子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織淋巴增強結(jié)合因子1、β-連環(huán)素表達及臨床意義

黃先華 劉 婷 王 青

湖北省宜昌市夷陵區(qū)婦幼保健院(443000)

子宮腺肌病是育齡婦女常見病，子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體侵入子宮肌層生長，同時伴有周圍平滑肌細(xì)胞代償性增生及肥大[1]。可降低女性生育能力，嚴(yán)重危害婦女生殖健康及生活質(zhì)量[2]。因此，尋找子宮腺肌病發(fā)病相關(guān)因子，探尋其發(fā)病機制，進而制定有效治療方案成為臨床需要。淋巴增強結(jié)合因子1(LEF1)在多種癌癥中異常表達，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。Matt等[4]研究表明，LEF1過表達與子宮內(nèi)膜癌前腺體有關(guān)。β-連環(huán)素(β-catenin)是一種轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，作為Wnt/β-catenin信號通路中的核心分子，可能在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮重要作用[5]。LEF1、β-catenin雖均與子宮內(nèi)膜病變有關(guān)，但二者在子宮腺肌病中的作用有待進一步探究。因此，本研究通過探究子宮腺肌病患者在位、異位內(nèi)膜組織中LEF1、β-catenin的表達及與臨床特征關(guān)系，為子宮腺肌病發(fā)病機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月-2020年3月因子宮腺肌病于本院就診并行子宮切除術(shù)(切除時間均為月經(jīng)結(jié)束后10天)的89例患者為研究對象，收集患者痛經(jīng)、月經(jīng)量、子宮病灶大小等臨床資料，以內(nèi)膜組織在位或異位分為在位內(nèi)膜組與異位內(nèi)膜組；同期宮頸原位癌患者86例正常子宮內(nèi)膜組織作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合子宮腺肌病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且經(jīng)術(shù)后病理證實；②術(shù)前1個月內(nèi)未接受激素類藥物治療；③臨床資料完整；④無肝臟疾病、糖尿病及惡性腫瘤；⑤符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，受試對象均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在內(nèi)分泌及免疫代謝性疾病；②伴有急性炎癥；③生殖器官發(fā)育不良。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海振譽生物科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(北京百奧創(chuàng)新科技有限公司)；Rox reference dye(南京北魚生物科技有限公司)；免疫組化試劑盒(德國Roche公司)；LEF1抗體(購自武漢菲恩生物科技有限公司)；β-catenin抗體(武漢益普生物科技有限公司)。qRT-PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 研究方法

1.3.1樣品采集及保存行子宮切除術(shù)時取子宮腺肌病患者在位、異位內(nèi)膜組織以及宮頸原位癌患者正常子宮內(nèi)膜組織后立即處理，所有組織標(biāo)本均采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，置-80℃保存待測。

1.3.2內(nèi)膜組織LEF1 mRNA、β-catenin mRNA檢測采用RNA提取試劑盒提取內(nèi)膜組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀對目的基因LEF1、β-catenin和內(nèi)參GAPDH進行擴增。反應(yīng)體系共10 μl：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，ddH2O 3.0 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，引物由上海生工生物工程公司設(shè)計并合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。樣品重復(fù)3次，采用2-△△CT法對LEF1 mRNA、β-catenin mRNA表達水平進行相對定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3內(nèi)膜組織LEF1、β-catenin蛋白檢測采用免疫組織化學(xué)法檢測內(nèi)膜組織LEF1、β-catenin蛋白表達情況。10%甲醛固定標(biāo)本后，梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(4 μm)。依據(jù)免疫組化試劑盒常規(guī)操作(一抗為LEF1、β-catenin抗體)，對組織切片染色，隨機選5個高倍鏡視野觀察，采取半定量法評分，按染色強度計分：棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，無色0分；按照陽性細(xì)胞率計分，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≥76%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，≤5%為0分。將兩項得分相乘，總分<5分為陰性(-)，≥5分為陽性(+)。每張切片分別由2名病理科醫(yī)師判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LEF1 mRNA、β-catenin mRNA表達水平

子宮腺肌病組患者年齡(45.8±4.7)歲(31～50歲)，對照組患者年齡(44.6±5.0)歲(31～50歲)，兩組患者年齡比較無差異(P>0.05)。子宮腺肌病患者中， LEF1 mRNA、β-catenin mRNA表達水平異位內(nèi)膜組最高、在位內(nèi)膜組居中、對照組最低(P<0.05)。見表2。

表2 各組LEF1 mRNA、β-catenin mRNA表達水平比較

2.2 LEF1、β-catenin蛋白表達情況

LEF1、β-catenin蛋白陽性表達率異位內(nèi)膜組最高、在位內(nèi)膜組居中、對照組最低(P<0.05)。見表3、圖1(1542頁)、圖2(1542頁)。

表3 各組LEF1、β-catenin蛋白陽性表達比較[%(例)]

2.3 不同內(nèi)膜組織LEF1 mRNA與β-catenin mRNA表達水平相關(guān)性

子宮腺肌病患者在位、異位內(nèi)膜組織LEF1 mRNA與β-catenin mRNA表達水平均呈正相關(guān)(r=0.475、0.658，P<0.05)；對照組內(nèi)膜組織LEF1 mRNA與β-catenin mRNA表達水平無相關(guān)性(r=0.151，P>0.05)。見圖3(1542頁)、圖4(1542頁)、圖5(1542頁)。

2.4 子宮腺肌病不同內(nèi)膜組織LEF1、β-catenin蛋白表達與臨床特征關(guān)系

根據(jù)子宮腺肌病患者在位或異位內(nèi)膜組織LEF1、β-catenin蛋白陽性表達情況，將其分為LEF1陽性表達組、LEF1陰性表達組及β-catenin陽性表達組、β-catenin陰性表達組。結(jié)果顯示，在位、異位內(nèi)膜組織中LEF1、β-catenin蛋白表達水平與其患者月經(jīng)量、痛經(jīng)無關(guān)(P>0.05)；LEF1、β-catenin陽性表達組與陰性表達組患者的子宮大小/腺肌病灶比較有差異(P<0.05)。見表4、表5。

表4 子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織蛋白表達與臨床特征關(guān)系[例(%)]

表5 子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織蛋白表達與臨床特征關(guān)系[例(%)]

3 討論

子宮腺肌病的發(fā)病率近年來有上升趨勢，其主要臨床癥狀有月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)及不孕等[7]。目前國內(nèi)外研究學(xué)者從遺傳學(xué)、免疫學(xué)、流行病學(xué)等各角度對子宮腺肌病進行研究，但因其發(fā)生發(fā)展涉及孕產(chǎn)史、宮腔操作史、細(xì)胞凋亡、性激素以及血管生成等多方面因素，因此目前子宮腺肌病發(fā)病機制仍不十分明確[8]。目前研究表明，子宮腺肌病臨床癥狀的嚴(yán)重程度與異位病灶的滲透深度有關(guān)，而異位病灶的滲透又與周圍血管的建立及擴展有關(guān)[9]。因此，探究異位病灶內(nèi)血管生成相關(guān)調(diào)控因子，可能對子宮腺肌病的研究有重要意義。

LEF1是T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子家族成員，屬于Wnt/β-catenin信號通路下游效應(yīng)分子之一[10]。LEF1有雙向調(diào)節(jié)功能，一方面能與β-catenin結(jié)合后形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，參與活化Wnt信號通路下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄過程；另一方面可募集協(xié)同抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄的執(zhí)行[11]。朱小琳等[12]研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活后，通過活化其下游相關(guān)靶基因表達，促使細(xì)胞生長和分化，進而促進異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲、黏附和血管生成，參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。另有研究表明，LEF1在造血干細(xì)胞的維持、增殖及分化等方面發(fā)揮較重要作用，進而參與造血調(diào)控及血管新生[13]。本研究結(jié)果顯示，子宮腺肌病患者的異位內(nèi)膜組織中LEF1、β-catenin mRNA表達水平及蛋白陽性表達率均高于在位內(nèi)膜組織和對照組，且在位、異位內(nèi)膜組織LEF1 mRNA與β-catenin mRNA表達水平均呈正相關(guān)。提示LEF1、β-catenin高表達可能參與了異位病灶的發(fā)生發(fā)展，推測患者處于病理狀態(tài)時Wnt/β-catenin信號通路被活化，β-catenin降解減少，異位內(nèi)膜組織中β-catenin表達量增多，β-catenin與下游轉(zhuǎn)錄因子LEF1結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，發(fā)揮調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的作用，進一步參與血管新生。

白冀蓉[14]及Li等[15]研究表明，子宮腺肌病患者多出現(xiàn)痛經(jīng)及月經(jīng)量增多等臨床癥狀。有研究證實，子宮腺肌病患者月經(jīng)量增多是由于子宮內(nèi)膜功能層毛細(xì)血管面積及數(shù)量增多，痛經(jīng)是由于異位病灶內(nèi)血管增多后使得異位病灶進一步侵入和擴展[16-17]。本研究結(jié)果顯示，LEF1、β-catenin表達與痛經(jīng)及月經(jīng)量增多無關(guān)，可能與本研究納入患者量少及不同地區(qū)差異有關(guān)，需進一步豐富樣本量驗證。此外，本研究中LEF1、β-catenin表達與子宮大小/腺肌病灶有關(guān)。提示LEF1、β-catenin高表達與子宮體積增大及異位病灶擴展有關(guān)，推測LEF1、β-catenin表達量增多后可能參與了患者血管新生，而異位病灶內(nèi)血管增多會進一步促進異位病灶的侵入和擴展。

綜上所述，LEF1、β-catenin在子宮腺肌病患者在位、異位內(nèi)膜組織中表達水平均高于正常子宮內(nèi)膜組織，且在異位內(nèi)膜組織中變化更為顯著，二者可能以不同的方式協(xié)同促進子宮腺肌病病情發(fā)生發(fā)展。有望LEF1、β-catenin成為一組有潛力的子宮腺肌病診斷標(biāo)志物，但本研究結(jié)果可能因為樣本量及所選樣本地區(qū)而存在一定差異，尚需結(jié)合細(xì)胞分子實驗及動物實驗進一步深入分析。