孕中期超聲軟指標(biāo)聯(lián)合無創(chuàng)基因檢測在胎兒染色體異常診斷中的應(yīng)用

杜秀鳳，史淑瓊，陳淑芬，宋春林，羅潤環(huán)

（佛山市婦幼保健院，廣東 佛山 528000）

出生缺陷是導(dǎo)致新生兒殘疾、死亡的主要因素，我國每年約有80 ～100 萬有缺陷的新生兒出生，這一直是國家和社會非常重視的公共衛(wèi)生問題。產(chǎn)前診斷是保證優(yōu)生優(yōu)育的重要措施。產(chǎn)前超聲診斷具有圖像清晰、診斷準確、安全性高等優(yōu)點，是產(chǎn)前診斷中極其重要的組成部分[1-3]。超聲軟指標(biāo)是指胎兒超聲檢查時發(fā)現(xiàn)的一些輕微病變或變異，可在染色體正常胎兒群體中發(fā)生，也可能導(dǎo)致胎兒發(fā)生明顯的先天性結(jié)構(gòu)畸形，其與染色體異常有一定的關(guān)聯(lián)，常被用于胎兒染色體非整倍體的篩查[4-7]。筆者選取286 例超聲發(fā)現(xiàn)孤立性軟指標(biāo)陽性的孕婦進行研究，旨在探討孕中期超聲軟指標(biāo)聯(lián)合無創(chuàng)基因檢測在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在佛山市婦幼保健院產(chǎn)科門診接受常規(guī)產(chǎn)檢的孕婦5617 例，從中篩選出286 例孤立性超聲軟指標(biāo)陽性孕婦，其年齡為18 ～34 歲，孕周為17+2 ～24+5 周。其納入標(biāo)準是：1）單胎妊娠；2）唐氏篩查低風(fēng)險；3）超聲軟指標(biāo)異常，具體包括：胎兒鼻骨發(fā)育不良或缺失、脈絡(luò)叢囊腫、腸管回聲增強、腎盂增寬、單臍動脈、心臟內(nèi)強回聲光點、股骨短小、右鎖骨下動脈狹窄。其排除標(biāo)準是：1）高齡妊娠；2）超聲發(fā)現(xiàn)明確的胎兒先天性結(jié)構(gòu)畸形；3）存在惡性腫瘤；4）近1 年內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、異體細胞治療；5）其本人和（或）其丈夫存在染色體異常。

1.2 方法

對這些產(chǎn)前超聲篩查顯示超聲軟指標(biāo)陽性的孕婦進行無創(chuàng)基因檢測，對其中存在無創(chuàng)基因高風(fēng)險的孕婦再進一步進行羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷。進行產(chǎn)前超聲篩查的方法是：采用三星WS80A 彩色多普勒超聲診斷儀和GE E8 彩色多普勒超聲診斷儀對孕婦的胎兒進行檢查。檢查前讓孕婦排空膀胱，檢查內(nèi)容包括以下幾個方面：1）顏面部：觀察眼及眼眶、鼻唇；2）頭部：觀察顱骨結(jié)構(gòu)、側(cè)腦室、丘腦、小腦、后顱窩池、脈絡(luò)從等；3）心臟：觀察四腔心結(jié)構(gòu)、左右房室的連接關(guān)系、心室與大動脈的連接關(guān)系；4）脊椎：觀察脊柱的連續(xù)性、彎曲度、骨化程度；5）腹部：觀察胃、肝、腎、膀胱等；6）四肢切面：觀察四肢長骨、手足姿勢等。鼻骨發(fā)育不良或缺失的判定標(biāo)準是：胎兒面部正中的矢狀面、冠狀面和橫切面均不能顯示鼻骨或標(biāo)準切面下鼻骨的長度小于同孕周胎兒的第2.5百分位數(shù)。脈絡(luò)叢囊腫的判定標(biāo)準是：超聲顯示脈絡(luò)叢內(nèi)存在薄壁囊腫。腎盂增寬的判定標(biāo)準是：超聲顯示腎盂分離≥4mm 且＜10mm。單臍動脈的判定標(biāo)準是：臍帶橫切面見一大一小圓形無回聲結(jié)構(gòu)（呈“呂”字形）。心臟內(nèi)強回聲光點的判定標(biāo)準是：在標(biāo)準四腔心平面、心室乳頭肌區(qū)域出現(xiàn)強回聲。股骨短?。汗晒情L度小于同孕周胎兒的第5 百分位數(shù)。右鎖骨下動脈狹窄的判定標(biāo)準是：弓動脈和右側(cè)背主動脈近段異常消失，右鎖骨下動脈異常狹窄。進行無創(chuàng)基因檢測的方法是：采集孕婦的外周血10mL，提取血漿DNA。將帶有序列標(biāo)簽的接頭引物用于構(gòu)建血漿DNA文庫，利用illumina NextSeq CN500 測序平臺進行大規(guī)模的并行基因組測序。對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，獲取胎兒染色體信息，計算Z值（正常范圍為＞-3且＜3），從而得出13/18/21 三體染色體非整體倍的發(fā)生風(fēng)險。進行染色體核型分析的方法是：在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取20 mL羊水送細胞實驗室接種、培養(yǎng)，加秋水仙胺后收獲細胞。對收獲集得細胞進行低滲、固定、制片處理，用G 顯帶染色，在光學(xué)顯微鏡下分析、計數(shù)核型。進行染色體拷貝數(shù)變異檢測的方法是：從羊水中提取微量(50 ～100ng)基因組DNA，采用超聲法將大片段DNA 打碎，通過末端標(biāo)記、接頭連接和PCR 擴增等方法來進行DNA 文庫的構(gòu)建。使用illuminaNextSeq CN500 測序平臺對樣品DNA 進行大規(guī)模平行測序，對測序結(jié)果進行生物信息分析，并將其與公共數(shù)據(jù)庫（OMIM、DGV、DECIPHER、UCSC 和Pubmed）進行比對。將染色體拷貝數(shù)變異分為以下三類：致病、可能致病和致病性未知。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

研究資料的收集與分析分別采用Epi Data 3.1 軟件和SPSS 21.0 軟件進行，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 286 例超聲軟指標(biāo)陽性孕婦超聲軟指標(biāo)的檢出情況

286 例超聲軟指標(biāo)陽性孕婦各項超聲軟指標(biāo)檢出率的高低次序（從高到低）是：脈絡(luò)從囊腫＞單臍動脈＞腎盂增寬＞心臟內(nèi)強回聲光點＞鼻骨發(fā)育不良或缺失＞右鎖骨下動脈狹窄＞腸管回聲增強＞股骨短小。其脈絡(luò)叢囊腫的檢出率〔24.8%（71/286）〕及單臍動脈的檢出率〔21.7%（62/286）〕均顯著高于股骨短小的檢出率〔2.8%（8/286）〕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 286 例孕婦的染色體檢測結(jié)果

對286 例超聲軟指標(biāo)陽性孕婦進行無創(chuàng)基因檢測的結(jié)果顯示，其中有21 三體高風(fēng)險孕婦11 例，18三體高風(fēng)險孕婦2 例，13 三體高風(fēng)險孕婦1 例，其他染色體高風(fēng)險孕婦7 例。詳見表2。21 例無創(chuàng)高風(fēng)險孕婦經(jīng)遺傳咨詢后均選擇行羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷，檢測項目包括染色體核型分析及染色體拷貝數(shù)變異 檢 測（Copy number variation sequencing，CNVseq）。檢測共發(fā)現(xiàn)18 例染色體拷貝數(shù)變異，陽性率為6.3%(18/286)， 具 體 包 括：11 例47,XN,+21、1例47,XN,+18、1 例47,XN,+13、1 例47,XXX、2 例47,XXY、1 例47,XYY、1 例22q11.21 缺失3.04Mb。

表2 不同超聲軟指標(biāo)陽性孕婦的染色體檢測結(jié)果（例）

2.3 追蹤隨訪

進行追蹤隨訪的結(jié)果顯示，有18 例胎兒存在染色體異常。其中有21- 三體患兒11 例、18 三體患兒2 例（告知孕婦患兒有嚴重的智力低下、不同程度的發(fā)育畸形后其均選擇引產(chǎn)），13 三體患兒1 例（孕19周彩超提示脈絡(luò)叢囊腫，余未見明顯畸形，孕婦及家屬要求觀察，孕23 周彩超發(fā)現(xiàn)小下頜、雙腎實質(zhì)回聲增強、唇腭裂后選擇引產(chǎn)），22q11.21 微缺失綜合征患兒1 例（告知孕婦該綜合征患兒常見的癥狀和體征包括先天性心臟病、腭裂及其他特殊面容，可能有生長發(fā)育及智力發(fā)育遲緩，學(xué)習(xí)認知異常等，隨后其選擇引產(chǎn)），47,XXY 患兒2 例（告知孕婦患兒可能會出現(xiàn)無精癥、無生育能力等情況后，其選擇引產(chǎn)），47,XXX 患兒1 例，47,XYY 患兒1 例。由于47,XXX患兒、47,XYY 患兒一般有生育能力，且智力尚可，孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，新生兒隨訪暫未發(fā)現(xiàn)異常。

3 討論

出生缺陷是指嬰兒出生前發(fā)生的軀體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，不但嚴重影響兒童的身心健康和我國的人口素質(zhì)，還會給很多家庭帶來經(jīng)濟和心理上的雙重負擔(dān)及壓力，影響家庭幸福和社會和諧。預(yù)防出生缺陷，最重要的就是做好孕期保健。超聲檢查的無創(chuàng)性、準確性及可重復(fù)性使其成為產(chǎn)前篩查及孕期保健最重要的手段之一。孕中期超聲軟指標(biāo)主要有：脈絡(luò)叢囊腫、單臍動脈、腎盂增寬、心臟內(nèi)強回聲光點、鼻骨發(fā)育不良或缺失、右鎖骨下動脈狹窄、腸管回聲增強和股骨短小等[8-9]。任何篩查技術(shù)都有其局限性,產(chǎn)前超聲也不例外。因為超聲篩查會受到羊水量、胎兒體位、多胎妊娠、孕婦肥胖、腹壁瘢痕或水腫等因素的影響，即使最好的醫(yī)生使用最先進的設(shè)備也不能確保發(fā)現(xiàn)所有的胎兒畸形，且當(dāng)前的超聲檢查結(jié)果也不能確保胎兒以后的發(fā)育不會改變。《產(chǎn)前超聲檢查指南（2012）》[10]中指出，臨床超聲醫(yī)生除需對胎兒大小及衛(wèi)生部規(guī)定的六大類致死性畸形進行篩查之外，還要對胎兒主要解剖結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)觀察，對嚴重先天性結(jié)構(gòu)畸形進行系統(tǒng)篩查。郭芬芬等[11]對2922 例單一超聲軟指標(biāo)陽性胎兒進行研究發(fā)現(xiàn)，鼻骨發(fā)育不良胎兒染色體的異常率為13.8%。這與本研究中鼻骨發(fā)育缺失或不良胎兒染色體的異常率〔15.6%（5/32）〕相近。提取孕婦外周血中胎兒的游離DNA，采用基于高通量測序技術(shù)的無創(chuàng)基因檢測技術(shù)（Noninvasive prenatal genetic testing，NIPT）可檢測胎兒21 三體、18 三體、13 三體綜合征。該檢測與傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查相比有著更高的準確性及更低的假陽性率[12]。史淑瓊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NIPT 對13/18/21 三體及性染色體的檢出率均可達100%，假陽性率分別是0.06%、0.08%、0.04%和0.30%。王亞男等[14]分析了780 例高危孕婦的NIPT-plus 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)21- 三體、18- 三體和性染色體非整倍體的檢出率分別為100%、100% 和60%。無創(chuàng)基因檢測具有無創(chuàng)、快速、準確率高、特異性好等優(yōu)點，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷帶來了新的希望。本研究將超聲軟指標(biāo)與無創(chuàng)基因檢測結(jié)合起來綜合評估胎兒染色體非整倍體的發(fā)生風(fēng)險，發(fā)現(xiàn)孤立性軟指標(biāo)異常的檢出率為5.09 %，這與李秀蘭等[15]研究中孤立性軟指標(biāo)異常的檢出率（6.49%）相近。相關(guān)的研究表明，孕中期超聲軟指標(biāo)聯(lián)合無創(chuàng)基因檢測在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值較高[16-18]。

綜上所述，孕中期超聲軟指標(biāo)聯(lián)合無創(chuàng)基因檢測為產(chǎn)前篩查提供了新的思路與方案，既能提高孕婦篩查的參與度，降低有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷引起的流產(chǎn)、感染等風(fēng)險，又能增加染色體異常兒的檢出率，提高孕期嚴重出生缺陷的發(fā)現(xiàn)率，從而有利于減少殘疾新生兒的出生、提高出生人口素質(zhì)，有利于促進家庭幸福和社會和諧發(fā)展。