MDR1、SOX4、WT1在急性髓系白血病中的作用及表達(dá)水平*

耿 雪，張建華，陳 艾

1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 401120

急性髓系白血病(AML)是一組高度異質(zhì)性、惡性、克隆性血液腫瘤，由骨髓增生異常綜合征、骨髓增殖性腫瘤等血液相關(guān)疾病及腫瘤相關(guān)放化療引起[1]。AML發(fā)病涉及多種基因融合和突變，基因組學(xué)改變與AML的發(fā)病、發(fā)展和預(yù)后有明確的相關(guān)性[2]。多藥耐藥基因(MDR1)是調(diào)控腫瘤耐藥的基因，其表達(dá)可促使癌細(xì)胞對抗腫瘤治療產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致治療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良[3]。SOX4是SOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在細(xì)胞生長發(fā)育，以及惡性腫瘤細(xì)胞增殖、擴(kuò)散中均發(fā)揮重要作用[4]。Wilms瘤基因1(WT1)是一種有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成相關(guān)[5]。本研究擬探討MDR1、SOX4、WT1在AML中的表達(dá)特點(diǎn)，分析其與AML臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年8月本院收治的149例AML患者作為AML組，其中男89例，女60例；年齡50～68歲，平均(59.25±4.27)歲；AML分型：M1型12例，M2型85例，M3型15例，M4型16例，M5型20例，M6型1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查確診為AML，符合2016年世界衛(wèi)生組織制定的造血和淋巴組織腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)年齡18歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓系白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等其他血液系統(tǒng)疾病患者；(2)合并實(shí)體腫瘤患者；(3)入組前接受過化療、免疫或靶向治療的患者。另選取同期于本院行骨髓檢查無明顯異常的72例輕度貧血(血紅蛋白90～120 g/L)患者作為對照組，其中男42例，女30例；年齡48～69歲，平均(59.07±4.31)歲。AML組和對照組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經(jīng)獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2骨髓MDR1、SOX4、WT1檢測方法 取骨髓穿刺獲得的骨髓組織標(biāo)本2～3 mL，分離白細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。常溫下以1 500 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，棄上清液。采用Wizard?SV Genomic DNA Purification Kit組織DNA提取試劑盒(美國Promega生物公司)提取RNA，采用cDNA試劑盒(美國賽默飛公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL cDNA樣品加入實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)體系，采用CFX96實(shí)時定量PCR系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)進(jìn)行PCR。引物由上海捷瑞公司合成，引物序列如下。MDR1 mRNA上游：5′-GCTGTCAAGGAAGCCAATGCCT-3′；下游：5′-TGCAATGGCGATCCTCTGCTTC-3′。SOX4 mRNA上游：5′-GTGAGCGAGATGATCTCGGG-3′；下游：5′-CAGGTT GGAGATGGACTC-3′。WT1 mRNA上游：5′-ACAGGGTACGAGAGCGATAACCA-3′；下游:5′-CACACGTCGCACATCCTGAAT-3′。β-actin(內(nèi)參)上游：5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′；下游：5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。反應(yīng)體系，DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30次。采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA相對表達(dá)水平。

1.3隨訪 出院后電話隨訪至2021年10月，統(tǒng)計(jì)隨訪期間總生存情況，總生存時間為自病理確診到全因死亡或隨訪結(jié)束。

2 結(jié) 果

2.1AML組和對照組骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平比較 AML組骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 AML組和對照組骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平比較

2.2不同臨床特征AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平比較 白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥40×109/L、有器官浸潤、治療后非完全緩解AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平均高于白細(xì)胞計(jì)數(shù)<40×109/L、無器官浸潤及治療后完全緩解患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、性別、AML分型、血小板計(jì)數(shù)患者M(jìn)DR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平比較

2.3不同MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平AML患者總生存率比較 149例AML患者隨訪期間失訪5例，余144例中死亡48例，MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA高表達(dá)AML患者總生存率均低于MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA低表達(dá)AML患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表3。

注：A為不同MDR1 mRNA表達(dá)水平患者生存曲線；B為不同SOX4 mRNA表達(dá)水平患者生存曲線;C為不同WT1 mRNA表達(dá)水平患者生存曲線。

表3 不同MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平AML患者總生存率比較[n(%)]

2.4影響AML患者預(yù)后的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 以AML患者生存情況作為因變量，納入年齡、性別、AML分型、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、器官浸潤、治療后緩解情況、MDR1 mRNA表達(dá)水平、SOX4 mRNA表達(dá)水平、WT1 mRNA表達(dá)水平作為自變量(表4)。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析(ENTER法)結(jié)果顯示，有器官浸潤、治療后非完全緩解、MDR1 mRNA高表達(dá)、SOX4 mRNA高表達(dá)、WT1 mRNA高表達(dá)與AML患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，見表5。將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析(ENTER法)，結(jié)果顯示，治療后非完全緩解、MDR1 mRNA高表達(dá)、SOX4 mRNA高表達(dá)、WT1 mRNA高表達(dá)是AML患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表6。

表4 賦值表

表5 影響AML患者預(yù)后的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

表6 影響AML患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討 論

AML是一組高病死率的惡性腫瘤，由骨髓干細(xì)胞克隆異常增殖和分化引起，發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、環(huán)境改變、染色體易位及基因突變等，大多數(shù)患者出現(xiàn)白細(xì)胞增多伴骨髓衰竭跡象(貧血和血小板減少)及疲勞、厭食和體質(zhì)量減輕，少數(shù)患者可出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大和器官腫大，如果不及時治療，通常會在診斷后數(shù)月內(nèi)因感染或出血而死亡[1]。過去40年，AML的治療一直局限于高劑量細(xì)胞毒性化療，近年來，隨著深度測序技術(shù)的發(fā)展和靶向藥物的應(yīng)用，具有更高療效的化療和更低毒性的靶向療法逐漸應(yīng)用于臨床，但是靶向藥物耐藥、治療毒性疊加效應(yīng)等給治療帶來新的挑戰(zhàn)[7]，患者預(yù)后仍然不是十分理想[8]。

MDR1是一種三磷酸腺苷(ATP)依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由ABCB1基因編碼，位于染色體區(qū)域7q21上，在腸道、結(jié)腸、胎盤、肝臟、血腦屏障等多種組織中表達(dá)，通過減少敏感器官或細(xì)胞中異生物質(zhì)的積累發(fā)揮保護(hù)作用[9]。MDR1編碼的糖蛋白是一種糖基化膜蛋白，屬于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ATP結(jié)合超家族成員，嵌于細(xì)胞膜上，作為膜通道可將細(xì)胞內(nèi)底物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥[10]。MDR1在腫瘤細(xì)胞中充當(dāng)化療藥物外排泵，是癌細(xì)胞對化療耐藥的主要機(jī)制之一。有研究結(jié)果顯示，MDR1多態(tài)性可改變蛋白質(zhì)表達(dá)或功能，與結(jié)直腸癌化療藥物反應(yīng)性有關(guān)[11]。MDR1基因表達(dá)增加降低癌細(xì)胞中具有細(xì)胞毒性的抗癌藥物濃度，并導(dǎo)致多藥耐藥表型，與神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等多種癌癥化療后預(yù)后不良有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，AML患者骨髓中MDR1 mRNA表達(dá)水平增加，并且其高表達(dá)與白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加、有器官浸潤、治療后非完全緩解及預(yù)后不良有關(guān)，說明MDR1 mRNA高表達(dá)與AML進(jìn)展、治療反應(yīng)性差及預(yù)后不良有關(guān)。KASSEM等[13]在報(bào)道中指出，MDR1基因表達(dá)水平在AML耐藥患者中明顯升高，MDR1基因高表達(dá)與低完全緩解率和低生存率有關(guān)。推測MDR1可能通過誘導(dǎo)AML對抗腫瘤治療耐藥參與其進(jìn)展過程。

SOX家族由參與細(xì)胞和器官發(fā)育分化及癌癥發(fā)生和發(fā)展的轉(zhuǎn)錄因子組成，SOX4是SOX家族中一種重要的發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子，含474個氨基酸殘基，參與骨和心臟等器官發(fā)育，與骨質(zhì)疏松癥、癌癥等多種疾病有關(guān)[14]。目前，已知SOX4在20多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用促進(jìn)癌細(xì)胞存活、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[15]。有研究顯示，SOX4可直接或間接負(fù)調(diào)節(jié) WNT5a水平，增加膀胱癌細(xì)胞侵襲性[16]，在晚期前列腺癌中，SOX4通過靶向上調(diào)miR-17-92表達(dá)水平，下調(diào)RB1蛋白表達(dá)水平，促使癌細(xì)胞增殖[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，SOX4 mRNA在AML患者骨髓中呈高表達(dá)，是AML預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，表明SOX4在AML中發(fā)揮致癌基因作用。LU等[18]研究認(rèn)為，SOX4是急性白血病發(fā)病的重要啟動因子，與AML患者預(yù)后不良獨(dú)立相關(guān)。SOX4可能通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路參與AML的發(fā)病過程[19]，也可能誘導(dǎo)Rho GTPase激活蛋白9表達(dá)上調(diào)，促使AML細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，促使癌癥進(jìn)展[20]。

WT1最初被鑒定為Wilms腫瘤的候選基因，進(jìn)一步研究表明，WT1可調(diào)節(jié)一系列靶基因和信號途徑參與細(xì)胞發(fā)育、器官形成、組織穩(wěn)態(tài)維持及疾病發(fā)病過程[21]。有研究表明，WT1 mRNA在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮致癌基因作用，在乳腺癌中WT1 mRNA表達(dá)水平增加，抑制WT1 mRNA表達(dá)水平可降低細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖，促使癌細(xì)胞凋亡[22]。WT1 mRNA在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，WT1 mRNA在AML中表達(dá)水平增加，WT1 mRNA高表達(dá)與AML患者預(yù)后有關(guān)，證明WT1在AML中發(fā)揮致癌基因作用。PANDEY等[24]研究結(jié)果顯示，WT1 mRNA在急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓樣本中表達(dá)水平增加，WT1 mRNA高表達(dá)可上調(diào)白血病細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白A1 mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達(dá)水平均增加，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，MDR1 mRNA高表達(dá)、SOX4 mRNA高表達(dá)、WT1 mRNA高表達(dá)與AML患者預(yù)后不良有關(guān)，提示MDR1、SOX4、WT1均參與了AML的發(fā)病機(jī)制，可為AML病情評估、預(yù)后預(yù)測及靶向治療提供參考。本研究局限之處在于隨訪時間過短，MDR1、SOX4、WT1與AML患者預(yù)后的關(guān)系尚有待進(jìn)一步延長隨訪時間加以證實(shí)。