離子色譜-電導法檢測液體乳中的硫氰酸根

鄒沫君

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

硫氰酸根為無色、易揮發(fā)、具有強烈氣味的酸性液體，有毒。其毒性主要由其在體內釋放的氰根離子而引起，氰根離子在體內能快速與細胞色素氧化酶中的三價鐵離子結合，抑制該酶活性，使組織不能利用氧，引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等腸道功能紊亂，血壓波動，心率減慢，重度中毒可致腎功能明顯損害，慢性毒性可抑制碘的運轉和甲狀腺激素合成，惡化碘缺乏癥[1-3]。自然界中也含有硫氰酸根，硫氰酸根被認為是哺乳動物血液中一種常見的電解質，在動物、人體組織和分泌物中都能檢測到，屬于防御系統(tǒng)的一部分，如在初乳和患乳房炎奶牛的乳中濃度較高，是對硫代糖苷（葡糖異硫氰酸鹽）和生氰糖苷脫毒處理的一種產(chǎn)物，因此牛乳中本身含有硫氰酸根[4-6]。有文獻研究發(fā)現(xiàn)加入微量的硫氰酸鹽和過氧化氫（分別約為12 mg/L和8.5 mg/L），會在牛奶中獲得較好抗菌的乳過氧化物酶（LP）體系活動，可作為一種牢靠的抑菌保鮮方法用于保存冷卻過的或未冷卻過的生奶[7-9]。

近幾年來食品安全事故頻繁發(fā)生，有些不法奶戶為了延長原料乳的保質期，人為加入硫氰酸根作為生牛奶保鮮劑，使其成為摻假物質之一[10-12]。我國加大對食品安全方面的工作力度，2008年發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中明確規(guī)定乳及乳制品中硫氰酸鹽屬于違法添加物質，不可以作為乳及液態(tài)奶的添加劑[13-15]。

此次研究探索建立了梯度淋洗-電導檢測液體乳中硫氰酸根的離子色譜法，試樣用乙腈沉淀蛋白，上清液加水稀釋并經(jīng)固相萃取柱凈化后，用陰離子交換色譜柱IonPac AS 19分離，電導檢測器檢測，測定液體乳中硫氰酸根的含量，旨在對液體乳中硫氰酸根快速靈敏的檢測提供參考，達到有效監(jiān)控液體乳中硫氰酸根含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液體乳（市售）；硫氰酸根SCN-標準品（1 000 μg/mL，Lot Number P2-SCN675949，Inorganic Ventures）；乙腈（色譜純，天津市富宇精細化工有限公司）；實驗室用水為超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Thermo ScientificTMICS-1100離子色譜系統(tǒng)、Dionex OnGuard RP小柱（1.0 mL，Thermo SCIENTIFIC公司）；TGL-16臺式高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；UVS-3渦旋混合儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；STAR星系列超純水機（上海礫鼎水處理設備有限公司）；0.22 μm水系PES慮膜（頗爾公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

分析柱IonPac AS 19分離柱（250 mm×4 mm，Thermo SCIENTIFIC公司）及IonPac AG 19保護柱（50×4 mm，Thermo SCIENTIFIC公司）；淋洗液源（帶有CR-ATC的EGC II KOH）。梯度淋洗條件：0～18.0 min，50 mmol/L KOH；18.1～23.0 min，70 mmol/L KOH；23.1～25.0 min，50 mmol/L KOH；檢測器采用電導檢測；抑制器ASRS ULTRA II 4 mm，自循環(huán)電抑制，電流124 mA；流速1.0 mL/mm；柱溫30 ℃；定量環(huán)500 μL。

1.3.2 標準溶液的配制

準確移取一定量的硫氰酸根SCN-標準品，用水逐級稀釋成質量濃度分別為0，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80和1.00 μg/mL的標準工作溶液。在1.3.1的色譜條件下進行測定，以硫氰酸根SCN-質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制硫氰酸根SCN-峰面積-質量濃度標準曲線。

1.3.3 試樣制備

1.3.3.1 提取

準確稱取4.0 g（精確至0.01 g）試樣于25 mL離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋混勻，常溫下沉降10 min。在10 000 r/min轉速下離心5 min，取上清液備用。

1.3.3.2 凈化

取1 mL上述備用的上清液，用水稀釋定容至10 mL，混勻后依次通過0.22 μm水系進口聚醚砜PES濾膜，OnGuard RP小柱除去試樣中的脂肪，進樣檢測。OnGuard RP小柱使用前依次用5 mL甲醇和10 mL純水活化，放置20 min后備用。

2 結果與分析

2.1 試樣前處理條件的選擇

液體乳中含有大量蛋白質、脂肪等大分子物質，需要在進入色譜柱之前除去，否則會被吸附在柱內，不易洗脫，導致柱效急劇下降。常用去蛋白的方法有酸沉降、鹽沉降、有機溶劑沉降等方法。根據(jù)經(jīng)驗，試驗選用牛奶-乙腈（4∶5，V/V）沉降蛋白，沉降時間10 min，效果顯著。渦旋振搖提取法提高硫氰酸根SCN-提取率，依次通過0.22 μm水系濾膜、OnGuard RP小柱，利用共價吸附作用，捕獲殘余的大分子有機物，減少對色譜柱的污染。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

液體乳中常含有多種營養(yǎng)成分，因此在測定其中硫氰酸根時，需要選用柱容量較高的分析柱。IonPac AS 19離子色譜柱是Dionex在聚合物鍵合技術方面的新進展，用高容量樹脂（柱容量60 ueq，240 ueq；粒徑7.5 μm）優(yōu)化柱子對硫氰酸根的選擇性，確保在使用抑制性電導檢測的情況下，即使存在超高濃度的其他陰離子，也能通過使用KOH梯度實現(xiàn)對低濃度硫氰酸根的定量測定。同時，這種聚合物親水性非常好，對KOH淋洗液選擇性很好，可以使用較高濃度的淋洗液。因此選用IonPac AS19作為分析柱，對硫氰酸根的分離具有時間短、分離度高、峰形對稱等優(yōu)點。

2.2.2 淋洗液系統(tǒng)選擇

CO32-型和OH-型是離子色譜分析陰離子常用的2種淋洗液。其中，在色譜分析中應用范圍最廣的為CO32-型，但因其經(jīng)抑制器轉化后為碳酸，碳酸部分電離出碳酸根離子與氫離子，導致背景電導較高，水負峰較大，靈敏度降低，需要對試樣進行濃縮等前處理，不適合大體積直接進樣與梯度淋洗。然而，OH-型淋洗液克服上述不足，在線產(chǎn)生系統(tǒng)電解水生成高純KOH，經(jīng)抑制器轉化為水，沒有碳酸鹽污染，具有較小的水負峰與較高的靈敏度，可以得到較好的保留時間重現(xiàn)性與較低檢出限。因此，選擇OH-型體系。

2.2.3 淋洗液濃度選擇

淋洗液濃度的選擇關系到待測組分SCN-與試樣中無機陰離子的分離效果評價及出峰時間的確定。硫氰酸根是易極化陰離子，疏水性強，在陰離子交換柱上保留相對較強，因此一般情況下需要濃度較高的淋洗液進行梯度淋洗，才能得到更好的效果。試驗選擇50 mmol/L KOH進行等度淋洗，待SCN-出峰后，使用高濃度70 mmol/L KOH淋洗液沖洗5 min分析柱，將吸附在柱上的強保留性物質洗脫下來，經(jīng)平衡回到起始濃度。因此選用50～70 mmol/L KOH梯度淋洗作為試驗條件，既克服試樣中基體離子的干擾，又大幅縮短SCN-保留時間，實現(xiàn)其迅速完美分離。

2.2.4 流速和柱溫耐受性考察

分別考察采用不同流速及柱溫進行測定時色譜行為的變化，如表1所示，以硫氰酸根質量濃度計，不同流速條件下SRSD值為0.67%，不同柱溫條件下SRSD值為0.71%。結果表明，在實際檢測過程中色譜條件（流速及柱溫）有微小變化時，硫氰酸根含量測定條件較寬，結果基本不受影響，系統(tǒng)具有較好的耐受性。

表1 系統(tǒng)耐受性考察結果

2.3 色譜行為

經(jīng)試驗探索，綜合考慮硫氰酸根保留時間及峰分離度等因素，最終選用1.3.1的色譜條件，實現(xiàn)液體乳中硫氰酸根的準確定量。硫氰酸根標準溶液、陰性試樣溶液及陰性加標試樣溶液色譜圖見圖1。結果表明，該方法選擇性高，分離效果好，加標試樣出峰良好。

圖1 硫氰酸根標準溶液（A）、陰性試樣（B）及陰性加標試樣（C）色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系、方法檢出限和定量限考察

取硫氰酸根系列標準工作溶液，按1.3.1中色譜條件進樣，以硫氰酸根峰面積對質量濃度計算線性回歸方程，確定相關系數(shù)。比較硫氰酸根色譜信號峰與基線信號，確定儀器最低檢出限（S/N=3），按試樣制備過程，得出方法檢出限與定量限，結果見表2。結果表明，硫氰酸根在0.0～1.0 μg/mL范圍內線性關系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限低（0.069 μg/g），能完全滿足分析檢測要求。

表2 硫氰酸根的回歸方程、相關系數(shù)、最低檢出限、定量限

2.4.2 方法精密度考察

取0.1 μg/mL硫氰酸根標準溶液，在上述條件下重復進樣6次，計算其相對標準偏差（SRSD），結果見表3。結果表明，硫氰酸根的保留時間和峰面積SRSD分別為0.23%和0.74%，表明其精密度較好。

表3 方法精密度試驗（n=6）

2.4.3 穩(wěn)定性考察

取制備好的液體乳供試品溶液，按1.3.1的色譜條件每間隔4 h進樣1次，測定硫氰酸根質量濃度，結果見表4。結果表明，穩(wěn)定性試驗SRSD值為1.42%，說明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗結果（n=7）

2.4.4 回收率考察

分別精密稱取3份液體乳試樣，加入低（0.1 μg/mL）、中（0.2 μg/mL）、高（0.6 μg/mL）3種質量濃度的硫氰酸根標準溶液。按上述方法提取、凈化后，進行色譜分析，對每個添加水平做3次平行試驗，計算各組分的平均回收率及其SRSD值，以考察方法的準確性，結果見表5。結果表明，硫氰酸根的平均回收率在93.55%～98.06%范圍內，SRSD值為0.89%～1.18%，方法重現(xiàn)性及準確度良好，符合分析檢測要求。

表5 加標回收率試驗結果（n=3）

2.5 實際試樣分析

利用試驗所建立的方法，對市面上幾款液體乳飲品中硫氰酸根進行測定，結果見表6所示。結果表明，該方法對這些試樣均具有良好的適用性，色譜無干擾，不同品牌液體乳飲品中硫氰酸根本底含量存在一定差異。

表6 試樣分析結果

3 結論

試驗建立離子色譜法測定液體乳中硫氰酸根的方法。試樣經(jīng)乙腈沉降蛋白，渦旋振搖提取，固相萃取小柱凈化，以IonPac AS19陰離子交換色譜柱分離，50～ 70 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性電導檢測。該方法分離效果良好，操作簡便，靈敏度高，精密度、準確度均能滿足實際檢測工作要求，值得推廣應用。