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    刺囊酸在不同種屬肝微粒體中代謝消除和酶動力學(xué)的比較研究*

    2022-10-22 10:26:56朱高峰姜云芳
    廣州化工 2022年18期
    關(guān)鍵詞:微粒體比格槲皮素

    陳 瑞,朱高峰,姜云芳

    (1 貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽 550004;2 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550004;3 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院,貴州 貴陽 550004)

    刺囊酸(Echinocysticacid, EA),外觀為一種白色針狀結(jié)晶,分子式為C30H48O4,化學(xué)式式名3β,16α-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸,是齊墩果烷型式為五環(huán)三萜類有機(jī)化合物。刺囊酸在自然資源非常豐富,廣泛分布于皂莢、豬牙皂、蒙自合歡等多種藥用植物中,材料也易于獲得,又有很高的藥用價值。研究表明,刺囊酸具有滋肝補(bǔ)血、涼血止血之功能,免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性、抗丙型肝炎病毒(HCV)、對治療糖尿病也有作用[1]、對人類免疫缺陷病毒有一定的抵抗性(HIV)[2]、還具有抵抗流感病毒[3-4]、抗腫瘤[5-6]等藥理活性。同時通過研究發(fā)現(xiàn)[7-9],刺囊酸能夠明顯的改善高血脂引起的氧化型低密度脂蛋白(OXLDL)的升高而導(dǎo)致對EPCs功能和作用的不利影響。刺囊酸是一個應(yīng)用、開發(fā)價值較高的天然化合物,值得進(jìn)一步的深入開發(fā)。

    圖1 刺囊酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of echinocystic acid

    就當(dāng)前來說,刺囊酸的藥理作用主要被應(yīng)用在抗HCV活性、抗腫瘤的活性,以及保護(hù)EPCs等方面,但是對其在生物體內(nèi)代謝的研究和利用還比較缺乏。刺囊酸尚存在活性位點(diǎn)較少、生物利用度較低等缺點(diǎn),通過肝微粒體實(shí)驗研究可以發(fā)現(xiàn)刺囊酸在人體肝微粒體中的吸收分布和代謝情況。

    藥物體外代謝的體內(nèi)外代謝情況的深入研究與其數(shù)據(jù)分析是具有一定程度相關(guān)性的。體外實(shí)驗研究很可能有效的用來幫助我們解釋這些臨床的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù),并且它們可以用于準(zhǔn)確評估這些藥物在人體內(nèi)潛在的代謝情況。通過的體外實(shí)驗研究,人們可以發(fā)現(xiàn)抗癌藥物在人體內(nèi)的主要細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)化途徑和主要代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,為臨床前沿的研究工作提供明確的研究方向,減少了實(shí)驗的盲目性;影響酶活性的因素有很多,之中主要有時間、溫度、蛋白質(zhì)量濃度、底物濃度等,實(shí)驗可以分別對每個因素進(jìn)行優(yōu)化[10]。酶動力學(xué)上的研究主要闡明了藥物在肝微粒體中發(fā)生代謝,提供了最佳代謝時間和最佳蛋白質(zhì)的濃度,這一點(diǎn)是關(guān)于藥物發(fā)生代謝反應(yīng)及其藥物代謝反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性研究的重要前提[12]。肝微粒體內(nèi)還含有很多種新的細(xì)胞代謝組分,包括了大量CYP450酶和少量II相關(guān)的代謝復(fù)合酶。由于肝微粒體藥物制備生產(chǎn)過程比較簡單方便、易于長期保存、重現(xiàn)穩(wěn)定性良好,肝微粒體被廣泛的研究應(yīng)用于治療藥物中的代謝分析和治療藥物之間綜合作用力的研究。劉文莉等[11]對于麝香柑內(nèi)酯在7種不同類型肝微粒體細(xì)胞中的實(shí)際代謝作用情況分別進(jìn)行了臨床研究結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)該內(nèi)酯化合物在比格犬、大鼠、人類等肝微粒體細(xì)胞中的實(shí)際代謝情況差異較為非常接近。因此筆者選用的是比格犬、大鼠、人肝微粒體來進(jìn)行實(shí)驗。

    鑒于此,本研究通過實(shí)驗比較不同物種肝微粒體中刺囊酸的代謝差異,并計算比較大鼠、比格犬和人肝微粒體中刺囊酸的半衰期和代謝消除速率。刺囊酸的體內(nèi)代謝研究為其后續(xù)藥效學(xué)研究和臨床藥學(xué)研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 儀 器

    LC-2040C 3D型高效液相色譜儀,日本島津公司;GENESPEED1730R冷凍高速離心機(jī),Gene Company Limited;JN300-2型氮?dú)獯祾邇x,蘇州吉米諾儀器有限公司;X1型高速離心機(jī),香港基因有限公司;KH-600E型超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;FA805N型十萬分之一電子天平,上海菁海儀器有限公司;DW-86L486型超低溫保存箱,海爾集團(tuán);HH-2型恒溫水浴鍋,上海邦西儀器科技有限公司。

    1.1.2 藥品與試劑

    刺囊酸對照品(純度:>99.0%,批號C28M3Q1),北京索萊寶科技有限公司;槲皮素(純度:≥98.0%,批號MB2127),北京索萊寶科技有限公司;SD雄性大鼠肝微粒體(批號M1007.20190003),武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;比格犬肝微粒體(批號M10003.20190002),武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;人肝微粒體(批號M10001.2019003),武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;葡萄糖-6-磷酸-二鈉(批號20211204),北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(批號1011L024),北京索萊寶科技有限公司;GB19298超純水,香港屈臣氏集團(tuán);乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純,檸檬酸鈉、氯化鎂等其余試劑均為實(shí)驗室常用規(guī)格或分析純。

    1.2 方 法

    1.2.1 刺囊酸和內(nèi)標(biāo)溶液的制備

    使用精密的儀器稱取刺囊酸適量,使用甲醇溶解,制備成濃度為1 mg/mL的刺囊酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液;同法配制濃度為 1 mg/mL的槲皮素貯備液,作為內(nèi)標(biāo)使用;將上述兩種溶液置于4 ℃冰箱中保存,備用。在使用前,需吸取一定刺囊酸儲備液,用適量的甲醇稀釋后,再使用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4,下同)稀釋至我們所需要的孵育濃度,為了使肝微粒體有活性,得保證體系中的有機(jī)溶劑的含量不超過1%[12-13],刺囊酸的濃度為40 μg/mL,用甲醇將槲皮素儲備液稀釋,得到濃度為10 μg/mL的槲皮素的內(nèi)標(biāo)溶液。

    1.2.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)輔酶溶液

    A液:按順序向試管中加入200 mg NADP-Na2、200 mg葡萄糖-6-磷酸-二鈉(G-6-P-Na2)和133 mg氯化鎂,用超純水定容至10 mL,在-20 ℃條件下保存。

    B液:依次加入檸檬酸鈉44 mg、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-P-DH)1000U,用蒸餾水定容至25 mL,載-20 ℃條件下保存。需要試用期前,取A、B液按體積5∶1混合的濃度1 mmol/L的NADPH輔酶溶液。

    1.2.3 樣品孵育與處理

    (1)孵育體系的建立

    取不同品種屬的肝微粒體(包括大鼠、比格犬、人肝微粒)各500 μL,用PBS 稀釋至0.5 g/L,隨后在體系中加入刺囊酸貯備液適量,使刺囊酸最終的濃度限制為40 μg/mL,同時還要注意孵化體系中的各種有機(jī)溶劑的含量不能超過1%。把上述溶液放在37 ℃水浴中,加入NADPH輔酶溶液作為啟動液將反應(yīng)啟動。同時還要確保了該體系的總體積濃度為200 μL,確保有機(jī)溶劑含量不超過1%。

    (2)樣品孵育與處理

    將上述孵育體系繼續(xù)置于37 ℃水浴中進(jìn)行孵育,分別于孵育0、5、10、15、30、45、60 min時,加入含內(nèi)標(biāo)槲皮素(4 μg/mL)的冰甲醇400 μL終止反應(yīng),渦旋混勻10 min,于4 ℃下以13000(×g)離心10 min,取上清液使用氮吹儀吹干,吹干后用甲醇100 μL復(fù)溶,再次渦旋混勻10 min,然后以 13000(×g)離心10 min,取上清液進(jìn)行HPLC分析,考察各時間點(diǎn)待測物的含量,每個孵育體系均需要平行操作3次。

    1.2.4 HPLC定量分析

    (1)HPLC色譜條件[14]

    色譜柱: waters xbridge aq C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);保護(hù)?。?water van guard C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣數(shù)據(jù): 20 μL;檢測的波長:215 nm。

    表1 流動相梯度Table 1 Mobile phase gradient

    1.3 刺囊酸在大鼠、比格犬、人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性

    分別通過0.1 mol/L PBS稀釋至0.5 mg/mL的大鼠、比格犬、人肝微粒體20 μL,加入刺囊酸并使其最終濃度為40 μg/mL將上述孵育體系繼續(xù)置于37 ℃水浴中進(jìn)行孵育,孵育時間為0、5、10、15、30、45、60 min,加入含有內(nèi)標(biāo)(10 μg/mL)的冰甲醇400 μL進(jìn)行終止,于4 ℃下以13000(×g)離心10 min,取上清液用氮吹儀吹干,吹干后用100 μL甲醇進(jìn)行復(fù)溶,再次渦旋混勻10 min,然后以 13000(×g)離心10 min,取上清液適量進(jìn)行HPLC分析,測量每個時間點(diǎn)中刺囊酸的濃度,該孵育體系中每個時間點(diǎn)需要平行操作3次。

    1.4 方法學(xué)考察

    1.4.1 專屬性

    取空白的體系孵育樣品,內(nèi)標(biāo)體系孵育EA和內(nèi)標(biāo)混合體系孵育樣進(jìn)行孵育,再按“1.2.3(2)”處理,最后進(jìn)行HPLC測定分析。

    1.4.2 線性關(guān)系的考察

    精密吸取“1.2.1”項下的刺囊酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別稀釋為1、2、5、10、20、40、80、100 μg/mL的系列濃度溶液;按“1.2.4(1)”項下的色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(μg/mL),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.4.3 精密度與準(zhǔn)確度

    配制刺囊酸定量下限濃度(40 μg/mL)樣品和中、高濃度(100、500 μg/mL)樣品各5份,按“1.2.3(2)”項下方法孵育15 min后處理,再按上訴色譜條件進(jìn)樣分析,日內(nèi)精密度;日間精密度需要連續(xù)測定考察3天,每組樣品均需要平行操作5次,得到5份數(shù)據(jù)。

    1.4.4 穩(wěn)定性考察

    精密吸取“1.2.1”項下的刺囊酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL,按“1.2.3(2)”項下方法孵育15 min并處理后,考察其室溫放置12 h、4 ℃冷藏12 h和反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。

    2 結(jié) 果

    2.1 方法學(xué)考察

    2.1.1 專屬性

    檢測峰形良好,且與肝微粒體中的內(nèi)源性物質(zhì)達(dá)到分離,證明該方法具有較好的專屬性。

    2.1.2 線性關(guān)系的考察

    通過已建立的方法進(jìn)行檢測,以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(μg/mL),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得其線性回歸方程為Y=5653.2x-1360.4,R2=0.9997。結(jié)果表明:刺囊酸在 1~100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性表現(xiàn)良好。

    圖3 空白肝微粒體樣品(A)、槲皮素加空白肝微粒體樣品(B)、刺囊酸加槲皮素加空白肝微粒體樣品(C)Fig.3 Blank liver microsome sample(A), quercetin plus blank liver microsome sample(B), escoic acid plus quercetin plus blank liver microsome sample(C)

    2.1.3 精密度與準(zhǔn)確度

    表2 精密度與準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Table 2 Results of accuracy and precision test

    經(jīng)過實(shí)驗測得,準(zhǔn)確度在 85%~115%以內(nèi),測得的日內(nèi)精密度RSD值<10.0%,日間精密度RSD值<15.0%,該結(jié)果符合規(guī)定見表4所示。

    2.1.4 穩(wěn)定性考察

    經(jīng)實(shí)驗測得,室溫放置12 h后的RSD為3.40%、4 ℃冷藏12 h后的RSD為2.88%、反復(fù)凍融3次后的RSD為9.83%,結(jié)果表明,測得值的RSD值均小于10%,表明其穩(wěn)定性良好。

    2.2 刺囊酸在大鼠、比格犬和人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性

    代謝穩(wěn)定性判定[15]:系統(tǒng)進(jìn)行體外酶動力學(xué)研究,獲得酶動力學(xué)參數(shù)半衰期(t1/2)和清除率(CLint),判定代謝穩(wěn)定性的依據(jù)半衰期,體外半衰期在30 min以下的表明受試代謝不穩(wěn)定;體外半衰期在30~90 min之間的受試物代謝穩(wěn)定性一般;體外半衰期大于90 min表明受試物代謝穩(wěn)定性好。以孵育0時的剩余濃度作為百分之百,其他孵育時間點(diǎn)的濃度轉(zhuǎn)換為底物剩余百分比,用GraphPad Prismv 7.0軟件繪制刺囊酸在不同屬種肝微粒體孵育體系中平均剩余百分比-時間曲線圖,并以各點(diǎn)的平均剩余時間百分比求取自然對數(shù)(y軸)與時間(x軸)計算進(jìn)行符合線性計算回歸的要求,得到的時間斜向比率約為k,據(jù)公式t1/2=-0.693/k可計算得到體外半衰期,CLint=(0.693/t1/2min)×(孵育液μL/肝微粒體mg)可計算固有清除率,結(jié)果見。

    表3 刺囊酸在不同種屬肝微粒體孵育結(jié)果(n=3)Table 3 Results of spiny acid incubation in liver microsomal in different species(n=3)

    圖2 刺囊酸在不同屬種肝微粒體孵育 體系中平均剩余百分比-時間曲線Fig.2 The average remaining percentage-time curve of echinocystic acid in liver microsome incubation system of different genera and species

    在使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作為主要啟動因子的肝微粒體孵育體系中,刺囊酸在3個種屬的肝微粒體中體外半衰期 t1 /2分別是SD大鼠(52.11 min),比格犬(268.70 min),人(258.29 min)。EA在肝微粒體中的 t1 /2依次為SD大鼠<人<比格犬,可初步判斷刺囊酸在SD大鼠的代謝穩(wěn)定性較差,與其在人和比格犬的肝微粒體代謝穩(wěn)定性相較存在較大的差異。

    3 結(jié) 論

    肝細(xì)胞內(nèi)還含有的肝微粒體,是藥物代謝及生物轉(zhuǎn)化的重要場所,內(nèi)含多種與過氧化氫有關(guān)的酶系,膽固醇合成酶系,類固醇,膽紅素和藥物結(jié)合酶系,以及與藥物代謝有關(guān)的酶系,可使脂溶性藥物代謝成水溶性藥物,經(jīng)腎臟排泄。肝微粒體受到損害時,藥物代謝發(fā)生障礙,藥物作用時間延長。肝微粒體體外培養(yǎng)試驗主要是利用從肝臟中提取出的肝微粒體在一種模擬人體生理狀態(tài)的環(huán)境條件下對其進(jìn)行體外的代謝反應(yīng),該試驗方法的優(yōu)點(diǎn)之一就是代謝反應(yīng)過程快,結(jié)果的重現(xiàn)性較好,便于對代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的確證研究中對代謝樣品的數(shù)據(jù)采集和分析積累,在實(shí)踐中可以得到普遍的運(yùn)用[13]。因此,為了今后刺囊酸的開發(fā)與利用,本研究刺囊酸在不同種屬肝微粒體中的代謝情況進(jìn)行了初步的研究和分析。

    3.1 HPLC條件的篩選

    在選擇高效液相的色譜流動相時,分別使用了甲醇和乙腈作為色譜流動相。實(shí)驗表明,相較于甲醇作為流動相乙腈能夠使得待測體成分具有較高的光敏度,且其色譜峰的峰形也更好,所以選用乙腈作為色譜流動相。通過不斷的調(diào)試和檢測,最終將流動相確定為水(含0.05%磷酸)-(乙腈)(70∶30V/V)。

    前期對吲哚美辛、川芎嗪、槲皮素等化合物作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行了實(shí)驗對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以為槲皮素內(nèi)標(biāo)時,與刺囊酸可與肝微粒體中的內(nèi)源性物質(zhì)達(dá)到分離,且能在這個流動相中有較好的峰形,使用槲皮素作為刺囊酸定量分析的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

    3.2 底物濃度的選擇

    在體外藥物新陳代謝毒理學(xué)的臨床研究中,受試所用藥物中的底物血液濃度盡量應(yīng)不要控制得過高,否則代謝清除率不能達(dá)到規(guī)定;另一方面,測量的底物濃度不能太低,否則這些底物就有會在極短的時間內(nèi)被人體徹底清除完整[14-15]。因此,本實(shí)驗前期考察了10、20、40、50 μg/mL等4項品種的濃度刺囊酸孵育現(xiàn)狀。結(jié)果表明,當(dāng)刺囊酸的濃度設(shè)置為40 μg/mL時,色譜峰形態(tài)最佳,因此底物刺囊酸的濃度設(shè)置為40 μg/mL。

    3.3 刺囊酸在不同種屬肝微粒體中的代謝比較

    本研究結(jié)果表明,經(jīng)過肝微粒體孵育后,刺囊酸在3個種屬的肝微粒體中體外可以消除的半衰期t1/2分別是SD大鼠(52.11 min),比格犬(268.70 min),人(258.29 min)。刺囊酸在肝微粒體中的t1/2依次為大鼠<人<比格犬,可初步判斷刺囊酸在大鼠中較差,與人和比格犬肝微粒體代謝穩(wěn)定性相比較起來,存在較明顯差異。代謝消除速率由小到大依次分別為比格犬(1.03 μL·min-1·mg-1)、人(1.07 μL·min-1·mg-1)、大鼠(5.31 μL·min-1·mg-1),表明此種化合物的水平在鼠體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性中等,在人和其他比格狗體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性較好。這就說明了大鼠和人之間的區(qū)別是有著一定的差別。肝臟作為研究藥物的代謝活動行為而發(fā)揮作用的主要生理器官,通過體外實(shí)驗人體代謝模擬與常用的實(shí)驗大鼠物種間存在一定差異,因此在選擇實(shí)驗動物時應(yīng)注意動物物種。

    綜上所述,本實(shí)驗參考文獻(xiàn)后建立了一種測定大鼠肝臟微粒體中EA濃度的高效液相色譜技術(shù)。這種方法操作簡單、迅捷、特殊、靈敏等,可以用來檢測肝微粒體孵育系統(tǒng)中刺囊酸的濃度。刺囊酸在大鼠、比格犬、人肝等微粒體中的代謝特征和所得的數(shù)據(jù),可以為其后續(xù)藥效學(xué)及臨床研究提供參考。

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