UPLC-MS/MS法測(cè)定豬肉及其制品中己烯雌酚殘留量

孫亞南，李媛

陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（西安 710048）

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是人工合成的非甾體雌性激素類藥物，因其能夠提高動(dòng)物日增重和減少脂肪、促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝合成、提高飼料轉(zhuǎn)化率、在動(dòng)物的促生長(zhǎng)和育肥方面具有較好效果，常被作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中[1-5]。然而，隨著己烯雌酚在動(dòng)物體內(nèi)的殘留累積，此類動(dòng)物源性食品被人食用后會(huì)對(duì)肝、腎等內(nèi)臟造成損害，破壞機(jī)體遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致基因突變[6]，對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境均會(huì)造成嚴(yán)重危害[7-8]。2019年12月27日，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第250號(hào)公告明確規(guī)定將己烯雌酚納入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單中[9]。己烯雌酚的檢測(cè)和監(jiān)控對(duì)于保障相關(guān)畜禽類食品質(zhì)量安全和人民生命健康具有重要意義。

已報(bào)道的有關(guān)動(dòng)物源性食品中己烯雌酚的分析檢測(cè)方法主要有LC法、LC-MS法、HPLC法、HPLC-MS和免疫分析法等檢測(cè)方法[5,10-14]。其中，HPLC在提高分析靈敏度、重現(xiàn)性及其廣適性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，故而成為科研工作者的首選。

試驗(yàn)以叔丁基甲醚為提取劑，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，建立豬肉中己烯雌酚的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，為豬肉及其制品中己烯雌酚的快速測(cè)定提供有效方案。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

豬肉樣品（市購(gòu)）；豬肉粉質(zhì)控樣（編號(hào)PKL04011305970B，廣州譜恩科學(xué)儀器有限公司）；己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[編號(hào)GBW（E）083491，北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院]；己烯雌酚-8氘代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（貨號(hào)CCAD300663，美國(guó)CATO公司）；甲醇、乙腈、正己烷、叔丁基甲醚（均為色譜純）；超純水（優(yōu)普系列超純水機(jī)制備）；Waters OasisTMHLB固相萃取柱（SPE柱，500 mg，6 mL，美國(guó)Waters公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

1260-6420高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀（美國(guó)Agilent Technologies公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合器（Scientific Industries公司）；FV64全自動(dòng)智能氮吹儀（得泰儀器科技有限公司）；氮?dú)獍l(fā)生器（Peak Scientific Instruments公司）；EXTRA全自動(dòng)SPE（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；BSA224S分析天平[賽多利斯科學(xué)（北京）公司]；H1750R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.01 g）勻漿后的豬肉樣品于50 mL聚丙烯帶蓋離心管中，加入100 μL的己烯雌酚-D8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 μg/mL），加6 mL叔丁基甲醚提取液，渦旋1 min，振蕩10 min，于-4 ℃，6 000 r/min離心5 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL聚丙烯帶蓋離心管中，向殘?jiān)屑尤? mL叔丁基甲醚，按上述過程重復(fù)提取1次，合并2次提取液并充分混勻后，于40 ℃全部氮吹至干，加入2 mL 80%乙腈溶液，渦旋30 s使殘留物復(fù)溶，加入5 mL正己烷，渦旋混勻后于3 000 r/min離心5 min，取下層溶液待凈化。空白試驗(yàn)除不加試樣外其余同上。

質(zhì)控樣提取過程：稱取0.5 g（精確到0.01 g）豬肉粉質(zhì)控樣，用1.5 mL水溶解復(fù)原，渦旋混勻，其余過程同上。

1.3.2 樣品凈化

SPE柱臨用前分別用3 mL叔丁基甲醚、3 mL甲醇和3 mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤(rùn)。將上述處理得到的下層待凈化提取液全部轉(zhuǎn)移至預(yù)處理過后的HLB固相萃取柱，以每3～4 s/滴的流速通過SPE柱，依次用甲醇-水（3∶7，V/V）、水、甲醇-2%氨水（1∶9，V/V）溶液各3 mL淋洗，棄去洗液，抽干。用7 mL甲醇-叔丁基甲基醚（1∶9，V/V）溶液洗脫，收集所有洗脫液，于40 ℃氮吹至干，準(zhǔn)確加入2 mL 80%乙腈溶液溶解殘余物，充分渦旋，過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用乙腈分別將己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其同位素內(nèi)標(biāo)己烯雌酚-D8配制成10 μg/mL的儲(chǔ)備液（-18 ℃保存），然后將儲(chǔ)備液用乙腈精確稀釋成1 μg/mL的中間液；分別準(zhǔn)確移取適量的儲(chǔ)備液和中間液至10 mL容量瓶中，加入50 μL/mL同位素內(nèi)標(biāo)（中間液1 μg/mL），用乙腈定容至刻度，配制的己烯雌酚質(zhì)量濃度依次為5，10，20，50，100，200，500和1 000 ng/mL，其中己烯雌酚-D8質(zhì)量濃度為50 ng/mL。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18型（2.1 mm× 100 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水；梯度洗脫程序：0～1.0 min、10% A，1.5～5.0 min、90% A，5.5～6.0 min、10% A；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式；毛細(xì)管電壓4.0 kV（ESI-）；碎裂電壓140 V；干燥氣溫度320 ℃；干燥氣流速13.0 L/min；霧化氣壓力206.9 kPa（30.0 psi）。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化

圖1為DES及其內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖譜（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度100 ng/mL、內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度20 ng/mL）?？梢钥闯鯠ES在該試驗(yàn)條件下具有較好的分離度且響應(yīng)值滿足信噪比要求，液相條件和質(zhì)譜條件均能滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)總離子流圖譜

2.1.1 前處理方法選擇

分別考察采用2種不同前處理方法對(duì)質(zhì)控樣品和空白樣品中添加水平為50 μg/kg（加標(biāo)1）及100 μg/kg（加標(biāo)2）的回收率情況，結(jié)果如圖2所示。方法1[15]是將樣品在乙酸鈉緩沖溶液中酶解后經(jīng)乙腈提取，無水硫酸鈉除水，經(jīng)QuEChERS吸附劑1凈化，濃縮復(fù)溶，因酶解過程耗時(shí)且提取凈化操作步驟繁瑣，增加己烯雌酚的損失，致使其回收率相對(duì)較低。方法2為試驗(yàn)中的處理方法，均質(zhì)樣品經(jīng)叔丁基甲醚振蕩提取，冷凍離心，經(jīng)正己烷除脂，SPE小柱凈化，大幅降低基質(zhì)效應(yīng)，該方法簡(jiǎn)單高效，提取效果良好，目標(biāo)物損失相對(duì)較少。試驗(yàn)方法回收率明顯高于方法1。

圖2 2種不同前處理方法的回收率對(duì)比

2.1.2 提取劑選擇

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于動(dòng)物源性食品中己烯雌酚的測(cè)定前處理方法主要采用乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等作為提取溶劑[16-18]。試驗(yàn)考察乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚對(duì)DES的提取效率。圖3為豬肉空白樣品、加標(biāo)樣品和豬肉粉質(zhì)控樣的MRM圖譜。結(jié)果表明：以乙腈作為提取劑的質(zhì)控樣品和加標(biāo)樣品未檢測(cè)到目標(biāo)物的特征峰；乙酸乙酯在提取DES的同時(shí)也萃取脂溶性雜質(zhì)，使得樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，導(dǎo)致后續(xù)凈化困難，回收率低；相較之下，叔丁基甲醚提取率良好，在三者中的回收率最高，質(zhì)控樣品和空白加標(biāo)試驗(yàn)的回收率均超過85%。故試驗(yàn)選擇叔丁基甲醚作為提取試劑。

圖3 空白豬肉樣品（A）、加標(biāo)豬肉樣品（B）（加標(biāo)量50.0 μg/kg）和豬肉粉質(zhì)控樣（C）的MRM圖

2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗(yàn)結(jié)果表明己烯雌酚在5～1 000 μg/kg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)與其質(zhì)譜響應(yīng)值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，其中：在5～100 μg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)的線性方程為y= 0.041 0+0.537 1x，R2=0.998 7；在100～1 000 μg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)的線性方程為y=0.027 4+1.543 4x，R2= 0.999 6。其中，x表示目標(biāo)待測(cè)物的相對(duì)濃度，y表示其對(duì)應(yīng)的相對(duì)響應(yīng)值。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

以己烯雌酚陰性豬肉樣品作為基質(zhì)，分別對(duì)10，50，100和500 μg/kg 4個(gè)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照上述試驗(yàn)過程進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，進(jìn)行7次平行測(cè)定，該方法的回收率在86.3%～107.6%，SRSD在2.6%～12.4%。在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過算術(shù)平均值的20%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過對(duì)樣品前處理改進(jìn)和儀器分析方法的優(yōu)化，采用叔丁基甲醚作為提取劑，建立特異性的分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)控樣品及空白加標(biāo)樣品中己烯雌酚的測(cè)定。相比于國(guó)內(nèi)通用的檢測(cè)方法，試驗(yàn)在滿足對(duì)回收率和精密度要求的前提下，不需要酶解過程，很大程度上簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，大幅縮短前處理時(shí)間，且內(nèi)標(biāo)損失相對(duì)較小，有效提高回收率。該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、回收率高、準(zhǔn)確性好、檢測(cè)成本低，為快速檢測(cè)動(dòng)物性食品中己烯雌酚提供有效的方法選擇。