取樣。

供試菌種：匍枝根霉、鏈格孢、灰葡萄孢、粉紅單端孢和意大利青霉是從番茄中分離、純化和鑒定后得到。

儀器：SJ-HX001多功能植物萃取物（精油）生產(chǎn)機(jī)組，購自福建世紀(jì)海峽農(nóng)業(yè)發(fā)展投資有限公司；7890B-5977氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，購自美國安捷倫公司；CP2202C電子天平，購自上海奧豪斯儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；TS2200945壓力蒸汽滅菌鍋，購自日本株式會(huì)社平山制作所；Classic DI超純水機(jī)，購自德國ELGA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芳香萬壽菊精油提取與成分分析 水蒸氣蒸餾法提取芳香萬壽菊精油，準(zhǔn)確稱取1 000 g芳香萬壽菊花（葉），洗凈剪碎，加入5 000 mL蒸餾水，振搖混勻后，隔水提取2.5 h，靜置分層后收集精油，于4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩? 000 g芳香萬壽菊樣品提取得到精油的得率為0.52%（花）和0.50%（葉）。供試的2種芳香萬壽菊的含油率均高于萬壽菊的含油率（0.37%）。2種精油皆有特殊的百香果濃郁香味，呈淡金黃色。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為230℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；恒定流量0.8 mL·min；分流比50∶1；溶劑延遲3 min；進(jìn)樣量1.0 μL。

升溫程序：初始溫度為45℃，保持2 min，以20℃·min升至150℃，以4℃·min升至250℃，保持5 min，總時(shí)長37.25 min。

質(zhì)譜條件：四級桿溫度150℃，離子源溫度250℃，電離方式EI電離，電子能量70 eV，掃描范圍50～600 m·z，溶劑延遲時(shí)間5 min；采集方式SCAN掃描。

數(shù)據(jù)處理與質(zhì)譜檢索：各峰經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫比對，參閱有關(guān)文獻(xiàn)，并采用峰面積歸一化法確定組分的相對百分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 芳香萬壽菊精油最低抑菌濃度（MIC）的測定精油的制備：用0.002%吐溫-80將精油配制成10 μL·mL濃度，超聲波超聲5 min備用。

菌懸液的制備：用接種環(huán)取5種供試菌分別裝入有10 mL無菌水的試管中，配制成1×10cfu·mL的懸浮液，振蕩器使其混合均勻備用。

用二倍稀釋法配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μL·mL的精油培養(yǎng)基，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，無菌對照組不添加，28℃培養(yǎng)48 h，觀察真菌生長情況，測定菌落直徑，以無供試菌生長平板對應(yīng)的最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 芳香萬壽菊精油抑菌圈直徑（DIZ）的測定采用濾紙片法測定。通過測定抑菌圈直徑的大小來判斷芳香萬壽菊精油的抑菌效果。取100 μL菌液均勻涂布于平板培養(yǎng)基表面，制成含菌平板。取10 μL精油（對照組：取10 μL吐溫-80）于5 mm的圓形濾紙片上，濾紙朝下貼于平板，靜置10 min，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，采用十字交叉法測定抑菌圈的直徑，3個(gè)重復(fù)，取平均值。以放置無菌濾紙片的培養(yǎng)皿作為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳香萬壽菊精油成分分析

運(yùn)用GC-MS分析技術(shù)對芳香萬壽菊花、葉精油成分進(jìn)行分析（總離子流圖TIC，圖2），精油組成成分及其相對百分含量見表1。從芳香萬壽菊花精油中共鑒定出相對含量在0.1%以上的主要成分共49個(gè)，占比98.17%；從葉精油中鑒定出45種化學(xué)成分，占總量的96.45%?；ň偷闹饕煞钟笑?大西洋酮（33.85%）、α-大西洋酮（12.20%）、（Z）-羅勒烯酮（9.02%）、（E）-羅勒烯酮（6.85%）、(Z)-萬壽菊酮（3.89%）、二氫萬壽菊酮（3.29%）、β-石竹烯（3.01%）和3-蒈烯（2.58%）等；枝葉精油的主要成分有γ-大西洋酮（31.07%）、（Z）-羅勒烯酮（9.82%）、α-大西洋酮（9.57%）、（E）-羅勒烯酮（7.06%）、(Z)-萬壽菊酮（4.47%）、二氫萬壽菊酮（3.90%）、3-蒈烯（3.57%）、大根香葉烯D（3.16%）和β-石竹烯（2.93%）等。

圖2 芳香萬壽菊花、葉精油成分總離子流圖

從表1可知，2種精油成分中共有成分39種，特異性成分14種，其中花精油的特異性成分有10種，β-崖柏烯（2.24%）、氯代十八烷（1.01%）、木香醇（0.35%）、油酰氯（0.29%）和雙環(huán)[3.2.0]庚烷-2-酮，5-（乙氧羰基甲基）-6-羥基-3,3-二甲基-6-（氧?；缺?.22%）等；葉精油的特異性成分有6種，β-月桂烯（1.60%）、D-檸檬烯（0.38%）、4-甲?；?3,5-二叔丁基苯甲酸（0.37%）、玫瑰呋喃（0.24%）、t-杜松醇（0.22%）和β-水芹烯（0.21%）。2種精油的共有成分所占比例大，總相對百分含量分別為93.36%、93.43%；特異性成分相對含量所占比率很小，僅為4.81%、3.02%。

表1 芳香萬壽菊精油主要特征性化合物的比較

通過對其主成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中主要為酮類（18種，占比分別為78.03%、73.76%），其次是萜烯類（11種，占比分別為12.54%、15.59%）和醇類（占比分別為3.79%、4.73%）。

芳香萬壽菊與萬壽菊同屬萬壽菊屬，兩者精油成分差異明顯，萬壽菊精油中檸檬烯、異松油烯、β-羅勒烯和石竹烯等成分的含量較高。李健等研究萬壽菊葉精油成分，主要有異松油烯（37.025%）、2-異丙基-5-甲基-3-環(huán)己烯-1-酮（14.08%）、檸檬烯（13.08%）、β-羅勒烯（8.78%）和石竹烯（4.18%）等。回瑞華等研究萬壽菊不同器官的精油成分，發(fā)現(xiàn)葉精油的檸檬烯含量高達(dá)15.73%。

續(xù)表1芳香萬壽菊精油主要特征性化合物的比較

2.2 芳香萬壽菊抑菌效果分析

通過測定的DIZ和MIC來判斷芳香萬壽菊花、葉精油對匍枝根霉、鏈格孢、灰葡萄孢、粉紅單端孢和意大利青霉5種真菌的抑制效果，結(jié)果如表2所示，2種精油對供試菌的抑制效果差異顯著，由強(qiáng)到弱分別為灰葡萄孢菌＞匍枝根霉＞鏈格孢＞意大利青霉＞粉紅單端孢，其中對灰葡萄孢的抑制效果最好（DIZ分 別 為63.52±0.45、65.49±0.50 mm，MIC為0.4、0.4 μL·mL），其次為匍枝根霉（DIZ分別為62.25±0.18、62.43±0.13 mm，MIC為0.4、0.4 μL·mL）和鏈格孢（DIZ分別為56.77±0.41、57.15±0.37 mm，MIC為0.4、0.4 μL·mL）。

表2 芳香萬壽菊精油抑菌效果

3 結(jié)論與討論

3.1 精油組成

本研究采用水蒸氣蒸餾法結(jié)合GC-MS技術(shù)對芳香萬壽菊花、葉精油成分進(jìn)行分析，共鑒定出55種化合物，2種精油以酮類和萜烯類物質(zhì)為主，主要成分有：西洋酮、羅勒烯酮、萬壽菊酮等?；ň丸b定出49種成分，主要成分有大西洋酮（47.21%）、羅勒烯酮（15.87%）、萬壽菊酮（6.43%）、二氫萬壽菊酮（3.29%）、β-石竹烯（3.01%）和3-蒈烯（2.58%）等；葉精油鑒定出45種化合物，主要成分有大西洋酮（41.13%）、羅勒烯酮（16.88%）、萬壽菊酮（7.28%）、二氫萬壽菊酮（3.90%）、3-蒈烯（3.57%）、大根香葉烯（3.16%）和β-石竹烯（2.93%）等。2種精油的主要成分相同，含量略有差異。此外，2種精油成分中共有成分39種，特有成分14種，特異性成分總相對百分含量較低，僅為4.81%、3.02%。

3.2 主要賦香成分

芳香萬壽菊花和葉的主要賦香成分有：大西洋酮、羅勒烯酮、萬壽菊酮、3-蒈烯和大根香葉烯等。這些賦香成分和相對百分含量差異較小。大西洋酮，是一種倍半萜酮，有3種同分異構(gòu)體，具有淡淡的木質(zhì)香味，具有抗氧化、抗腫瘤作用，能夠誘發(fā)癌癥細(xì)胞（淋巴癌、白血?。┛焖俚蛲觥Ａ_勒烯酮和萬壽菊酮，有萬壽菊香氣，并有青香韻；3-蒈烯具有香甜的花果香氣，嗅感閾值低，具有殺菌、抗炎和抗焦慮等作用；β-石竹烯具有淡淡的丁香香氣；大根香葉烯，具有木香和薄荷香。

酯類化合物大部分呈現(xiàn)水果香、花香，具有果香型的感官特征，(-)-乙酸桃金娘烯酯，具有甜香、花香、柏木香；乙酸龍腦酯，又名乙酸冰片酯，有清涼的松木香氣和樟腦氣息。3個(gè)酯類化合物可能是芳香萬壽菊精油具有百香果香味的特征賦香成分。

3.3 抑菌效果

通過抑菌圈大小和最低抑菌濃度值的測定，筆者發(fā)現(xiàn)芳香萬壽菊精油對5種供試菌有不同程度的抑制作用，對灰葡萄孢的抑制效果最好（DIZ分別為63.52、65.49 mm，MIC為0.4、0.4 μL·mL），其次為匍枝根霉和鏈格孢。葉精油的抑菌效果略微好于花精油的抑菌效果，這一結(jié)果與葉精油中的3-蒈烯、檸檬烯等成分的相對含量較高有關(guān)，這些成分具有較強(qiáng)的抗氧化和抑菌作用。芳香萬壽菊精油對采后病原菌有很好的抑制作用，以期為精油在果蔬采后保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

綜上所述，本研究分離鑒定芳香萬壽菊花、葉精油共55種化合物，2種精油以酮類和萜烯類物質(zhì)為主，主要成分有大西洋酮（47.21%、41.13%）、羅勒烯酮（15.87%、16.88%）、萬壽菊酮（6.43%、7.28%）和二氫萬壽菊酮（3.29%、3.90%）等。2種精油的主要化學(xué)成分相同，含量略有差異。此外，2種精油成分中共有成分39種，特有成分14種，特異性成分總相對百分含量較低，僅為4.81%、3.02%。

芳香萬壽菊精油抑菌活性的研究結(jié)果表明：芳香萬壽菊精油對灰葡萄孢、匍枝根霉、鏈格孢具有很好的抑制效果；葉精油的抑菌效果略微好于花精油的抑菌效果。

本研究初步探討芳香萬壽菊精油成分和抑菌活性，后期將深入研究不同采收期的精油成分差異，并結(jié)合減壓分餾的方法對精油進(jìn)行分餾，提高目標(biāo)成分含量，以獲得品質(zhì)更好的精油，旨在為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。