基于傾向性評分匹配探討載脂蛋白E水平及其基因多態(tài)性與腦血栓形成的相關(guān)性分析*

黃 杰，黃華玲，王 鵬，謝東德， 李海燕 ， 董少文

1.南方醫(yī)科大學附屬佛山醫(yī)院檢驗科，廣東佛山 528000；2.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?571199；3.南方醫(yī)科大學附屬佛山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東佛山 528000

在我國住院的急性腦卒中患者中，3個月內(nèi)病死率為9.0%～9.4%，致殘率為34.5%～37.1%[1]。在腦卒中的發(fā)病常見因素中，約60%是因腦血栓形成導致。腦血栓是一種在腦血管內(nèi)淤血、凝血傾向增加、腦血管管壁自身病變及腦血管血流減慢情況下，血液中的紅細胞、纖維蛋白和血小板附著在血管壁上而形成的血栓，是由多種因素影響造成的疾病。有研究表明，腦血栓形成的危險因素包括高血壓、高脂血癥、高膽固醇、高血糖及部分血清載脂蛋白(Apo)標志物等[2]。ApoE是一種參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的多態(tài)性脂蛋白，ApoE基因可通過產(chǎn)生多態(tài)性蛋白，參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化和代謝過程，其基因多態(tài)性決定血脂水平，與許多腦血管病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[3]。目前，雖已有部分關(guān)于ApoE基因多態(tài)性或ApoE水平與腦血栓形成的相關(guān)性研究，但很少有文獻同時分析ApoE水平及其基因多態(tài)性與腦血栓形成的相關(guān)性。而且由于腦血栓形成的危險因素較多，容易造成混雜變量偏倚及數(shù)據(jù)偏差，導致部分專家與學者的研究結(jié)果不盡相同。傾向性評分匹配(PSM)已廣泛應(yīng)用于觀察及臨床非隨機化數(shù)據(jù)的研究，根據(jù)PSM得出與實驗組混雜影響因素分布均勻的對照組，從而減少偏倚[4]。本研究旨在探討ApoE水平及其基因多態(tài)性與腦血栓形成的相關(guān)性，為保證研究結(jié)果更具科學性及客觀性，采用PSM方法，能夠在設(shè)計和分析階段有效平衡對照研究中與腦血栓形成相關(guān)危險變量的偏倚，從而獲得ApoE各基因型與腦血栓形成的客觀相關(guān)性數(shù)據(jù)，以及各基因型對應(yīng)的血清ApoE水平，探討ApoE水平及其基因型是否可作為用于監(jiān)測及早期評估腦血栓形成的新標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2021年1月在南方醫(yī)科大學附屬佛山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診擬診為早期腦血栓形成的312例患者作為研究對象，對其進行評估并隨訪6個月，根據(jù)隨訪期間再次就診情況，結(jié)合臨床癥狀及影像學診斷結(jié)果，將疑似患者分為腦血栓組(144例)和對照組(168例)。其中男148例，女164例。納入標準：符合文獻[5]的相關(guān)診斷標準，包括：(1)臨床癥狀，表現(xiàn)為頭暈、乏力、肢體麻木、感覺障礙、構(gòu)音障礙、意識障礙等；(2)神經(jīng)專科檢查，包括病理反射陽性，腹壁及提睪反射減弱或消失；(3)采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表對腦梗死進行評分，分數(shù)越高表示腦梗死對神經(jīng)系統(tǒng)的影響程度越大；(4)顱腦CT血管造影(CTA)、磁共振成像(MRI)結(jié)果提示相關(guān)腦梗死責任病灶信息，CTA明確有關(guān)血管閉塞或狹窄信息，多模式MRI[包括彌散加權(quán)成像(DWI)、灌注加權(quán)成像(PWI)]：DWI發(fā)現(xiàn)缺血灶，確定病灶大小、部位，PWI顯示腦血流動力學改變。排除標準：(1)不愿意配合醫(yī)學觀察研究的患者；(2)有心、肝、腎功能異常的患者；(3)有血液感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腦出血、腦腫瘤的患者。高血壓判斷標準則參照《中國急診高血壓診療專家共識(2017修訂版)》[6]進行診斷及高血壓級別分型。糖耐量異常的診斷標準參照文獻[7]執(zhí)行。收集記錄患者首次就診時的實驗室檢查項目數(shù)據(jù)：甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ApoA、ApoB、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原(FIB)、空腹葡萄糖(Glu)、ApoE及ApoE基因型等。

1.2方法 血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、Glu、ApoA、ApoB、ApoE等項目采用全自動生化分析儀(邁瑞6000i)檢測，前5項檢測方法分別為膽固醇氧化酶法、選擇性清除法、過氧化物酶清除法、免疫化學沉淀法、葡萄糖氧化酶法，后3項檢測方法均為免疫透射比濁法。檢測標本均為患者首次就診時抽取的血液標本。標本前處理先使用含有促凝劑和惰性分離膠的真空采血管，將抽取的血液標本置于低速離心機以5 000 r/min離心5 min，并在2 h內(nèi)完成檢測。D-D與FIB則采用日本Sysmex CS 5100全自動凝血儀進行檢測，檢測方法分別為免疫比濁法和凝固法。D-D與FIB的血液標本為使用枸櫞酸鈉抗凝后的靜脈外周血血漿，血液標本抽取時間與處理原則與生化標本相同。ApoE基因檢測通過留取以乙二胺四乙酸二鉀抗凝的靜脈血，在破碎細胞后，先以柱提法洗脫提純目的基因，然后采用熒光定量PCR檢測得到目的基因型別。以上所有檢測項目及檢測過程均嚴格按照各儀器標準操作規(guī)程進行操作，以保證結(jié)果的準確性。

2 結(jié) 果

2.1腦血栓組和對照組PSM前、后基線資料比較 研究對象共312例，其中腦血栓組144例，對照組168例。腦血栓組和對照組PSM前基礎(chǔ)資料，如性別、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、HDL-C、ApoB、Glu等比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。采用PSM對兩組基礎(chǔ)資料進行1∶1近似PSM后成功匹配87對，各協(xié)變量均衡性得到提高，兩組基礎(chǔ)資料差異減小，均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表2。

表1 腦血栓組和對照組PSM前一般資料比較[n(%)或或P25/P50/P75]

表2 腦血栓組和對照組PSM后一般資料比較[n(%)或或P25/P50/P75]

組別nHDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)ApoA(g/L)ApoB(g/L)Glu(mmol/L)FIB(g/L)D-D(g/L)腦血栓組1441.04±0.253.26±1.131.18±0.201.02±0.277.35±2.853.54±1.390.40/0.69/0.99對照組1681.15±0.273.04±1.051.17±0.160.94±0.266.29±1.863.31±0.980.27/0.76/0.94χ2/t/Z3.6131.7570.4622.0503.7811.600-1.535P0.0430.0800.6380.0150.0180.1110.125

續(xù)表2 腦血栓組和對照組PSM后一般資料比較[n(%)或或P25/P50/P75]

2.2腦血栓組和對照組ApoE基因型和基因攜帶分布情況比較 經(jīng)PSM成功后的87對數(shù)據(jù)中，腦血栓組主要以ε3ε3、ε3ε4及ε4ε4 3種ApoE基因型組成，而對照組主要由ε2ε3、ε3ε3和ε3ε4 3種ApoE基因型組成。腦血栓組ε3ε4及ε4ε4基因型頻率明顯高于對照組，ε2ε3基因型頻率明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；腦血栓組和對照組ε2ε2、ε2ε4和ε3ε3基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。腦血栓組攜帶ε4基因頻率明顯高于對照組；攜帶ε2基因頻率明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 腦血栓組和對照組ApoE基因型和基因攜帶率分布情況比較[n(%)]

2.3不同ApoE基因型在腦血栓組和對照組中ApoE水平比較 經(jīng)過PSM成功后的87對數(shù)據(jù)中，不同ApoE基因型腦血栓組對應(yīng)的ApoE水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高水平ApoE可能是腦血栓形成的獨立危險因素；無論是腦血栓組還是對照組，攜帶一個或超過一個ε4基因(≥1個ε4)時，其對應(yīng)的ApoE水平均明顯高于其他基因型，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ε4基因型是ApoE的高危基因型。見表4。

表4 不同ApoE基因型在腦血栓組和對照組中ApoE水平比較

3 討 論

腦卒中是全球第二大死亡原因，也是致殘的主要原因，而腦血栓形成是腦卒中最常見的發(fā)病原因，占全部腦卒中的60%左右[8]。急需通過早期、快速、全面檢查和評估來預(yù)測腦血栓形成的風險，并盡早進行臨床干預(yù)及治療，有助于做好疾病的一級預(yù)防。然而，臨床上常規(guī)顱腦MRI檢查評估并無法明顯提高早期腦血栓形成的診治效率，因為嚴格的急性腦梗死診治定義與影像學檢查結(jié)果本身就密不可分[9]。所以，想要在早期對急性腦梗死進行病情惡化的可能性預(yù)測，需要更多的實驗室診斷技術(shù)加以實現(xiàn)。目前，在與腦血栓形成相關(guān)的研究領(lǐng)域，有關(guān)ApoE的研究正逐步成為新的熱點。有研究表明，血清ApoE是腦血栓形成的危險因子， ApoE基因多態(tài)性與腦血栓的形成存在相關(guān)性，但是與腦血栓形成相關(guān)的危險因素較多，包括血壓、血脂、血糖及機體血液的高凝狀態(tài)，以及血管本身的病變等[10]，并且各因素之間也存在相互影響。有研究表明，攜帶ApoE-ε4基因型的腦卒中患者TC和LDL-C水平均明顯高于攜帶ε2和ε3基因型的患者，得出ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病存在關(guān)聯(lián)[11]。 但是，血脂水平早已被證實是腦血栓形成的危險因素之一[12]。究竟是血脂的總體水平導致了腦血栓形成的風險，還是其中的ApoE基因型起到?jīng)Q定性作用?為解決這個變量間偏倚的問題，本研究采用PSM方法，在實驗設(shè)計和分析階段有效平衡對照研究中與腦血栓形成相關(guān)危險變量的偏倚，以便提高ApoE基因與腦血栓形成相關(guān)性研究結(jié)果的準確性及可信度。

ApoE基因主要通過影響脂蛋白對脂類的轉(zhuǎn)運而影響血脂水平。ApoE基因包括3種基因亞型(ε2、ε3、ε4)和6種表型(ε2 ε2、ε2 ε3、ε2 ε4、ε3 ε3、ε3 ε4、ε4 ε4)[13]。本研究結(jié)果顯示，腦血栓組ε3ε4及ε4ε4基因型頻率明顯高于對照組，也就是說腦血栓組攜帶ε4基因的頻率明顯高于對照組，這與SMITH[14]的研究結(jié)果一致。脂質(zhì)代謝基因影響動脈粥樣硬化形成的病理過程[15]，ε4基因是導致動脈粥樣硬化的獨立危險因素，與個體血漿TC水平升高及心腦血管病的發(fā)生具有相關(guān)性[16]；相反，ε2基因能夠降低血漿TC水平[17]，從而降低腦血栓形成的風險。CHOWDHURY等[18]的研究證實，ε2和ε4基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有對脂蛋白的分離和反向影響。所以，本研究對照組攜帶ε2基因頻率更高，具有準確性及科學性。而攜帶ε3基因頻率在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，主要是因為ε3基因最為常見，并且其產(chǎn)生的ApoE多態(tài)性脂蛋白被認為并不是高風險的脂蛋白[19]。

李秀鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn)，ε4基因的存在會影響血清中脂蛋白水平。本研究通過分析腦血栓組和對照組不同基因型所對應(yīng)的ApoE水平發(fā)現(xiàn)，無論是腦血栓組還是對照組，攜帶ε4基因型時，其對應(yīng)的ApoE水平均高于其他基因型，同樣證實了ε4基因影響血清ApoE水平。此外，腦血栓組不同ApoE基因型對應(yīng)的ApoE水平均明顯高于對照組同種基因型，也就是說腦血栓患者血清中ApoE水平更高，這與黃柳等[21]的研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果提示，動脈粥樣硬化嚴重程度與ApoE啟動子多態(tài)性可能存在聯(lián)系，參與調(diào)控ApoE轉(zhuǎn)錄的過程。此外，腦梗死患者血清ApoE水平明顯增高，除含有高危基因(ε4基因)外，還可能與神經(jīng)源性ApoE增加有關(guān)[22]，具體機制可能與MTHFRC677T基因多態(tài)性有關(guān)。

綜上所述，本研究采用PSM對研究過程中的混雜因素與數(shù)據(jù)偏倚進行有效平衡后，得出ApoE水平及其基因多態(tài)性與腦血栓的形成有關(guān)。腦血栓形成患者血清ApoE水平明顯升高，通過監(jiān)測血清ApoE水平變化可用于早期評估腦血栓形成的風險；而ε4是ApoE的高?；蛐停鋵?yīng)的血清ApoE水平增加幅度明顯高于ε2和ε3基因型。所以，同時監(jiān)測ApoE水平及其基因多態(tài)性，對輔助腦血栓形成的早期診治及預(yù)防具有較大的臨床應(yīng)用價值。