馬氏珠母貝閉殼肌活性肽制備及其輔助降血糖功效評價

廖 津 ，林海生 ，伍 彬 ，秦小明 ，曹文紅 ，高加龍 ，鄭惠娜 ，章超樺 ，譚綺晴

1. 廣東海洋大學 食品科技學院/國家貝類加工技術研發(fā)分中心 (湛江)/廣東省水產品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋生物制品工程實驗室/水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088

2. 暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州 510632

3. 大連工業(yè)大學海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034

目前，糖尿病 (Diabetes mellitus, DM) 患病人數(shù)呈逐年增加趨勢，已成為人類健康的重大威脅之一[1]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟 (The International Diabetes Federation, IDF) 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2019年全球糖尿病患者已超4.63億，預測至2045年仍將繼續(xù)增長51%[2]。目前臨床醫(yī)學上，糖尿病患者的治療通常采用服入α-葡萄糖苷酶抑制劑類型的藥物，其能有效減慢人體對食品中葡萄糖的吸收利用，達到餐后降血糖的效果[3]。然而，傳統(tǒng)藥物治療往往有較大的副作用[4]。因此尋找副作用小且經濟的降血糖物質是未來研究的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，水產動物來源的蛋白酶解物具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性[5-6]，同時也被認為是一種潛在的輔助降血糖功能食品的原料來源[7-8]。然而，以貝類為原材料酶法制備具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽類的研究卻鮮有報道。

海洋貝類是重要的漁業(yè)資源，其富含蛋白質、氨基酸、微量元素、?；撬岬葼I養(yǎng)功能成分，是制備生物活性肽的優(yōu)質原料[9-10]?，F(xiàn)代酶解技術是蛋白高值化利用制備活性肽的主要方法之一。目前已報道貝類酶解物的生理功效包括抗氧化[11-12]、降血糖[13]、降血壓[14-15]、促傷口愈合[16]和保護肝臟[17]等。馬氏珠母貝 (Pinctada martensii)、華貴櫛孔扇貝 (Chlamys nobilis) 和櫛江珧 (Atrina pectinate) 是我國主要的養(yǎng)殖貝類，主要集中在廣東、廣西和海南等地，養(yǎng)殖產量極高。其閉殼肌大、味道鮮美、營養(yǎng)豐富。目前，除了鮮食外，閉殼肌主要被加工成干貝、即食貝柱、速凍貝柱、貝柱罐頭[18]等方便食品，精深加工利用程度較低。目前尚未見有其在降血糖領域的應用報道。為了進一步挖掘海洋貝類生物活性肽的潛在輔助降血糖營養(yǎng)功能食品的開發(fā)價值，本研究選用新鮮華貴櫛孔扇貝、馬氏珠母貝和櫛江珧閉殼肌為研究對象，采用酶法水解制得酶解產物，研究其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并以小鼠作為動物試驗對象進行降血糖活性驗證，為海洋貝類資源高值化利用提供思路，也為開發(fā)新型輔助降血糖營養(yǎng)功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝和華貴櫛孔扇貝均購自湛江市雷州市流沙灣養(yǎng)殖場；櫛江珧購自湛江市東風市場。

風味蛋白酶 (57 821 U·g-1)、復合蛋白酶 (62 784 U·g-1)[諾維信 (中國) 生物技術有限公司]；α-葡萄糖苷酶、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷 (p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, pNPG) (上海源葉生物科技有限公司)；Folin-酚蛋白定量試劑盒 (北京鼎國昌盛生物技術公司)；可溶性淀粉 (北京索萊寶科技有限公司)；小鼠胰島素 (INS) 酶聯(lián)免疫分析 (ELISA) 試劑盒 (江蘇雨桐生物科技有限公司)；碳酸鈉、甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸等均為分析純。

雄性昆明小鼠，購自珠海百試通生物科技有限公司，飼養(yǎng)于廣東海洋大學實驗動物中心[SYXK(粵) 2019-0204]。

1.2 儀器與設備

UNIVERSAL 320R臺式高速冷凍離心機 (德國Hettich科學儀器公司)；VARIOSKAN FLASH全波長掃描式多功能酶標儀 (賽默飛世爾科技公司)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 (上海博訊醫(yī)療儀器股份有限公司)；HHS數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；羅氏活力血糖儀、羅氏血糖試紙 [羅氏診斷產品 (上海) 有限公司]；FDU-551真空冷凍干燥機、N-4000真空旋轉蒸發(fā)儀 (EYELA東京理化器械株式會社)。

1.3 方法

1.3.1 不同蛋白酶酶解產物的制備

鮮活貝類洗凈開殼取閉殼肌，沸水漂燙5 min后，紗布過濾，濾液濃縮凍干后，得到水提物；漂燙后的貝類組織按1∶3 (m∶V) 的料液比加水勻漿，調節(jié)pH至7.0，按照酶添加量5 000 U·g-1(依據(jù)原料蛋白質質量添加) 加入蛋白酶 (風味蛋白酶、復合蛋白酶)，50 ℃水浴振蕩器中進行酶解3 h，100 ℃ 滅酶，于 8 000 r·min-1離心 10 min取上清液，凍干得到酶解產物。通過測定酶解物中游離氨基酸態(tài)氮含量、短肽含量和α-葡萄糖苷酶抑制活性，篩選出最佳用酶。

1.3.2 酶解工藝對酶解產物 α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

以馬氏珠母貝閉殼肌作為研究對象，以復合蛋白酶作為試驗用酶，參照1.3.1所述酶解方法，分別考察酶解時間、酶添加量、酶解溫度和酶解pH 4個因素對酶解產物中α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。在最佳酶解工藝條件下，制備馬氏珠母貝閉殼肌酶解產物 (Enzymatic hydrolysate ofP. martensiiadductor muscle, EHPA)。

1.3.3 游離氨基酸態(tài)氮的測定

參考GB 5009.235—2016 《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》的操作步驟進行檢測。

1.3.4 短肽含量的測定

參考柏昌旺等[19]方法稍加修改，取酶解上清液按照體積比1∶1 加入10%的三氯乙酸 (TCA)，混勻后 4 ℃ 離心 (8 000 r·min-1, 10 min)，取上清液稀釋一定倍數(shù)測定。分別取40 μL樣品溶液和200 μL Folin?酚試劑甲液，室溫放置10 min，加入20 μL Folin?酚試劑乙液混勻靜置30 min后，在500 nm處測定其吸光度。選用牛血清白蛋白 (BSA)作為標準品，按照相同方法建立標準曲線。樣品測定吸光度對照標準曲線計算短肽質量濃度。獲得吸光度數(shù)據(jù)，使用Excel 2020軟件繪制短肽含量的標準曲線，得到回歸方程：y=0.756 8x+0.030 4，該曲線的R2為0.993 8，線性較好，可作為Folin?酚試劑定量測量的依據(jù)。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

采用pNPG法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，參考Zhang等[20]和林海生等[21]的方法稍作修改。α-葡萄糖苷酶抑制率 (Ri) 計算公式如下

式中：A樣品為樣品組吸光度，樣品+α-葡萄糖苷酶+pNPG；A樣品空白為樣品空白組吸光度，樣品+PB (磷酸鹽緩沖溶液) +pNPG；A對照為對照組吸光度，PB+α-葡萄糖苷酶+pNPG；A空白為空白組吸光度，PB+PB+pNPG；

1.3.6 EHPA 對小鼠糖耐量的影響

參考延?，摰萚3]方法，EHPA以不同比例與蒸餾水混溶后得到受試物。所有小鼠試驗前適應性喂養(yǎng)1周，禁食12 h后，采用血糖試劑盒檢測空腹血糖，隨機分為5組，不同劑量試驗組分別為：低劑量組 500 mg·kg-1、中劑量組 1 000 mg·kg-1、高劑量組 2 000 mg·kg-1、分別記為 EHPA?L、EHPA?M、EHPA?H，陽性對照組 (PC組，二甲雙胍150 mg·kg-1)和空白對照組 (NC組)，每組10只小鼠。連續(xù)灌胃受試物3 d，空白組灌胃蒸餾水，記錄體質量，計算體質量增長率 (%)。灌胃第4 d，禁食12 h，測定空腹血糖。各組與可溶性淀粉250 mg·kg-1混合同時灌胃，測定灌胃淀粉后各組0.5和2 h的血糖。并計算血糖曲線下面積 (AUC, mmol·min·L-1)。

式中：a為灌胃前血糖 (mmol·L-1)；b為灌胃0.5 h血糖 (mmol·L-1)；c為灌胃 2 h 血糖 (mmol·L-1)。

1.3.7 EHPA 對小鼠空腹血糖的影響

小鼠禁食不禁水12 h，采用尾部靜脈取血取小鼠尾尖血，使用羅氏活力血糖儀及血糖試紙測定小鼠血糖，重復2次。分別在灌胃前及結束后測定空腹血糖。

式中：Rh為降糖率 (%)； FBG0為給藥前空腹血糖濃度 (mmol·L-1)；FBG1為給藥結束后空腹血糖濃度(mmol·L-1)。

1.3.8 EHPA 對血清胰島素的影響

EHPA對正常小鼠血糖的影響試驗結束后，小鼠經眼球取血后，采用脫頸位法處死。室溫血液自然凝固 10～15 min，10 000 r·min-1離心 10 min，收集上清液，置于-80 ℃保存。采集臟器稱質量，取0.5 g肝臟加入9倍質量生理鹽水后勻漿制備成組織勻漿液，-80 ℃保存，使用前10 000 r·min-1離心10 min取上清液4 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒使用說明書操作，在450 nm波長下測定吸光度(Optical density, OD) 繪制標準品標準曲線，根據(jù)曲線計算各組小鼠血清胰島素濃度并計算出各組胰島素敏感指數(shù)和胰島素分泌指數(shù)。

式中：ISI為胰島素敏感指數(shù)；FPG為空腹血糖濃度 (mmol·L-1)；FINS為空腹胰島素濃度 (mmol·L-1)；FBCI為胰島素分泌指數(shù)。獲得吸光度數(shù)據(jù)，使用Excel 2020 軟件繪制胰島素含量的標準曲線，得到回歸方程：y=0.043 7x+0.011 2，R2為0.999 2，線性較好。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組試驗至少重復3次，采用Excel 2020軟件整理數(shù)據(jù)及作圖，用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，表中數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標準誤 ()”。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶對貝類閉殼肌酶解效果評價

適當熱預處理可加大酶對蛋白質的水解程度[22]，并可有效調控蛋白質水解產物組成[23-24]。另外，高溫可滅活易對試驗造成干擾的貝類內源蛋白酶，并殺死微生物。因而，本研究采用熱漂燙法對閉殼肌進行預處理，并將漂燙后水提物作為單獨一組進行對比分析。不同蛋白酶對貝類閉殼肌酶解產物游離氨基酸態(tài)氮質量分數(shù)的影響見圖1。酶解產物中游離氨基酸態(tài)氮質量分數(shù)顯著高于水提物 (P＜0.05)。風味蛋白酶酶解產物游離氨基酸態(tài)氮質量分數(shù)高于復合蛋白酶酶解產物，其中華貴櫛孔扇貝風味蛋白酶酶解產物此指標最高。造成此差別主要是由貝類組織蛋白結構和蛋白酶作用位點的不同所致，復合蛋白酶主要成分是內切酶和端肽酶，而風味蛋白酶是氨基端外切酶[24]。

圖1 不同蛋白酶對貝類閉殼肌酶解產物游離氨基酸態(tài)氮質量分數(shù)的影響注：不同小寫字母的組間差異顯著 (P＜0.05)，后圖同此。Fig. 1 Effect of different protease on mass fraction of free amino acid nitrogen in hydrolysate of shellfish adductor muscleNote: Different lowercase letters indicate significant difference between groups (P＜0.05); the same case in the following figures.

短肽濃度能夠衡量酶解產物的品質[25]。三氯乙酸法是一種理想的短肽提取方法[26-27]，通常采用三氯乙酸沉淀蛋白酶解液中的大分子肽段，并通過測定上清液中肽的濃度定義為短肽濃度[19]，李佳蕓等[7]發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝酶解產物中93.88%的短肽分子量小于2 000 D，這與孫建忠[28]用三氯乙酸沉淀法提取的林蛙油短肽分子量接近。酶解產物短肽質量濃度的測定結果見圖2。酶解產物短肽質量濃度顯著高于水提物，表明酶解過程釋放出大量短肽物質。3種貝類閉殼肌的復合蛋白酶酶解產物中，短肽質量濃度均顯著高于其風味蛋白酶酶解物，馬氏珠母貝和華貴櫛孔扇貝閉殼肌的酶解產物中，短肽質量濃度顯著高于櫛江珧酶解產物 (P＜0.05)。

圖2 不同蛋白酶對閉殼肌酶解產物短肽質量濃度的影響Fig. 2 Effect of different protease on mass concentration of short chain polypeptide in hydrolysates of shellfish adductor muscle

綜上，本研究所用的2種蛋白酶均能有效酶解貝類閉殼肌。采用風味蛋白酶有利于酶解產物的風味呈現(xiàn)[29]，而從酶解產物中有效成分出發(fā)，復合蛋白酶更適合后續(xù)研究[30]。

2.2 不同酶解產物對α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制活性是衡量糖尿病療效的重要科學依據(jù)[31]。在酶解產物的短肽質量濃度(16 mg·mL-1) 相同的情況下，貝類閉殼肌酶解產物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響結果見圖3。3種貝類閉殼肌的復合蛋白酶酶解產物均大于風味蛋白酶酶解產物，且馬氏珠母貝和華貴櫛孔扇貝的復合蛋白酶解產物 (兩者無顯著差異，P＞0.05) 顯著強于櫛江珧 (P＜0.05)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，櫛江珧的水提物也表現(xiàn)出較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，顯著高于其他兩種貝的水提物 (P＜0.05)。海洋貝類水提物中富含礦物質、氨基酸、?；撬帷⒛憠A、水溶性多糖等物質，多具有顯著的生物活性[32]。

圖3 貝類閉殼肌酶解產物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig. 3 Inhibition of α-glucosidase activity in hydrolysate of shellfish adductor muscle

綜上，復合蛋白酶酶解馬氏珠母貝的酶解產物，其短肽濃度和α-葡萄糖苷酶抑制活性均處于較高水平。而馬氏珠母貝的閉殼肌作為珍珠產業(yè)的副產物，資源利用率低[33]，基于資源綠色高值化利用理念，本研究將利用馬氏珠母貝閉殼肌作酶解產物，并配合復合蛋白酶進行深入研究。

2.3 馬氏珠母貝閉殼肌酶解工藝

考察了酶解時間、pH、溫度和酶添加量對酶解產物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。結果顯示，當酶解時間為3 h時酶解產物α-葡萄糖苷酶的抑制活性達到峰值 (圖4-a)，當酶解時間超過3 h后，隨著時間延長，酶解產物的抑制活性相較之前增長變慢，甚至出現(xiàn)下降，可能是由于起主要α-葡萄糖苷酶抑制活性作用的短肽被酶解成更小的物質，從而減弱或者失去了抑制活性。當酶添加量達到5 000 U·g-1時 (圖4-b)，則無法通過繼續(xù)提升酶添加量來顯著增強酶解產物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。蛋白酶過多時也會抑制水解能力[3]。當酶解溫度達到50 ℃時 (圖4-c) 抑制活性達到峰值，而溫度過高會導致酶解液抑制活性也隨之降低[33]。酶解pH為7.0時達到對α-葡萄糖苷酶抑制活性的峰值 (圖4-d)，而酶解環(huán)境過酸或過堿均會影響蛋白酶活性，導致對α-葡萄糖苷酶的抑制活性降低。

圖4 酶解條件對產物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig. 4 Effect of enzymolysis factors on α-glucosidase inhibitory activity

綜上，以α-葡萄糖苷酶抑制活性為評價指標，選擇較優(yōu)酶解條件：時間3 h，酶添加量5 000 U·g-1，酶解溫度50 ℃，酶解pH=7.0，該條件下制備的馬氏珠母貝閉殼肌酶解產物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性為24.54%。

2.4 EHPA短肽濃度對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

酶解產物隨著其短肽濃度的增加，對α-葡萄糖苷酶抑制活性增大，即酶解產物對α-葡萄糖苷酶抑制活性與短肽濃度有一定依賴性 (圖5)?？梢娫贓HPA中對α-葡萄糖苷酶抑制活性起主要作用的是短肽類物質。

圖5 不同短肽質量濃度的酶解產物的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig. 5 α-glucosidase inhibitory activity of enzymatic hydrolysates with different mass concentrations of short chain polypeptide

2.5 EHPA對小鼠血糖的影響

2.5.1 EHPA 對小鼠體質量的影響

EHPA的體外試驗已證明其具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，通過小鼠試驗進一步驗證其體內活性，結果見表1。在灌胃給藥3 d后，EHPA低、中、高組體質量增長呈遞增趨勢，但組間無顯著性差異(P＞0.05)，這與胡佳妮等[34]的研究結果一致，后者認為海洋水產蛋白肽會影響小鼠的食品利用率，而導致其體質量增長幅度不同。

表1 馬氏珠母貝酶解產物對正常小鼠體質量的影響 (N=10)Table 1 Effect of P. martensii hydrolysate on mass of mouse (N=10)

2.5.2 EHPA 對小鼠空腹血糖的影響

EHPA對小鼠空腹血糖的影響見表2。與空白組相比，PC組和試驗組的降糖率均有提高，其中EHPA-H組降糖率最高 (31.76%)，試驗組之間無顯著性差異 (P＞0.05)。結果表明，經過EHPA干預后，一定程度上可以降低小鼠空腹血糖濃度。

表2 馬氏珠母貝酶解產物對小鼠空腹血糖的影響 (N=10)Table 2 Effect of P. martensii hydrolysate on fasting blood glucose of mouse (N=10)

2.5.3 EHPA 對小鼠糖耐量的影響

EHPA對小鼠糖耐量影響試驗結果見表3。灌胃0.5及2 h后，與NC組小鼠相比，其他組血糖均顯著降低 (P＜0.05)，其中PC組小鼠血糖降低最顯著，其次為EHPA-H組。

表3 馬氏珠母貝酶解產物對小鼠糖耐量的影響 (N=10)Table 3 Effect of P. martensii enzymatic hydrolysate on glucose tolerance of mouse (N=10)

與NC組的血糖曲線下面積相比，其他組均顯著降低 (P＜0.05)，其中PC組血糖曲線下面積降低最為顯著，對小鼠糖耐量改善明顯，其次為EHPA-H組。

綜上所述，連續(xù)灌胃3 d后會影響正常小鼠的糖耐量，這與王婷婷[35]報道的海洋水產類酶解物對大鼠葡萄糖耐量的影響結果一致。

2.5.4 EHPA 對小鼠血清胰島素的影響

EHPA對小鼠血清胰島素影響的試驗結果見表4。與NC組的空腹血清胰島素相比，PC組和試驗組稍有提高，但各組間均無顯著性差異。胰島素敏感指數(shù)各組間均無顯著性差異。與NC組胰島素分泌指數(shù)相比，EHPA-L組有所提高，其余試驗組均有一定程度下降，但各組間均無顯著性差異 (P＞0.05)。結果表明EHPA對正常小鼠胰島素分泌幾乎沒有影響。

表4 馬氏珠母貝酶解產物對小鼠血清胰島素的影響 (N=10)Table 4 Effect of P. martensii hydrolysate on serum insulin of mouse (N=10)

3 結論

本研究通過比較不同貝類原料、蛋白酶、酶解因素等對酶解產物中游離氨基酸態(tài)氮、短肽濃度及α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，篩選出最佳貝類活性肽的制備方法，并通過動物實驗評價其輔助降血糖功效。結果顯示，3種貝類閉殼肌酶解產物均有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中馬氏珠母貝、華貴櫛孔扇貝酶解產物效果活性最強，而櫛江珧水提物抑制活性較好。采用復合蛋白酶制備馬氏珠母貝閉殼肌活性肽 (EHPA) 的條件為酶解時間3 h、酶添加量5 000 U·g-1、酶解溫度50 ℃、酶解pH 7.0，該條件下酶解產物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性為24.54%，且其抑制活性與其短肽的濃度成正相關，提示EHPA中具有降血糖活性的物質為短肽。有多項研究表明水生生物酶解產物具有降血糖活性，且其主要功效活性與其短肽關系密切[36-39]，本研究的動物試驗初步表明EHPA能影響糖耐量，具有輔助降血糖活性。不少研究指出動物組織水提物有降血糖活性[40-41]，櫛江珧的水提多糖具有多方面生物活性[32]，其中起到α-葡萄糖苷酶抑制作用的物質值得深入探討。