家禽通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌PCR檢測方法的優(yōu)化*

康翠翠，蔡曉慶，張妹，陳小嬌，王秋月，陳文平

（1.北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司，北京 平谷 101206；2.國家蛋雞產業(yè)技術體系平谷綜合試驗站，北京 平谷 101206）

沙門氏菌是一種常見的危害人與動物的革蘭氏陰性菌，目前確定的沙門氏菌血清型已超過2 600種，其中腸炎沙門氏菌是引起人及動物中毒的一種重要血清型沙門氏菌，嚴重危害人與動物健康。雞白痢和禽傷寒沙門氏菌不僅可以造成雞群死亡，還可垂直傳播至下一代，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。目前，沙門氏菌的檢測方法包括選擇性增菌培養(yǎng)、血清型鑒定、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、生化鑒定和以核酸為基礎的聚合酶鏈式反應（PCR）檢測。然而選擇性增菌培養(yǎng)、生化鑒定和血清型鑒定耗費時間較長；ELISA法只適合于血清檢測；以核酸為基礎的PCR法檢測時間短、效率高，可以檢測各種樣品，因此成為目前沙門氏菌檢測廣受歡迎的一種方法。本文在前人研究基礎上，對禽源常見的通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌PCR檢測程序進行優(yōu)化，提高檢測靈敏度，以期為后期飼料、水源或疾病診斷中沙門氏菌的檢出提供更加準確的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

標準菌株：腸炎沙門氏菌（CVCC3762）和雞白痢沙門氏菌（CVCC533）標準菌株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，-80 ℃保存于本實驗室。

材料：營養(yǎng)肉湯購自北京陸橋技術股份有限公司，動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq PCR mix、ddHO、DM 2000 DNA Marker均購自北京匯天東方科技有限公司，瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

待兩株標準菌株融化后，取1 μL菌液放入裝有5 mL無菌肉湯培養(yǎng)基的無菌試管中，于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后取出備用。取1.5 mL菌液于2 mL無菌離心管中，12 000 rpm/min，4 ℃離心2 min，棄去上清液，沉淀嚴格按照動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌中的DNA。DNA提取完成后利用超微量分光光度計檢測所提取DNA濃度，并將DNA置于-20 ℃保存。

試驗中所涉及的引物是根據參考文獻設計合成的，具體序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成?；陔u白痢沙門氏菌ipaj基因設計的引物來自于中國農業(yè)大學徐桂云實驗室。

表1 沙門氏菌各血清型引物序列及原始反應程序

1.3 PCR反應條件的優(yōu)化

原始PCR體系：2×Taq PCR mix 7 μL，前后引物（10 μM）各0.5 μL，DNA 1 μL，ddHO補充至15 μL。通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌反應程序見表1。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

為了確定通用型和各血清型沙門氏菌常規(guī)PCR的最佳退火溫度，本試驗共設計7個不同溫度梯度進行擴增反應，通用型沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的退火溫度梯度依次為45.6、49.8、52.4、55.1、57.7、62.1 ℃和64.1 ℃；腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌的退火溫度梯度為46.6、50.8、53.4、56.1、58.7、63.1 ℃和65.1 ℃。利用各沙門氏菌標準菌株進行試驗，PCR擴增結束后，擴增產物用1.0%瓊脂凝膠進行電泳，經凝膠成像系統(tǒng)分析后確定最佳退火溫度。

在確定最優(yōu)退火溫度后，將體系中引物終濃度分別調整至0.2、0.4、0.6 μM和0.8 μM進行擴增反應，確定其最佳引物濃度。

在確定最佳退火溫度及最佳引物濃度的基礎上，將體系中的循環(huán)數(shù)分別按照25、30個及35個進行擴增，確定其引物最佳擴增循環(huán)數(shù)。

1.4 PCR檢測限測定及對比

用ddHO對DNA進行10倍連續(xù)稀釋，獲得終濃度為430.0、43.0、4.3 pg/μL、430.0、43.0、4.3 fg/μL和430.0、43.0 ag/μL共8個梯度的DNA稀釋液，分別利用原始反應體系（表1）及優(yōu)化后的反應體系進行擴增，確定優(yōu)化前后反應體系的檢測限，從而確定該程序是否優(yōu)化。

2 結果與分析

通用型沙門氏菌程序優(yōu)化采用腸炎沙門氏菌標準菌株（CVCC3762）和雞白痢沙門氏菌標準菌株（CVCC533）；雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌程序優(yōu)化采用雞白痢沙門氏菌標準菌株（CVCC533）；腸炎沙門氏菌程序優(yōu)化采用腸炎沙門氏菌標準菌株（CVCC3762）。

2.1 退火溫度的優(yōu)化

通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌程序均按照材料與方法1.3.1中設計的退火溫度進行擴增，結果如圖1所示。

圖1 沙門氏菌退火溫度優(yōu)化結果

雞白痢沙門氏菌退火溫度在45.6～64.1 ℃范圍內均可以擴增出目的條帶（圖1 D），雞白痢傷寒沙門氏菌在46.6～63.1 ℃范圍內可擴增出目的條帶（圖1 E），通用型沙門氏菌在45.6～57.7 ℃、腸炎沙門氏菌在46.6～58.7 ℃范圍內可擴增出目的條帶（圖1 A～C）。其中通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌的退火溫度分別為52.4、52.4 ℃和53.4 ℃時，目標條帶相對清晰；腸炎沙門氏菌在50.8 ℃時目標條帶相對清晰，因此分別選擇50.8、52.4、52.4℃和53.4℃作為腸炎沙門氏菌、通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌引物的最適退火溫度進行后續(xù)試驗。

2.2 引物濃度的優(yōu)化

在確定最佳退火溫度的基礎上，分別設計0.2、0.4、0.6 μM和0.8 μM共4個不同濃度梯度的引物進行擴增反應，確定其最佳引物濃度，結果如圖2所示。

圖2 沙門氏菌引物濃度優(yōu)化結果

通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌引物濃度在0.2～0.8 μM時擴增結果均為陽性，相對而言，引物濃度在0.4～0.8μM范圍內，通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌（圖2 A，B，D，E）擴增條帶均最為明顯，而腸炎沙門氏菌的引物濃度在0.6～0.8 μM范圍內擴增條帶最為明顯，因此在后續(xù)試驗中通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌引物濃度均選擇0.4 μM、腸炎沙門氏菌引物濃度選擇0.6 μM作為最適引物濃度。

2.3 擴增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

按照確定的最佳退火溫度及引物濃度，將反應體系分別擴增25、30個和35 個循環(huán)，結果如圖3所示。其中通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌循環(huán)數(shù)為25～35，腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌擴增循環(huán)數(shù)為30～35時擴增產物條帶較為清晰，因此本試驗分別將通用型沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌的最佳擴增循環(huán)數(shù)定為25、35、30和35進行后續(xù)試驗。

圖3 沙門氏菌擴增循環(huán)數(shù)優(yōu)化結果

2.4 檢測限

沙門氏菌檢測程序優(yōu)化前后檢測限見圖4。

圖4 沙門氏菌檢測程序優(yōu)化優(yōu)化前后檢測限

通用型沙門氏菌和3種血清型沙門氏菌PCR檢測方法優(yōu)化后，除雞白痢沙門氏菌外，通用型沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌檢測靈敏度均提高。程序優(yōu)化前，通用型沙門氏菌檢測限為43.0～430.0 pg/μL，優(yōu)化后通用型沙門氏菌檢測限為43.0～430.0 fg/μL。腸炎沙門氏菌優(yōu)化前檢測限為43.0 pg/μL，優(yōu)化后為4.3 pg/μL。雞白痢沙門氏菌優(yōu)化前后檢測限無變化，均為430.0 fg/μL。雞白痢傷寒沙門氏菌優(yōu)化前后檢測限分別為4.3 pg/μL 和43 fg/μL。

3 討論

雞白痢和禽傷寒沙門氏菌不僅可以通過水平傳播給同批次雞群，還可以通過垂直傳播傳遞給下一代，通常會造成雞群高死亡率、產蛋率下降等，給家禽產業(yè)造成巨大的經濟損失。而腸炎沙門氏菌不僅導致家禽發(fā)病，同時存在于家禽肉蛋等食品中，進而導致人類發(fā)生食物中毒。因此雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的及時檢出對于雞群和人類的安全是至關重要的。然而目前用于檢測雞白痢和腸炎沙門氏菌的方法不僅耗費時間長，對于檢測樣品也有局限性。研究表明，以核酸為基礎的PCR檢測方法比傳統(tǒng)檢測方法更加快捷、準確且操作方便。以核酸為基礎的PCR檢測方法有普通PCR法和熒光定量PCR法，然而熒光定量PCR法對操作人員、操作環(huán)境及設備要求較高、試劑成本昂貴，并不適用于所有機構。因此普通PCR仍是目前快速、準確檢測病原的一種主流方式。

目前，對于通用型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的檢測靶基因有inv A、stn、ompA、ompC、glgC、tcpS、sdf I和SEN1392等。在PCR反應體系中，基于靶基因設計的引物的退火溫度、引物濃度和循環(huán)數(shù)是至關重要的。退火溫度一般低于引物Tm值5 ℃，約在50～65 ℃范圍內。退火溫度太高會影響引物的結合效率，太低會增加引物二聚體和非特異性產物的形成，導致特異性降低。引物濃度需選擇適宜的濃度，盡可能使反應特異性和擴增效率達到最高。循環(huán)數(shù)要足夠，避免出現(xiàn)假陰性的情況。任何一個針對靶基因設計的引物序列是不同的，其退火溫度、引物濃度和循環(huán)數(shù)也應隨之變化。前人研究中通常使用的引物退火溫度為55～60 ℃，引物濃度為0.4 μM，循環(huán)數(shù)為30，然而此程序是否是引物的最佳擴增程序尚不知道。本研究發(fā)現(xiàn)針對不同的引物，其退火溫度是不同的；與原先程序及文獻中報道的各引物退火溫度相比，本研究中最佳退火溫度均降低3～6 ℃；引物濃度變化較小，只有腸炎沙門氏菌引物濃度增加至0.6 μM；對于循環(huán)數(shù)，除通用型沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌外，其它引物循環(huán)數(shù)均增加了5個。退火溫度、循環(huán)數(shù)等的變化可能與儀器品牌有關。由此說明，對于每一種引物，應對其退火溫度、引物濃度及循環(huán)數(shù)進行探討，以確保檢測結果的靈敏度。

經過優(yōu)化后，除雞白痢沙門氏菌外，其它沙門 氏 菌PCR檢 測 限 降 至4.3 pg/μL～430.0 fg/μL，提升了10～1 000倍。其中優(yōu)化后通用型沙門氏菌檢測限改善最大，提升了1 000倍。楊林等發(fā)現(xiàn)利用相同的引物通過多重PCR法檢測腸炎沙門氏菌檢測限為162.0 pg/μL，雞白痢傷寒沙門氏菌檢出限為214.0 pg/μL，其檢測限均在100.0 pg/μL以上。本研究中腸炎和雞白痢傷寒沙門氏菌檢測限分別為43.0 pg/μL和430.0 fg/μL，遠超過前人研究，說明本研究中腸炎沙門氏菌和雞白痢傷寒沙門氏菌程序優(yōu)化效果明顯。本研究中雞白痢沙門氏菌在優(yōu)化前后退火溫度、引物濃度及循環(huán)數(shù)變化較小，其檢測限無明顯變化。張童利等人優(yōu)化以SEEP9120_017695基因設計的雞白痢沙門氏菌引物，其檢測限為2.13 pg/μL。本研究中雞白痢沙門氏菌檢測限為4.3 pg/μL，與張童利等人的結果無明顯差異，說明雞白痢沙門氏菌引物程序無明顯變化。但本研究中雞白痢沙門氏菌循環(huán)數(shù)為30時即可達到檢測限，與傳統(tǒng)35個循環(huán)相比，大大節(jié)約了檢測時間。

綜上所述，對于各種引物，應根據自身實驗設備、條件和需求進行程序優(yōu)化，以便提高檢測靈敏度。本研究中，沙門氏菌PCR檢測方法優(yōu)化后，3種血清型及1種通用型沙門氏菌的檢測限均降低，檢測靈敏度大大升高，為后期環(huán)境、飼料及病料中多種沙門氏菌的及時檢出奠定了基礎。