超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速分析氰霜唑及其代謝物CCIM在水果中的殘留

符靈梅， 王玉健， 徐 莉， 紀(jì)少凡

（?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心，海南 ?？?570311）

氰霜唑（cyazofamid）是2000年由日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社合成，并與巴斯夫共同開發(fā)的咪唑類保護性殺菌劑。氰霜唑?qū)β丫V病原菌如疫霉菌、腐霉菌等具有很高的殺菌活性[1-2]。2013年，我國如東眾意化工有限公司成為首家獲得氰霜唑原藥產(chǎn)品登記的企業(yè)。目前我國批準(zhǔn)登記的作物和防治對象共9種，分別是番茄晚疫病、馬鈴薯晚疫病、荔枝樹霜疫霉病、黃瓜霜霉病、葡萄霜霉病、觀賞菊花霜霉病、薔薇科觀賞花卉霜霉病、西瓜疫病、大白菜根腫病等。氰霜唑使用后會迅速分解，CCIM是氰霜唑在植物體內(nèi)的主要降解產(chǎn)物，比氰霜唑的毒性高[3]。兩者在農(nóng)副產(chǎn)品中殘留可能會通過膳食攝入給人們帶來潛在風(fēng)險。因此，我國的GB 2763—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了氰霜唑及其代謝物在葡萄、荔枝和西瓜的最大殘留限量為1、0.02、0.5 mg/kg；日本對氰霜唑及其代謝物在橙、蘋果、油桃和菠蘿中規(guī)定的最大殘留限量為5、1、1、1 mg/kg。

目前，國內(nèi)外對氰霜唑的殘留分析主要有LCMS/MS法、LC-DAD法和電化學(xué)法，這些方法或者只是建立了氰霜唑母體的分析方法，或者樣品前處理煩瑣，有機試劑用量較大。該研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，并結(jié)合QuEChERS樣品前處理方法，建立了同時定性、定量測定水果中氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的分析方法，該方法前處理簡單、能快速定性及定量、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可為開展氰霜唑及其代謝物CCIM在水果中殘留的監(jiān)管提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氰霜唑（純度98.7%）：Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；CCIM（純度99.9%）：first standard公司產(chǎn)品；乙腈、乙酸、甲酸（均為色譜純）：美國Fisher公司產(chǎn)品；無水硫酸鎂（分析純）：廣州試劑有限公司產(chǎn)品；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；十八烷基硅烷鍵合相（C18）、弗羅里硅土：Agilent公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水：法國Millipore公司產(chǎn)品。

超高效液相色譜儀（UPLC）：美國WATERS公司產(chǎn)品；API 4000Q四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源）：美國AB公司產(chǎn)品；Harvard II針 泵：美國Varian公司產(chǎn)品；MS3Basic旋渦混勻器：德國IKA公司產(chǎn)品；Centrifuge 5810R離心機：Eppendorf公司產(chǎn)品；G-285電子天平：Mettler公司產(chǎn)品。

1.2 樣品前處理

水果樣品取可食部分切碎、混勻。稱取待測樣品5.000 g于50 mL具塞離心管中，加入20 mL含體積分?jǐn)?shù)1.0%乙酸的乙腈溶液，渦旋振蕩2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋混合3 min，以9000 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL于玻璃離心管中，分別各加入50 mg C18粉末和弗羅里硅土粉末，渦旋混合30 s，以3000 r/min離心3 min，上清液過0.2 μm有機濾膜，待測。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Capcell PAK C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫；流量：0.75 mL/min；進樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），溫度550℃，電壓5500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣；正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)文獻報道，國內(nèi)外對氰霜唑和CCIM殘留的分析均采用QuEChERS前處理方法，提取溶劑采用乙腈或含體積分?jǐn)?shù)1.0%乙酸的乙腈，均能得到較好的回收率和精密度。為比較乙腈、含乙酸乙腈的提取效果，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，分別用乙腈、含體積分?jǐn)?shù)1.0%乙酸的乙腈對氰霜唑和CCIM標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行提?。訕?biāo)量為0.1 μg），計算回收率并采用SPSS（Version 19.0）對數(shù)據(jù)進行配對樣本T檢驗 （P＜0.05）分析。結(jié)果表明，使用乙腈和含體積分?jǐn)?shù)1.0%乙酸的乙腈作為提取溶劑時，氰霜唑回收率的顯著性為0.001（P＜0.05），CCIM回收率的顯著性為0.004（P＜0.05），差異顯著，且使用乙腈作為提取溶劑時，氰霜唑回收率為90.1%～127.0%，RSD為11.67%，CCIM回收率為85.2%～147.0%，RSD為18.98%，超出GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》對回收率的要求。使用含體積分?jǐn)?shù)1.0%乙酸的乙腈作為提取溶劑時，氰霜唑回收率為76.4%～105.0%，RSD為7.28%，CCIM回 收 率 為83.8%～108.0%，RSD為7.35%，滿足GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》的相應(yīng)要求。

在pH為4.90～9.56時，酸性越強，氰霜唑在水溶液中就越穩(wěn)定；隨著OH-離子濃度升高，氰霜唑的磺酸（叔）胺基團越不穩(wěn)定[4]。為考察乙酸體積分?jǐn)?shù)對氰霜唑、CCIM回收率的影響，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，考察體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%時乙酸乙腈溶液的提取回收率，并采用SPSS（Version 19.0）的Duncan多重比較檢驗法進行顯著性分析（P＜0.05），結(jié)果見表1。當(dāng)提取液乙酸體積分?jǐn)?shù)達到1.0%后，氰霜唑和CCIM的平均回收率無顯著性差異，因此選擇提取液中乙酸體積分?jǐn)?shù)為1.0%。

表1 乙酸體積分?jǐn)?shù)對氰霜唑、CCIM回收率的影響及差異顯著性分析（n=10）Table 1 Influence of acetic acid volume fraction on the recoveries and significance analysis of cyazofamid and CCIM（n=10）

續(xù)表1

2.2 提取溶劑體積的選擇

分別使用5、10、15、20、25、30 mL含乙酸體積分?jǐn)?shù)1.0%的乙腈提取1.0 μg氰霜唑和CCIM標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，上機進行檢測，以提取液體積為橫坐標(biāo)，以平均回收率為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果見圖1。提取液體積為20 mL時，可將1.0 μg氰霜唑和CCIM提取完全，因此選擇提取液體積為20 mL。

圖1 提取液體積與平均回收率關(guān)系圖Fig.1 Diagram of extraction volume and average recovery rate

2.3 色譜條件的選擇

根據(jù)文獻報道，國內(nèi)外對氰霜唑和CCIM的殘留分析使用的色譜柱主要有：Phenomenex Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm×2.6 μm）[5]、BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）[6]、Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）[4]、Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm×2.7 μm）[7]、XBridge-C18柱（150 mm×2.1 mm×3.5 μm）[8]、Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm×2.1 mm×3.5 μm）[9]、Phenomenex Kinetex PFP 100A柱（75 mm×4.6 mm×2.6 μm）[10]、Eclispe plus C18RRHD柱（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）[11]、Trace Excel 120ODSA柱（100 mm×4.6 mm×5 μm）[12]。由以上文獻可見，國內(nèi)外對氰霜唑和CCIM的殘留分析使用的色譜柱主要以C18為填料。作者考察了C18填料、C8填料、苯基柱等3類常見反相柱，包括Capcell PAK C18（2.0 mm×100 mm，5 μm）、Capcell PAK C18（2.0 mm×150 mm，5 μm）、Thermo Accjore C18（3.0 mm×150 mm，2.6 μm）、Phenomenex Kinetex XB-C18（3.0 mm×150 mm，2.6 μm）、BEH C8（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Eclipse XDB-C8（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Capcell PAK PFP（2.0 mm×150 mm，5 μm）等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在表2中洗脫梯度下，Capcell PAK C18（2.0 mm×150 mm，5 μm）分析柱分離效果優(yōu)于其他反相柱。同時還分別使用甲醇、乙腈作為流動相A，水、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水作為流動相B，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用乙腈作為流動相A、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水作為流動相B時，較之甲醇-水、甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水和乙腈-水流動相，基線平穩(wěn)，且峰形好。因此選擇Capcell PAK C18柱（2.0 mm×150 mm，5 μm）作為分析柱，乙腈作為流動相A，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水作為流動相B，梯度洗脫條件見表2。在上述條件下，0.02 μg/mL氰霜唑及其代謝物CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖2。

表2 流動相梯度洗脫條件Table 2 Mobile phase gradient elution conditions

圖2 氰霜唑及其代謝物CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of cyazofamid and CCIM standard solution

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化及選擇

將氰霜唑和CCIM標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描確定化合物母離子，再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描，得到碎片離子，通過優(yōu)化條件，得到二級質(zhì)譜圖。通過MRM選擇相對豐度較高的離子對，確定為定性、定量離子對，并優(yōu)化去簇電壓、碰撞電壓等參數(shù)，綜合考量離子豐度、背景干擾等因素，確定質(zhì)譜條件見表3，采用電噴霧離子源（ESI），溫度550℃，電壓5500 V，霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣，MRM模式。氰霜唑和CCIM子離子全掃描質(zhì)譜圖見圖3、圖4。

表3 離子對及相關(guān)電壓參數(shù)Table 3 Ion pairs and related voltage parameters

圖3 氰霜唑子離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.3 Total scanning of ion mass-spectrogram of cyazofamid

圖4 CCIM子離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.4 Total scanning of ion mass-spectrogram of CCIM

2.5 凈化方法的選擇

由于水果基質(zhì)復(fù)雜，直接提取上機分析會使色素、甾醇和維生素等雜質(zhì)殘留于分析柱及儀器中，需采用QuEChERS前處理方法進一步凈化[13-14]。分別添加各50 mg的PSA粉末、C18粉末、石墨化炭黑粉末、弗羅里硅土粉末于0.010 mg/kg氰霜唑和CCIM混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中，測定其回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSA粉末、石墨化炭黑粉末對氰霜唑和CCIM有吸附保留，氰霜唑和CCIM的回收率分別為7.9%～29.4%和0～35.8%；使用C18粉末凈化時，氰霜唑和CCIM的回收率分別為83.2%～90.6%和87.9%～93.5%；使用弗羅里硅土粉末凈化時，氰霜唑和CCIM的回收率分別為82.5%～93.2%和89.1%～101.0%；而使用C18粉末和弗羅里硅土粉末作為凈化劑時，氰霜唑和CCIM的回收率分別為88.4%～110.0%、95.2%～108.0%。由此可見，C18粉末和弗羅里硅土粉末混合使用時，凈化效果較佳。因此，選擇C18粉末和弗羅里硅土粉末作為凈化劑。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)（MEs）評價是將在基質(zhì)匹配校準(zhǔn)中獲得的斜率與在標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)中獲得的斜率進行比較，并計算氰霜唑和CCIM的基質(zhì)與溶劑的斜率比，使用以下公式計算：MEs（%）=（基質(zhì)匹配校準(zhǔn)中獲得的斜率/標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)中獲得的斜率-1）×100。通過比較乙腈與不同基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的基質(zhì)效應(yīng)（質(zhì)量濃度為0.001～0.040 μg/mL）可得，氰霜唑在葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿中的MEs分別為53.85%、32.74%、27.61%、3.70%、4.32%、13.68%、11.84%；CCIM在葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿中的MEs分別為33.73%、40.70%、40.58%、7.75%、5.13%、2.73%、7.09%。由此可見，不同樣品基質(zhì)效應(yīng)差異顯著，因此選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量的校準(zhǔn)曲線。

2.7 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

準(zhǔn)確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.040 μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程及相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 氰霜唑和CCIM基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear regression equation and correlation coefficient of matrix standard curves of cyazofamid and CCIM

2.8 方法檢出限和定量限

根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》，采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差評估法確定方法檢出限和定量限，加入最低可接受質(zhì)量濃度的樣品作為空白獨立測定10次，得出結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（s），以（空白平均值+4.65s）作為檢出限，以（空白平均值+10s）作為定量限，結(jié)果見表5。該方法對葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿的定量限滿足國內(nèi)外對氰霜唑及其代謝物CCIM的限量要求。

表5 不同基質(zhì)中氰霜唑和CCIM的檢出限和定量限Table 5 LOD and LOQ of cyazofamid and CCIM in different matrices

2.9 方法的精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度

在葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿陰性樣品中按照表6至表12中的添加水平添加氰霜唑和CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個進行6次平行添加回收實驗，結(jié)果表明，在0.004～0.080 mg/kg添加水平內(nèi)，氰霜唑和CCIM平均回收率分別為80.71%～103.27%和76.62%～100.20%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.14%～11.15%和3.24%～11.16%，滿足GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求。

表6 葡萄樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 6 Recovery rate and RSD of grape sample（n=6）

表12 菠蘿品添加回收率及RSD（n=6）Table 12 Recovery rate and RSD of pineapple sample（n=6）

表7 荔枝樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 7 Recovery rate and RSD of lychee sample（n=6）

表8 西瓜樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 8 Recovery rate and RSD of watermelon sample（n=6）

表9 蘋果樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 9 Recovery rate and RSD of apple sample（n=6）

表10 油桃樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 10 Recovery rate and RSD of nectarine sample（n=6）

表11 橙樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 11 Recovery rate and RSD of orange sample（n=6）

3 結(jié)語

選用QuEChERS前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時檢測葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙和菠蘿基質(zhì)樣品中氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的方法。該方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可為農(nóng)業(yè)部門、市場監(jiān)管部門和第三方檢測機構(gòu)提供技術(shù)參考。