特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的測定

楊濤，韋偉寧，原亞梅，陸業(yè)活，鄧愛婕，滕丕合

廣西弘山堂生物科技有限公司（南寧 530032）

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品（Food for Special Medical Purposes，F(xiàn)SMP）簡稱特醫(yī)食品，是指為了滿足進食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)人群對營養(yǎng)素或膳食的特殊需要，專門加工配制而成的配方食品[1]。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品分為全營養(yǎng)配方食品、特定全營養(yǎng)配方食品和非全營養(yǎng)配方食品，該類產(chǎn)品必須在醫(yī)生或臨床營養(yǎng)師指導(dǎo)下，單獨食用或與其他食品配合食用，其中特殊醫(yī)學(xué)全營養(yǎng)配方食品可作為單一營養(yǎng)來源滿足目標(biāo)人群的營養(yǎng)需求[2]。

亞油酸的學(xué)名是9, 12-十八碳二烯酸，其化學(xué)式為C18H32O2，為無色油狀液體，不溶于水，易溶于石油醚、甲苯等有機溶劑。由于人體無法合成亞油酸，必須通過食物額外補充或通過特定的前體物質(zhì)形成來維持正常的生理功能，被稱為人體必需脂肪酸[3]。膽固醇與亞油酸結(jié)合才能發(fā)揮正常的轉(zhuǎn)運功能，人體一旦缺乏就可能引發(fā)代謝障礙，演變成動脈粥樣硬化，從而引發(fā)心腦血管疾病[4]。α-亞麻酸為順9，順12，順15-十八碳三烯酸，化學(xué)式為C18H30O2，是ω-3系列的必需脂肪酸，必需從體外攝取[5]。人體一旦缺乏，就可能導(dǎo)致自身免疫力下降、疲勞等癥狀的發(fā)生，特別是嬰幼兒和青少年，如果在成長期間長期缺乏亞麻酸，會嚴(yán)重影響智力的正常發(fā)育[6]。

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29922—2013中規(guī)定適用于10歲以上人群的全營養(yǎng)配方食品中亞油酸的供能比應(yīng)不低于2.0%；α-亞麻酸供能比應(yīng)不低于0.5%，是特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中的必檢項目[1]。特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品成分復(fù)雜、組織狀態(tài)多樣、亞油酸和α-亞麻酸含量較低等因素都會給檢測帶來較大的難度，目前特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的含量測定方法也未見報道。此次研究擬建立特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中亞油酸和α-亞麻酸含量測定方法，為本產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供有力的保障，也為特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品行業(yè)提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞油酸甘油三脂（純度≥99.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；α-亞麻酸甘油三脂（純度≥ 99.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲苯（美國Fisher公司）；甲醇（美國Honeywell公司）；乙酰氯（德國Merck公司）；無水碳酸鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；有機微孔濾膜（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

試驗用特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品來源于本公司研發(fā)設(shè)計。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010 Pro氣相色譜儀（日本島津公司）；SPB-3全自動空氣源和SPH-300氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；MS3渦旋振蕩器（IKA公司）；DCY-12S水浴氮吹儀（紹興蘇珀儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（方科儀器常州有限公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）；H1850高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

亞油酸甘油三脂和α-亞麻酸甘油三脂混合儲備液：分別稱取亞油酸甘油三脂144.5 mg（精確到0.1 mg）和α-亞麻酸甘油三脂63.5 mg（精確到0.1 mg），用甲苯溶解，定容至10 mL的容量瓶中。于-10 ℃以下的冰箱中保存，有效期3個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別準(zhǔn)確吸取亞油酸甘油三脂和α-亞麻酸甘油三脂混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.05，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 mL，于15 mL干燥螺口玻璃管中，分別加入4.95，4.90，4.80，4.50，4.00和3.00 mL的甲苯。向試樣中加入10%乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮氣后，旋緊螺旋蓋。振蕩混合后于80±1 ℃水浴中放置2 h，期間每隔20 min取出振搖1次，水浴后取出冷卻至室溫。將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，分別用3 mL 6%的碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸鈉溶液于50 mL離心管中，混勻。以5 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)濾膜過濾后上機。

1.3.2 樣品處理

試樣測定液：稱取混合均勻的特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品試樣約0.5 g（精確到0.1 mg），于15 mL干燥的螺口玻璃管中，加入5.0 mL的甲苯，混合均勻后向試樣中加入10%的乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮氣后，旋緊螺旋蓋，振蕩混合后于80±1 ℃水浴中放置2 h，期間每隔20 min取出振搖1次，水浴后取出冷卻至室溫。將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，分別用3 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸鈉溶液于5 mL離心管中，混勻。以5 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)濾膜過濾后上機。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：島津SH-Rtx-Wax毛細管柱，長度30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.5 μm。進樣口溫度270 ℃，檢測器溫度280 ℃，柱溫控制采用程序升溫，130 ℃為起始溫度，以15 ℃/min升溫至180 ℃，持續(xù)5 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃，持續(xù)2 min，以4 ℃/min升溫至230 ℃，持續(xù)10.5 min。載氣為N2，尾吹氣流量30 mL/min，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min。進樣體積1 μL，分流比100∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理方法

對脂肪酸的含量進行測定時，首先需要提取樣品中的脂肪酸并進行甲酯化處理[7]。水解提取法是指樣品經(jīng)水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在堿性條件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯[8]；乙酰氯-甲醇法是指乙酰氯與甲醇反應(yīng)得到鹽酸-甲醇使其中的脂肪和游離脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，進行分離檢測[9]；酯交換法是指將油酯溶解在異辛烷中，加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化，反應(yīng)完全后，用硫酸氫鈉中和剩余氫氧化鉀，測定脂肪酸含量[10]。其中水解提取法過程繁雜、步驟較多、檢測周期長，不適合大量樣品的檢測；酯交換法中氫氧化鉀不能使樣品中游離的脂肪酸及其鹽甲酯化，適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂樣品；亞油酸和α-亞麻酸以包埋的形式添加到本樣品中，且水分含量為3.42%，乙酰氯-甲醇法適用于含水量小于5%的乳粉試樣，對脂肪酸以包埋形式添加的樣品有更好的提取效率，能很大程度上提高檢測分析的準(zhǔn)確度[11]。因此文章采用乙酰氯-甲醇法進行樣品的前處理，下圖1為亞油酸和α-亞麻酸混合對照氣相色譜圖，圖2為特殊醫(yī)學(xué)用途全營配方食品氣相色譜圖。該方法空白樣品無其他雜質(zhì)的干擾，亞油酸和α-亞麻酸的分離度達到8.21，均能滿足試驗要求。

圖1 亞油酸和α-亞麻酸混合對照氣相色譜圖

圖2 特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品樣品氣相色譜圖

2.2 線性范圍和定量限

將1.3.1小節(jié)中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按濃度由低到高的順序依次經(jīng)氣相色譜儀進行測定，以各組分的進樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.72～28.61 mg范圍內(nèi)亞油酸的回歸方程為Y=38 433.85X-36 830.88，R2= 0.996 3具有良好的線性關(guān)系，在0.31～12.56 mg范圍內(nèi)α-亞麻酸的回歸方程為Y=39 580.66X-15 560.57，R2=0.997 0呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。按1.3.2小節(jié)的方法處理樣品后，以信噪比法（S/N≥10）來確定該方法的定量限，其中亞油酸的定量限為4.62 mg/100 g，α-亞麻酸的定量限為3.84 mg/100 g。下圖3為亞油酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖4為α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3 亞油酸線性方程

圖4 α-亞麻酸線性方程

2.3 精密度

取特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品試樣約0.5 g，按照1.3.2小節(jié)中的方法處理，平行制備7份，亞油酸甲酯轉(zhuǎn)化為亞油酸的換算系數(shù)為0.956 7，α-亞麻酸甲酯轉(zhuǎn)化為α-亞麻酸的換算系數(shù)為0.956 4，通過計算，氣相色譜分析結(jié)果見下表1。亞油酸含量的平均值3.63 g/100 g，7份的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%；α-亞麻酸含量的平均值為0.37 g/100 g，7份的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16%。亞油酸和α-亞麻酸含量的比值接近10∶1，與試樣設(shè)計的理論比例一致，兩者的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，表明該方法試驗結(jié)果準(zhǔn)確，精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.4 回收率

將精密度試驗測得樣品亞油酸和α-亞麻酸的平均值作為樣品含量，設(shè)計50%，100%和150%三個水平的加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。亞油酸加標(biāo)：準(zhǔn)確稱取樣品約100 mg，在加入樣品的同時分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液0.1，0.2和0.3 mL每個水平平行制備3份，共9份，按1.3.2小節(jié)中的方法處理；α-亞麻酸加標(biāo)：準(zhǔn)確稱取樣品約500 mg，在加入樣品的同時分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液0.1，0.2和0.3 mL每個水平平行制備3份，共9份，按1.3.2小節(jié)中的方法處理。亞油酸的平均回收率為97.68%，9份的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.14%；α-亞麻酸的平均回收率為100.69%，9份的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.47%，均符合GB/T 27404—2008中附錄1關(guān)于回收率的要求，表明該方法準(zhǔn)確度良好[12]。表2為加標(biāo)回收率試驗結(jié)果。

表2 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)論

特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品作為長期單一營養(yǎng)來源時，能夠滿足目標(biāo)人群每日的營養(yǎng)需求，是臨床腸內(nèi)營養(yǎng)治療的重要組成部分，我國特醫(yī)食品行業(yè)還處于早期的起步階段，潛力巨大，是大健康領(lǐng)域的又一片藍海[13]。雖然國家對企業(yè)的研發(fā)能力、生產(chǎn)能力、檢驗?zāi)芰Φ犬a(chǎn)品注冊相關(guān)條件設(shè)置了較高的準(zhǔn)入門檻，但是也阻擋不了國內(nèi)越來越多的企業(yè)進入這一行業(yè)的熱情。亞油酸和α-亞麻酸都是人體必需脂肪酸，亞油酸在體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為花生四烯酸，對于形成細胞結(jié)構(gòu)、維持組織生理功能、合成磷脂等均具有重要作用[14]。α-亞麻酸在進入人體后在碳氫酶和碳鏈延長酶的作用下，在人體代謝中衍生為EPA和DHA等，有利于預(yù)防和治療外周動脈等相關(guān)疾病[15]。α-亞麻酸完全靠從飲食中攝取，若攝取不足可能會導(dǎo)致心力衰竭等疾病[16]。特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的供能比均有國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，屬于必檢項目，目前特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的含量測定方法也未見報道。試驗建立了氣相色譜法同時分離檢測特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的檢驗方法。亞油酸出峰時間為14.21 min，α-亞麻酸的出峰時間為15.36 min，空白樣品對檢測無干擾，兩者的分離度為8.21達到檢測要求。亞油酸、α-亞麻酸分別在0.72～28.61 mg（R2=0.996 3）、0.31～12.56 mg（R2=0.997 0）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，亞油酸的線性方程為Y=38 433.85X- 36 830.88，α-亞麻酸的線性方程為Y=39 580.66X- 15 560.57。以10倍的信噪比計算方法定量限，亞油酸的定量限為4.62 mg/100 g，α-亞麻酸的定量限為3.84 mg/100 g。平行制備7份樣品，樣品中亞油酸和α-亞麻酸的含量分別為3.63和0.37 g/100 g，含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.27%和1.16%。設(shè)計50%，100%和150%三個水平的加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個水平平行測定3次，亞油酸的平均回收率為97.68%，9份的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.14%，α-亞麻酸的平均回收率為100.69%，9份的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.47%。綜上所述，該方法基質(zhì)干擾小、操作易行、精密度高、準(zhǔn)確度好，適用于特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的測定，能為本產(chǎn)品質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。