典型工業(yè)園區(qū)廢水處理過(guò)程的細(xì)胞毒性削減特征

程婉清，賈 敏，陳 玲，吳 兵

（南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

隨著我國(guó)工業(yè)的快速發(fā)展和工業(yè)園區(qū)的集中建設(shè)，園區(qū)水污染防治受到越來(lái)越多的關(guān)注。工業(yè)園區(qū)污水中的污染物具有種類多樣、難降解、毒性強(qiáng)等特點(diǎn)〔1-2〕，且相當(dāng)一部分污染物可通過(guò)食物鏈在生物體內(nèi)富集，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)和人類健康構(gòu)成重大威脅〔3〕。目前，工業(yè)園區(qū)廢水的污染水平主要通過(guò)理化參數(shù)評(píng)估，如COD、BOD、SS、電導(dǎo)率等〔4〕，但這些參數(shù)很難反映水中濃度低、毒性大的眾多人工合成小分子污染物的濃度狀況。近年來(lái)，基于色譜-質(zhì)譜等的痕量化學(xué)分析技術(shù)在廢水水質(zhì)監(jiān)測(cè)領(lǐng)域得到了快速發(fā)展，并在持久性有機(jī)污染物、內(nèi)分泌干擾物、重金屬等毒害污染物的定量檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用〔5-6〕。但化學(xué)分析手段無(wú)法檢測(cè)所有污染物，更無(wú)法確定污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)及其長(zhǎng)期健康危害。因此，綜合評(píng)價(jià)工業(yè)廢水水質(zhì)健康危害特征及變化規(guī)律成為凈水技術(shù)革新及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管控的關(guān)鍵。

生物毒性檢測(cè)可確定污廢水中污染物的綜合毒性效應(yīng)〔7-8〕，為有效評(píng)估水處理工藝技術(shù)的毒性削減能力和處理出水的安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。急慢性毒性、遺傳毒性檢測(cè)方法等已被用于工業(yè)廢水的生物毒性評(píng)估，具有快速、高通量、樣品體積消耗少等優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法也受到越來(lái)越多的關(guān)注〔9-10〕。但現(xiàn)有的生物毒性檢測(cè)都基于濃縮水樣的直接暴露，水體中不同物化特性污染物的生物毒性特征及貢獻(xiàn)率仍不清楚?；谖廴疚镉H疏水性特征對(duì)濃縮水樣進(jìn)行分級(jí)分離并分別確定其毒性效應(yīng)，可能是解決這一科學(xué)問(wèn)題的有效方法〔11-12〕，但相關(guān)研究在工業(yè)廢水領(lǐng)域仍不多見。

本研究采用人源癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為受試生物，以細(xì)胞增殖抑制、活性氧誘導(dǎo)、線粒體膜電位變化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等為細(xì)胞毒性靶點(diǎn)，選擇典型工業(yè)園區(qū)污水處理廠為研究對(duì)象，研究了污水廠沿程的毒性效應(yīng)變化，確定了不同極性餾分的毒性效應(yīng)特征及其與工藝單元的相關(guān)性，為工業(yè)廢水處理工藝的毒性削減能力評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集及前處理

選取江蘇省2座工業(yè)園區(qū)污水處理廠（A廠和B廠）作為研究對(duì)象。2座污水處理廠的工藝流程簡(jiǎn)圖及采樣點(diǎn)見圖1（黃色箭頭表示采樣點(diǎn)）。

圖1 污水處理廠工藝流程Fig.1 The processes of wastewater treatment plants

廢水采集后使用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾去除大顆粒雜質(zhì)；為實(shí)現(xiàn)高倍濃縮，采用固相萃取法濃縮水樣〔13〕，使用OASIS HLB固相萃取柱對(duì)水樣中有機(jī)污染物進(jìn)行富集濃縮〔14〕；洗脫后氮吹洗脫液，使用二甲基亞砜（DMSO）水溶液將其復(fù)溶并轉(zhuǎn)移至1 mL色譜小瓶中，濃縮液均在-20℃保存。

1.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

本研究采用人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞和團(tuán)隊(duì)自主構(gòu)建的Hela/CHOP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株為受試細(xì)胞。Hela/CHOP細(xì)胞株是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHOP啟動(dòng)子SEAP報(bào)告基因的Hela細(xì)胞體系，可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)早期應(yīng)激響應(yīng)。2種細(xì)胞都采用含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制毒性檢測(cè)

細(xì)胞增殖抑制的測(cè)定采用CCK-8法〔15〕。將HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為1×105mL-1；培養(yǎng)24 h后，接種原水20倍濃縮樣的受試水樣；染毒24 h后棄去受試液，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8儲(chǔ)備液，在培養(yǎng)箱中孵育90 min。使用多功能酶標(biāo)儀（Synergy H1，Bio-Tek）測(cè)定450 nm處的吸光度，用相對(duì)吸光度表示細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組以去除實(shí)驗(yàn)本底值對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的誤差。

1.2.3 活性氧（ROS）誘導(dǎo)效應(yīng)檢測(cè)

采用DCFH-DA探針檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平〔16〕。選取熒光探針Hoechst 33342對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行定量，將細(xì)胞種板培養(yǎng)24 h后，接種原水20倍濃縮樣的受試水樣，染毒24 h后棄去受試液，加入現(xiàn)配的DCFHDA探針染液與Hoechst 33342探針染液。孵育20 min后棄去探針染液，用多功能酶標(biāo)儀分別測(cè)定DCF（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)346 nm）和Hoechst 33342（激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm）的熒光值，對(duì)每個(gè)孔細(xì)胞內(nèi)活性氧水平通過(guò)Hoechst 33342進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4 線粒體膜電位變化效應(yīng)檢測(cè)

采用JC-1試劑盒測(cè)定HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的變化〔17〕，指示細(xì)胞早期凋亡效應(yīng)。細(xì)胞接種原水20倍濃縮樣的受試水樣，染毒24 h后棄去受試液，加入100 μL JC-1工作液，孵育25 min。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定紅色（激發(fā)波長(zhǎng)561 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm）與綠色（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）熒光值，相對(duì)比值降低則指示膜電位下降。

1.3 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)檢測(cè)

采用項(xiàng)目組自主構(gòu)建的Hela/CHOP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期響應(yīng)基因CHOP的表達(dá)變化。Hela/CHOP細(xì)胞使用原水樣濃度進(jìn)行染毒，染毒24 h后，一組取6孔、每孔吸取50 μL暴露液混合于離心管中，10 000 r/min離心10 min，取上清液于65℃孵育30 min；孵育后加入到試劑盒配套的96孔板中，加入10 μL待測(cè)上清液與50 μL SEAP反應(yīng)底物，室溫避光孵育30 min后，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。同時(shí)選取熒光探針Hoechst 33342對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行定量，每孔加入5 μg/mL的Hoechst 33342探針染液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，棄去探針染液，用Hanks緩沖液清洗多余的探針染液后，再加入50 μL Hanks緩沖液，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)Hoechst 33342的熒光值。SEAP活性=化學(xué)發(fā)光值/Hoechst 33342熒光值。

1.4 濃縮樣分級(jí)分離及毒性檢測(cè)

使用Waters e2695高效液相色譜儀進(jìn)行有機(jī)污染物濃縮液的分餾，并用于后續(xù)的生物毒性測(cè)試〔18〕。具體條件如下：Waters BEH C18色譜柱（D4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為水和甲醇。流動(dòng)相梯度：初始，30%甲醇；5 min，30%甲醇；45 min，100%甲醇。每個(gè)餾分收集時(shí)間為5 min，每個(gè)樣品分離到12個(gè)組分。收集的餾分氮吹至近干，用于生物毒性測(cè)定的組分，用水和DMSO復(fù)溶。復(fù)溶樣品儲(chǔ)存在-20℃環(huán)境直至測(cè)試。

1.5 數(shù)據(jù)處理

毒理實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)檢測(cè)設(shè)定6個(gè)平行，毒理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以相對(duì)空白對(duì)照的比值表示。使用Graphpad Prism 8.0作圖，并對(duì)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組進(jìn)行單因素方差分析，p＜0.05被認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 HepG2細(xì)胞毒性結(jié)果

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)工業(yè)廢水樣本中多種已知和未知化合物的復(fù)合毒性，反映工業(yè)廢水樣本總體毒性效應(yīng)〔19-20〕。使用2座污水廠各工段出水濃縮液進(jìn)行HepG2細(xì)胞染毒，暴露濃度為原水樣的20倍。檢測(cè)結(jié)果見圖2。

由圖2（a）可以看出，A廠進(jìn)水暴露24 h后的細(xì)胞活力為57.48%，經(jīng)臭氧處理后細(xì)胞活力上升至74.43%，活性炭工藝處理后細(xì)胞活力恢復(fù)至接近空白對(duì)照，說(shuō)明臭氧+活性炭吸附工藝有效去除了污染物的細(xì)胞增殖毒性。B廠進(jìn)水與水解段濃縮液對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為17.12%和16.4%，經(jīng)活性炭處理后細(xì)胞活力明顯上升。2座污水廠出水均未檢測(cè)出細(xì)胞增殖毒性。

細(xì)胞內(nèi)ROS水平與氧化應(yīng)激狀態(tài)密切相關(guān)。圖2（b）中，在水樣濃縮20倍情況下，A廠進(jìn)水導(dǎo)致了HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升；A2/O出水沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高，但臭氧處理出水導(dǎo)致ROS水平明顯升高。B廠進(jìn)水與水解段出水也導(dǎo)致了HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升。A廠和B廠經(jīng)活性炭處理后出水ROS水平降低，說(shuō)明活性炭吸附工藝顯著減弱了水樣對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化損傷效應(yīng)。

細(xì)胞線粒體去極化是細(xì)胞凋亡的早期指示。圖2（c）中，在水樣濃縮20倍的情況下，A廠進(jìn)水及生物處理出水顯著降低了聚合物與JC1單體的比值水平，線粒體膜電位下降；臭氧氧化后此效應(yīng)消失。B廠進(jìn)水與活性炭段水樣誘導(dǎo)了線粒體膜電位下降的現(xiàn)象。但2座污水廠的出水段都未出現(xiàn)顯著性的線粒體膜電位變化。

圖2 目標(biāo)水處理廠各工段出水的HepG2細(xì)胞毒性Fig.2 HepG2 cytotoxicity induced by the effluents of each section of target wastewater treatment plant

基于HepG2的3種細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，污水處理沿程水質(zhì)毒性總體呈下降趨勢(shì)，其中A廠臭氧段水樣暴露下細(xì)胞活力顯著下降、ROS水平顯著上升；B廠活性炭吸附段水樣暴露下線粒體膜電位顯著下降，這可能與高級(jí)氧化工藝段形成的有毒代謝產(chǎn)物有關(guān)。Qianyuan WU等〔21〕使用HepG2細(xì)胞評(píng)估了廢水臭氧氧化后的遺傳毒性，同樣發(fā)現(xiàn)臭氧氧化會(huì)使廢水毒性增加。袁霞等〔22〕使用發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)高級(jí)氧化工藝處理后水樣毒性，發(fā)現(xiàn)處理后水樣毒性高于處理前，具有潛在水質(zhì)安全風(fēng)險(xiǎn)。以上研究結(jié)果與本研究均揭示應(yīng)關(guān)注高級(jí)氧化工藝產(chǎn)生的副產(chǎn)物對(duì)水質(zhì)安全性的影響。

2.2 Hela/CHOP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞毒性結(jié)果

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞機(jī)體受到刺激的先期反應(yīng)之一。本研究采用項(xiàng)目組自主構(gòu)建的Hela/CHOP細(xì)胞，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期響應(yīng)基因CHOP的表達(dá)變化確定毒性效應(yīng)，該方法具有靈敏度高的特點(diǎn)。本研究中，在原水樣濃度下，2座污水廠所有采樣點(diǎn)水體的暴露均引起了SEAP活性的顯著性提高（圖3），表明細(xì)胞早期損傷的存在，最終出水仍存在一定的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)，且不同工段出水的毒性變化規(guī)律不明顯。此外，與細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)ROS水平及線粒體膜電位等檢測(cè)結(jié)果（濃縮20倍）相比，Hela/CHOP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的敏感性更高，且在不對(duì)水樣進(jìn)行濃縮的前提下即可進(jìn)行毒性檢測(cè)分析。

圖3 基于Hela/CHOP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of endoplasmic reticulum stress in Hela/CHOP transgenic cell lines

2.3 基于樣品分級(jí)分離的細(xì)胞毒性結(jié)果

通過(guò)對(duì)原水樣濃縮液的細(xì)胞毒性檢測(cè)，初步評(píng)估了2座典型污水處理廠不同工段出水的毒性效應(yīng)及變化規(guī)律，但仍無(wú)法獲悉廢水中引起毒性效應(yīng)的物質(zhì)特征。對(duì)濃縮樣本按照親疏水性將污染物進(jìn)行分級(jí)分離，降低樣品中物質(zhì)的復(fù)雜程度。本研究通過(guò)液相色譜儀將原水樣濃縮液按照親疏水性分為12份（每5 min 1個(gè)餾分，先流出的餾分為高極性餾分，再依次流出中極性與低極性餾分），并分別進(jìn)行 了細(xì)胞毒性檢測(cè)，結(jié)果見圖4。

圖4 A廠和B廠水樣分級(jí)分離餾分的細(xì)胞毒性結(jié)果Fig.4 Cytotoxicity results of water sample fractions from plant A and plant B

由圖4可 知，A廠 進(jìn)水0～5 min和10～15 min收集的餾分毒性效應(yīng)較強(qiáng)；而A2/O及臭氧處理后高毒性餾分出現(xiàn)在30～45 min，經(jīng)臭氧處理后，非極性高毒性餾分的毒性顯著降低；活性炭吸附后，各餾分在各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果中均表現(xiàn)出較小的毒性效應(yīng)，代表A廠現(xiàn)有處理工藝能較好地去除廢水中的致毒物質(zhì)。基于以上結(jié)果可知，A廠進(jìn)水致毒物質(zhì)主要是高極性物質(zhì)，且生化處理耦合深度處理能顯著去除毒性組分，但在生化尾水中非極性餾分毒性開始增加，這一現(xiàn)象可能涉及到污染物在不同復(fù)合比例下的聯(lián)合毒性變化，后續(xù)需要利用毒性效應(yīng)介導(dǎo)的非靶向篩查技術(shù)對(duì)關(guān)鍵致毒物質(zhì)進(jìn)行深入解析，以便更有針對(duì)性地確定致毒組分。

與A廠相比，B廠的進(jìn)水及沿程各工段的水質(zhì)生物毒性變化更為復(fù)雜。進(jìn)水的12個(gè)餾分的毒性均較大，表明其中的致毒物質(zhì)成分種類多樣。水解工段毒性效應(yīng)顯著的餾分集中在10～30 min餾出，非極性餾分段（30～60 min）的毒性不明顯。經(jīng)過(guò)活性炭吸附后，前30 min收集的餾分毒性效應(yīng)有所減弱，后30 min收集的餾分毒性效應(yīng)有所加強(qiáng)。出水前30 min收集的餾分毒性效應(yīng)顯著削減，但后30 min收集的餾分毒性效應(yīng)仍沒(méi)有得到完全削減。

結(jié)合A廠數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，臭氧氧化可能是生化尾水毒性削減的潛在有效技術(shù)。A廠與B廠污水處理沿程致毒組分有從高極性轉(zhuǎn)向低極性的趨勢(shì)，這一研究結(jié)果與陳玲等〔23〕的類似，在常晉〔24〕的研究中也發(fā)現(xiàn)了污水處理廠出水中極性有機(jī)物相較進(jìn)水中有所減少的現(xiàn)象，揭示了污水廠沿程工藝對(duì)極性有機(jī)物的去除。此外，分餾樣本的毒性檢測(cè)結(jié)果與原濃縮樣本（圖2）具有一定的差異性，可能是不同混合比例下聯(lián)合毒性效應(yīng)變化的原因，相關(guān)的致毒物質(zhì)類型及機(jī)理仍需后續(xù)深入分析。

3 結(jié)論

本研究采用污染物分級(jí)分離與多維度細(xì)胞毒性檢測(cè)相結(jié)合的方法評(píng)價(jià)了典型工業(yè)園區(qū)污水處理廠各工段的生物毒性削減規(guī)律。2家污水處理廠都顯著降低了HepG2細(xì)胞毒性效應(yīng)，但通過(guò)高敏的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株仍能檢出潛在的毒性危害。分級(jí)分離分析發(fā)現(xiàn)臭氧與活性炭工藝顯著降低了疏水性污染物的毒性，分級(jí)分離過(guò)程可能還會(huì)改變污染物的聯(lián)合作用模式，值得更深入的研究。本研究為工業(yè)園區(qū)廢水生物毒性效應(yīng)及處理效率的評(píng)估提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為凈水技術(shù)創(chuàng)新及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)防控提供了科學(xué)依據(jù)。