cbpD基因?qū)θ茉寤【玖跋嚓P(guān)生物學(xué)特性的影響

蘇雯曉 ，鄧益琴，臧樹軍 ，王 茜, ，林梓陽, ，馮 娟

1. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300392

4. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 海口 570228

溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 是一種廣泛分布于海洋的嗜鹽革蘭氏陰性菌[1]。近年來，溶藻弧菌已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要的致病菌[2]，其引起的弧菌病可導(dǎo)致養(yǎng)殖動物表皮出血、腎臟發(fā)白、內(nèi)臟充血，特別是在夏季較高的溫度下致病率會顯著提高[3]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。2016年9月，馬來西亞雜交石斑魚 (Epinephelus polyphekadion × E. fuscoguttatus) 幼魚感染溶藻弧菌，疾病爆發(fā)致大量死亡，且分離出來的溶藻弧菌感染鱸魚死亡率達(dá)100%[4]。2019年8月，中國山東某養(yǎng)殖場的太平洋牡蠣 (Crassostrea gigas) 感染了溶藻弧菌，死亡率超過60%[5]。2020年3月，埃及赫爾格達(dá)養(yǎng)殖的幼年海參 (Holothuria atra) 感染溶藻弧菌后，皮膚發(fā)生潰瘍并于3 d內(nèi)死亡[6]。另外，溶藻弧菌還可以引起人類敗血癥、食物中毒等疾病[3]。因此，溶藻弧菌不僅能導(dǎo)致大規(guī)模的養(yǎng)殖動物死亡，造成負(fù)面經(jīng)濟影響，也是潛在的人與水產(chǎn)動物共患病源，可能對人類健康構(gòu)成風(fēng)險。

目前，在溶藻弧菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與蛋白相關(guān)毒力因子，如分泌系統(tǒng)、蛋白酶、生物膜、溶血性等。效應(yīng)蛋白Val1686可以引起魚類細(xì)胞凋亡[7]；溶藻弧菌的ncRNAVvrr1和丙酮酸激酶Ⅰ基因pykF相互作用，分別過表達(dá)Vvrr1和敲除pykF基因可以顯著降低溶藻弧菌的黏附能力、生物膜形成和毒力[3]；敲除Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SS的調(diào)控蛋白操縱子基因exsD可導(dǎo)致溶藻弧菌對斑馬魚 (Danio rerio) 的毒力顯著上升[8]；外膜蛋白A基因ompA缺失后涌動性和生物膜形成出現(xiàn)缺陷，溶藻弧菌毒力降低[9]；輔助定植因子acfA通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來負(fù)調(diào)控生物膜的形成，從而影響溶藻弧菌毒力[10]；rpoS可調(diào)節(jié)細(xì)菌黏附能力，是溶藻弧菌毒力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。因此，溶藻弧菌可能通過相關(guān)毒力因子或者毒力調(diào)控因子影響細(xì)菌對宿主的侵襲、黏附、定植以及毒力釋放等過程，從而影響細(xì)菌對宿主的毒力作用。

幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 (Chitin-binding protein D,CbpD) 被視為一種幾丁質(zhì)氧化毒力因子[12]，它能夠結(jié)合在幾丁質(zhì)上。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白結(jié)合幾丁質(zhì)后，能改變幾丁質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)，利于幾丁質(zhì)酶對其進行后續(xù)水解[13]。在銅綠假單胞菌(Pseudomona aeruginosa) 中，cbpD缺失導(dǎo)致宿主體內(nèi)細(xì)菌的清除率提高，細(xì)菌和宿主蛋白質(zhì)大量重組，使銅綠假單胞菌無法建立致命的全身感染，致病性降低[14]。目前，關(guān)于溶藻弧菌cbpD的研究甚少，前期基因組測序鑒定得到溶藻弧菌毒株ZJ-T中cbpD基因，通過同源重組的方法構(gòu)建溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失突變株，并通過比較其與溶藻弧菌野生株ZJ-T的生長情況、運動性、藥物敏感性等生物學(xué)特性以及毒力的差異，為進一步了解cbpD在溶藻弧菌中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

溶藻弧菌ZJ-T、自殺質(zhì)粒pSW7848、自殺質(zhì)粒中間宿主大腸桿菌 (Escherichia coli) Ⅱ3813及接合作用供體宿主E. coliGEB883保存于本實驗室；本研究所用菌株及質(zhì)粒見表1，所用引物見表2。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要試劑

用于E. coliⅡ3813生長的2'-脫氧胸苷 (2'-Deoxythymidine, Thy) 購于生工生物工程 (上海) 股份有限公司。用于營養(yǎng)缺陷型E. coliGEB883生長的2,6-二氨基庚二酸 (2,6-Diaminopimelic acid,DAP) 購自西格瑪奧德里奇 (上海) 貿(mào)易有限公司。高保真酶PrimeSTAR? Max DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶DpnⅠ購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；等溫組裝試劑盒 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒MagPure DNA Clean Up Kit B購自廣州美基生物科技有限公司；用于藥敏試驗的抗生素紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；用于胞外蛋白酶測試的脫脂奶粉NON-Fat PowderedMilk、生物膜實驗的結(jié)晶紫Crystal violet、PBS緩沖液以及用于鐵離子吸收測試的鐵離子螯合劑2-2'-聯(lián)吡啶 (2,2'-Dipyridyl, DIP) 購自生工生物工程(上海) 股份有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB (Luria-bertani)、LBS (LB with 3% 氯化鈉)、TCBS培養(yǎng)基 (Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar) 以及血平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。LB培養(yǎng)基 (g·L-1) 含胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化鈉10 g。固體LB培養(yǎng)基含瓊脂15 g。LBS培養(yǎng)基 (g·L-1) 中含氯化鈉 30 g。

1.2 實驗方法

1.2.1cbpD缺失株的構(gòu)建

參照Deng等[19]方法，構(gòu)建cbpD缺失株。用引物pSW7848-F/pSW7848-R對質(zhì)粒pSW7848線性化，用引物dcbpD-U-F/dcbpD-U-R和引物dcbpDD-F/dcbpD-D-R對cbpD編碼序列上下游片段進行擴增。等溫組裝線性化質(zhì)粒和cbpD上下游同源臂片段，連接后將其轉(zhuǎn)化至中間宿主大腸桿菌E.coliⅡ3813，用引物Del-check-pSW7848-F/R檢測連接cbpD上下游同源臂的完整性，隨后轉(zhuǎn)化至接合作用供體宿主大腸桿菌E. coliGEB883，用檢測引物Del-check-pSW7848-F/R對其擴增后進行電泳檢測并測序鑒定，得到連接cbpD上下游片段后的重組自殺質(zhì)粒pSW7848-cbpDup-cbpDdown。自殺質(zhì)粒pSW7848不能在溶藻弧菌中復(fù)制，且?guī)в新让顾乜剐?，阿拉伯糖會誘導(dǎo)pSW7848中的毒性基因ccdB表達(dá)[18]。接合實驗通過帶有葡萄糖和阿拉伯糖兩種不同抗性的TCBS平板先后進行兩次篩選，使重組自殺質(zhì)粒上cbpD的上下游同源臂片段與溶藻弧菌ZJ-T基因組的cbpD上下游同源臂先后發(fā)生兩次同源重組，重組后的單菌落用檢測引物DelcbpD-check-F/R進行PCR擴增和測序后，獲得溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失株，命名為ZJ-T-ΔcbpD。

1.2.2 不同培養(yǎng)條件下的生長情況測定

將溶藻弧菌ZJ-T和缺失突變株ZJ-T-ΔcbpD的單克隆分別接種至LBS液體培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)過夜后，將過夜菌液用新鮮LBS培養(yǎng)液稀釋至OD600= 0.001，吸取100 μL至96孔板，利用Tecanspark微孔板檢測儀30 ℃、180 r·min-1連續(xù)振蕩恒溫培養(yǎng)，每隔30 min測定OD600。每個樣品3個平行，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.3 運動性檢測

同1.2.2過夜菌液，用LBS液體培養(yǎng)基調(diào)整OD600=1.0，取稀釋后菌液5 μL平行3次點樣到0.3%和1.5%的瓊脂LBS平板，30 ℃靜置培養(yǎng)16和24 h，測量菌斑直徑，比較菌株的游動和涌動能力，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.4 藥敏實驗

用紙片擴散法測定溶藻弧菌ZJ-T和突變株ZJT-ΔcbpD對23種抗生素的敏感性。同1.2.2過夜菌液，取200 μL至10 mL新鮮LBS液體培養(yǎng)基混勻后倒入LBS平板，平板浸濕10 min后將剩余菌液倒掉。將各抗生素紙片按壓于平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑，通過比對藥敏說明書判定敏感性結(jié)果 ，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.5 胞外蛋白酶檢測

本實驗采用脫脂牛奶平板法[20]測定溶藻弧菌ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD胞外蛋白酶活性，將同1.2.2過夜菌液調(diào)整培養(yǎng)液濃度至OD600=5.0，取5 μL平行3次點樣到含1%脫脂奶粉的LBS平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，測量蛋白質(zhì)透明分解圈直徑和菌落直徑，兩者的比值為蛋白酶的分泌能力[20]，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.6 溶血性測定

用綿羊血平板測定溶藻弧菌的溶血活性，蘸取同1.2.2過夜菌液于血平板劃線，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察平板溶血情況，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.7 對過氧化氫 (H2O2)、銅離子 (Cu2+) 抗性及對鐵離子 (Fe3+) 的吸收測試

參考鄧益琴等[21]的方法，同1.2.2過夜菌液，將培養(yǎng)液濃度調(diào)至相同吸光度OD600=5.0，并作10倍倍比稀釋，取各倍比稀釋濃度菌液各5 μL平行3次點樣到LBS平板作為對照，點樣至終濃度為 0.003% H2O2、4.5 mmol·L-1CuSO4或 150 μmol·L-1DIP的LBS平板上，用于測試突變后對H2O2和Cu2+的抗性及對Fe3+的吸收能力。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.8 生物膜測試

同1.2.2過夜菌液，用LBS培養(yǎng)液將菌液濃度稀釋至OD600=1.0，吸取1 mL至無菌24孔培養(yǎng)板，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h；將菌液吸出后吹干培養(yǎng)板，并加入PBS緩沖液洗滌1次；倒置晾干后，用10%甲醇固定20 min，固定結(jié)束后吸出甲醇并吹干；加入0.1%結(jié)晶紫染液室溫靜置染色20 min，吸取染液，用PBS緩沖液洗去多余染液；用95%乙醇染色，室溫反應(yīng)30 min后使用酶標(biāo)儀測定OD570。實驗至少重復(fù)3次。

1.2.9 斑馬魚毒力實驗

本實驗以斑馬魚為動物模型，測定溶藻弧菌ZJ-T缺失cbpD對細(xì)菌毒力的影響。在廣州好易生水族店購入體質(zhì)量約0.3 g的斑馬魚，26～28 ℃暫養(yǎng)1周。挑取ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD單克隆分別接種至LBS斜面培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)過夜，用3 mL 0.85%生理鹽水洗脫菌落并測菌體濃度，將菌液稀釋至OD600=0.3。實驗設(shè)3個平行，對照組注射40 μL 0.85%生理鹽水，實驗組ZJ-T和ZJ-TΔcbpD斑馬魚腹腔注射40 μL OD600=0.3的菌液(2.32×108～2.71×108CFU)，每組 3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 cbpD缺失株的構(gòu)建與驗證

以引物pSW7848-F/pSW7848-R擴增得線性化pSW7848質(zhì)粒約3 300 bp (圖1-a)。以ZJ-T基因組為模板，引物dcbpD-U-F/dcbpD-U-R和dcbpD-DF/dcbpD-D-R擴增得cbpD上游片段約870 bp，cbpD下游片段約1 000 bp (圖1-b)。等溫組裝連接自殺質(zhì)粒和cbpD上下游片段，重組自殺質(zhì)粒pSW 7848-cbpDup-cbpDdown長度約2 170 bp (圖1-c)，與設(shè)計的片段大小相符。經(jīng)過接合實驗兩次同源重組后，用檢測引物Del-cbpD-check-F/Del-cbpD-check-R驗證，野生型ZJ-T擴增片段約1 670 bp，突變株P(guān)CR擴增得片段約540 bp (圖1-d)，符合預(yù)期片段大小，cbpD缺失株ZJ-T-ΔcbpD構(gòu)建成功。

圖1 缺失株ZJ-T-ΔcbpD的構(gòu)建注：a. 質(zhì)粒 pSW7848 線性化條帶；b. cbpD 上下游片段，泳道 2 為 cbpD 上游同源臂，泳道 3 為 cbpD 下游同源臂；c. 重組自殺質(zhì)粒PCR 鑒定擴增片段；d. cbpD 缺失株的鑒定，泳道 5 為野生株擴增結(jié)果，泳道 6 為潛在突變株擴增結(jié)果。Fig. 1 Construction of deletion strain ZJ-T-ΔcbpDNote: a. Plasmid pSW7848 linearization band; b. cbpD upstream and downstream fragments, and Lane 2 is the upstream, while Lane 3 is the downstream; c. PCR to identify segment of recombinant suicide plasmid; d. Identification of cbpD deletion strain, Lane 5 is the amplification result of the wild strain, and Lane 6 is the amplification result of the potential mutant strain.

2.2 cbpD缺失對溶藻弧菌ZJ-T生長的影響

溶藻弧菌ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD在富營養(yǎng)的LBS培養(yǎng)基中生長，在24 h培養(yǎng)時間里，潛伏期為培養(yǎng)初期1 h，在1 h后進入對數(shù)期，經(jīng)過7 h后進入生長穩(wěn)定期，ZJ-T的穩(wěn)定期生長量略高于突變株ZJ-T-ΔcbpD，但野生株和突變株總體生長期無顯著差異 (圖2)。

圖2 LBS培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 2 Growth curves in LBS culture

2.3 運動性檢測

將野生株ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD接種在0.3%瓊脂LBS平板，觀察游動性變化。菌株在30 ℃培養(yǎng)16 h后，野生株ZJ-T顯示出較明顯的游動能力，以點樣處為中心向四周游動 (圖3)，突變株ZJ-T-ΔcbpD游動能力顯著降低 (P＜0.05，圖4)。在1.5%瓊脂LBS平板觀察涌動能力變化，30 ℃培養(yǎng)24 h后，ZJ-T呈現(xiàn)在點樣處朝四周涌動現(xiàn)象，而突變株ZJ-T-ΔcbpD未出現(xiàn)擴散現(xiàn)象，只在點樣處生長，菌斑表面光滑，由不透明轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该?(圖3)，涌動能力顯著下降 (P＜0.01，圖4)。

圖3 溶藻弧菌ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD的運動性Fig. 3 Mobility of V. alginolyticus ZJ-T and mutant strain ZJ-T-ΔcbpD

圖4 運動性統(tǒng)計分析注：*. P＜0.05；**. P＜0.01；圖 5-a、8-b同此。Fig. 4 Motility statistical analysisNote: *. P＜0.05; **. P＜0.01; The same case in Fig. 5-a and 8-b.

2.4 cbpD缺失對耐藥性的影響

本實驗中利用紙片擴散法測定溶藻弧菌ZJT和突變株ZJ-T-ΔcbpD對克拉霉素、利福平、阿莫西林等23種抗生素的藥物敏感性，實驗結(jié)果見表3。溶藻弧菌ZJ-T缺失cbpD后，突變株ZJ-TΔcbpD對克拉霉素的敏感性由高度敏感變?yōu)橹卸让舾?。野生株ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD對利福平、阿莫西林、磺胺異噁唑、麥迪霉素等13種抗生素具有抗性，對多西環(huán)素、氟苯尼考、妥布霉素、環(huán)丙沙星等10種抗生素有不同程度的敏感，但溶藻弧菌野生株ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD對以上抗生素的敏感性沒有差異。

表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 Drug sensitivity tests results of ZJ-T and ZJ-T-ΔcbpD

2.5 胞外蛋白酶活性變化

cbpD缺失后，蛋白質(zhì)透明分解圈直徑與菌落直徑的比值顯著上升 (P＜0.01，圖5)，溶藻弧菌ZJ-T缺失cbpD后蛋白酶的分泌能力增強。

圖5 蛋白酶分泌能力注： a. 蛋白質(zhì)透明分解圈直徑與菌落直徑的比值；b. 脫脂牛奶平板圖。Fig. 5 Secretion of extracellular protease capacityNote: a. The ratio of protein transparent decomposition circle diameter to colony diameter; b. Picture of skim milk plate.

2.6 溶血活性

溶藻弧菌ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD在血平板上均未出現(xiàn)溶血圈 (圖6)。溶藻弧菌ZJ-T本身無溶血活性，且cbpD缺失后溶藻弧菌ZJ-T的溶血性沒有發(fā)生改變。

圖6 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD的溶血性Fig. 6 Hemolytic activity of V. alginolyticus ZJ-T and ZJ-T-ΔcbpD

2.7 cbpD缺失對H2O2、Cu2+抗性及對Fe3+吸收的影響

ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD點樣在LBS平板和分別含有H2O2、CuSO4、DIP的LBS平板上，隨著稀釋倍數(shù)的增加，菌落數(shù)減少。在0.003% H2O2-LBS平板，稀釋倍數(shù)達(dá)10-2以后野生株和突變株均不再生長；在4.5 mmol· L-1CuSO4-LBS平板，稀釋倍數(shù)達(dá)10-1時，ZJ-T菌落開始逐漸不再生長，而突變株ZJ-T-ΔcbpD菌落數(shù)比野生株要多，在稀釋倍數(shù)達(dá)10-4時仍有存活，缺失cbpD后對Cu2+的抗性增加；兩者在150 μmol·L-1DIP的LBS平板生長無顯著差異，突變不影響ZJ-T對Fe3+的獲取能力 (圖7)。

圖7 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD對過氧化氫、硫酸銅以及鐵離子螯合劑2-2'-聯(lián)吡啶的敏感性注：a. LBS 瓊脂平板；b. 0.003% H2O2-LBS 平板；c. 4.5 mmol·L-1 CuSO4-LBS 平板；d. 150 μmol·L-1 DIP-LBS 平板。Fig. 7 Sensitivity to H2O2, CuSO4 and DIP of wild type and cbpD mutant on LBS plateNote: a. LBS agar plate; b. 0.003% H2O2-LBS agar plate; c. 4.5 mmol·L-1 CuSO4-LBS agar plate; d. 150 μmol·L-1 DIP-LBS agar plate.

2.8 生物膜形成

ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD結(jié)晶紫染色后，可見培養(yǎng)孔底部有菌體沉淀，突變株ZJ-T-ΔcbpD生物膜的平均形成量相對野生株無顯著變化 (圖8，P＞0.05)。

圖8 生物膜形成量Fig. 8 Biofilm formation

2.9 cbpD缺失對斑馬魚毒力的影響

對斑馬魚進行稱質(zhì)量，體質(zhì)量約為0.34 g。斑馬魚腹腔注射溶藻弧菌ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD菌液后，注射野生型菌株ZJ-T第24、第48 、第72、第96小時斑馬魚的成活率分別為68.89%、62.22%、60.00%、60.00%；而cbpD突變后，成活率提高至97.78%、97.78%、95.56%、91.11%，成活率較野生型顯著提高 (P＜0.01，圖9)。

圖9 溶藻弧菌ZJ-T和突變株ZJ-T-ΔcbpD感染斑馬魚后成活率Fig. 9 Survival rate of V. alginolyticus ZJ-T and mutant strain ZJ-T-ΔcbpD after infection of D. rerio

3 討論

幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白編碼基因cbpD編碼表達(dá)裂解多糖單氧酶 (Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)。LPMOs能利用分子氧分解糖苷鍵，具有銅依賴性，可將聚合碳水化合物轉(zhuǎn)化為可利用碳源，參與微生物病原和病毒的感染循環(huán)[22]。LPMOs分為結(jié)構(gòu)域為輔助活動族9 (Auxiliary activity 9,AA9) 的真菌纖維素活性酶和輔助活動族10 (Auxiliary activity 10, AA10) 的細(xì)菌幾丁質(zhì)活性酶。具有幾丁質(zhì)酶活性的AA10酶與細(xì)菌發(fā)病機制有關(guān)，AA10結(jié)構(gòu)域的LPMOs——GbpA和lmo2467分別為霍亂弧菌 (V. cholerae) 和李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 的毒力因子[22]。霍亂弧菌中的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白GbpA參與霍亂弧菌的定殖，GbpA與黏蛋白相互作用，協(xié)調(diào)霍亂弧菌的黏附能力，gbpA突變體在小鼠體內(nèi)的腸道粘附能力顯著下降[23]。李斯特菌編碼幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的lmo2467缺失后在小鼠的肝臟和脾臟中的感染量均顯著降低，在脾臟中的感染量只有野生型的1/6[24]。此外，LPMOs也與銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens)的毒力有關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌ZJ-T敲除cbpD后，突變株ZJ-T-ΔcbpD對斑馬魚的毒力顯著下降，且細(xì)菌游動性、涌動性以及胞外蛋白酶活性顯著降低，而突變株相對于野生株的生物膜形成能力、對Fe3+的吸收利用和H2O2的耐受力無顯著差異，但cbpD缺失后對Cu2+的敏感性降低。藥敏試驗表明，溶藻弧菌ZJ-T缺失cbpD后，對克拉霉素的敏感性由高度敏感變?yōu)橹卸让舾?，所測試的其余抗生素敏感性在cbpD突變后無顯著差異，溶藻弧菌對大多數(shù)所測抗生素耐藥，cbpD的缺失不影響溶藻弧菌對所試驗的其余22種抗生素的藥物敏感性。野生株和突變株在綿羊血平板上均不出現(xiàn)溶血圈。

運動性是許多病原體入侵和定殖的重要原因之一，也是細(xì)菌聚集并形成生物膜的先決條件[26]。本研究中溶藻弧菌ZJ-T的cbpD突變后運動性顯著降低，cbpD可能與鞭毛的形成有關(guān)，且cbpD缺失后細(xì)菌運動能力降低可能導(dǎo)致對斑馬魚的毒力下降。大量研究表明，鞭毛蛋白對于鞭毛運動是必不可少的，它對弧菌的定殖能力有極大影響，并與某些細(xì)菌的毒力密切相關(guān)[27]。溶藻弧菌胞外蛋白酶基因pep缺失后，雖仍有極性鞭毛，但在固體瓊脂平板生長時無法產(chǎn)生側(cè)鞭毛，導(dǎo)致運動性顯著降低[28]。Zhou等[29]研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌T3SS伴侶護衛(wèi)vscO與溶藻弧菌的鞭毛有關(guān)，vscO基因缺失使細(xì)菌涌動能力下降從而毒力降低。胞外產(chǎn)物包括胞外蛋白酶、溶血素和鐵載體，其中胞外蛋白酶是感染過程中的致病因子[30]。本研究cbpD缺失后，胞外蛋白酶活性降低，cbpD可能對溶藻弧菌的定殖和黏附能力有調(diào)控作用。如通過調(diào)控溶藻弧菌運動性和胞外蛋白酶活性，從而影響細(xì)菌的黏附和定殖能力，進而影響細(xì)菌毒力。溶藻弧菌EPGS的組氨酸激酶基因baeS缺失后，BaeS分泌的毒力因子堿性絲氨酸蛋白酶Asp活性顯著降低[31]。此外，霍亂弧菌中的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白GbpA與霍亂弧菌的定殖能力有關(guān)，gbpA缺失后對感染小鼠腸道的黏附能力下降[23]。

致病菌的應(yīng)激反應(yīng)能增強防御不利環(huán)境的能力，氧化應(yīng)激系統(tǒng)能清除影響生長繁殖和定殖宿主的活性氧等有害分子[32]。銅的兩種氧化狀態(tài)能參與基本的氧化還原反應(yīng)，過量Cu2+還能促進大量活性氧的形成，對細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，對細(xì)胞產(chǎn)生損傷[33]。銅對細(xì)菌的毒性主要表現(xiàn)在病原入侵宿主時宿主的防御機制上，銅排出能避免致病菌銅中毒[34]。細(xì)菌的Cu2+抗性對于定殖和毒力必不可少[35]。Kong等[36]用50 mg·L-1五水硫酸銅處理溶藻弧菌后，溶藻弧菌黏附能力顯著降低，進一步轉(zhuǎn)錄分析測序發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌攜帶的銅耐受基因表達(dá)水平在經(jīng)Cu2+處理后表達(dá)量增加。CusS-cusR雙組分系統(tǒng)能傳感和響應(yīng)重金屬離子，當(dāng)環(huán)境中Cu2+濃度增加時，雙組分系統(tǒng)會誘導(dǎo)銅耐受基因cusCFBA的表達(dá)，以維持細(xì)胞中Cu2+的穩(wěn)態(tài)[37]。本研究中突變株受Cu2+刺激時細(xì)菌損傷降低，說明突變株對Cu2+的敏感性下降，Cu2+對細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的毒性降低。cbpD突變可能增強了清除損傷細(xì)菌的活性氧等有害分子的能力，影響了銅耐受基因的表達(dá)，cbpD也可能與ZJ-T對活性氧等有害分子的調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，cbpD可能與大部分LPMOs類似，具有銅依賴性。

目前對于弧菌病的防治仍以抗生素為主，長期使用會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[38]。溶藻弧菌T3SS基因tyeA突變后對四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、多西環(huán)素從敏感轉(zhuǎn)為耐藥[27]。本研究中cbpD缺失對溶藻弧菌耐藥性無顯著影響。溶血活性被認(rèn)為是許多致病性弧菌的毒力因子，包括霍亂弧菌、副溶血弧菌 (V. parahaemolyticus)、溶藻弧菌、哈維氏弧菌(V. harvey)和創(chuàng)傷弧菌 (V. vulnificus)[39]。哈維氏弧菌rseB基因RpoE操縱子斷裂后，在血平板上的溶血活性降低，在凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)中的定殖能力和毒力均減弱[39]。而本研究發(fā)現(xiàn)，cbpD缺失前后溶藻弧菌在綿羊血平板上均不產(chǎn)生溶血圈，說明溶藻弧菌ZJ-T無溶血性，其毒力與ZJ-T溶血活性無關(guān)。生物膜是微生物群落的普遍特征，是微生物適應(yīng)環(huán)境、抵御不良環(huán)境因素的手段[40]。本研究中cbpD缺失后生物膜形成能力無顯著變化，說明cbpD可能不參與溶藻弧菌生物膜形成相關(guān)基因的調(diào)控。今后筆者將對野生株和cbpD突變株的基因表達(dá)進行分析，通過比較cbpD突變前后基因表達(dá)的差異并結(jié)合本研究中發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)特性差異，找出cbpD可能調(diào)控的靶標(biāo)基因，并深入研究cbpD和靶標(biāo)基因的相互作用機制，從而闡明cbpD對溶藻弧菌毒力的調(diào)控機制。

4 結(jié)論

本文通過基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建溶藻弧菌ZJTcbpD基因突變株ZJ-T-ΔcbpD，斑馬魚腹腔注射敲除株發(fā)現(xiàn)：cbpD缺失后斑馬魚的相對成活率提高，cbpD敲除株可作為開發(fā)抗溶藻弧菌減毒活疫苗潛在菌株；cbpD缺失后細(xì)菌的運動性和胞外蛋白酶活性均顯著降低，cbpD可能通過影響細(xì)菌鞭毛形成、胞外蛋白酶分泌以及對宿主的黏附和定殖等，從而影響細(xì)菌對宿主的毒力；cbpD缺失后對Cu2+的耐受力增強，cbpD可能影響溶藻弧菌清除活性氧或其他有害因子的能力。