綠豆萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)的變化及分離純化研究

郭靜婕，趙琤，陸燕飛，鄧晨曉

廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)（南寧 530007）

綠豆芽，是指綠豆經(jīng)浸泡后生出的嫩芽，下胚軸是其主要的食用部分。綠豆芽有很高的藥用價(jià)值，中醫(yī)認(rèn)為，綠豆芽性涼味甘，解暑清熱、通經(jīng)脈、解毒利尿、消水腫、滋陰壯陽、調(diào)理五臟六腑、美膚、去濕熱，還能降血脂和軟化血管[1]。綠豆芽中的蛋白質(zhì)可分解成易被人體吸收的游離氨基酸，同時(shí)還含有磷、鋅等礦物質(zhì)，以及維生素B2、胡蘿卜素等多種維生素，綠豆芽具有一定的減肥功效，成為減肥餐的首選蔬菜之一[2]。2020年，全球豆芽市場規(guī)模達(dá)269億元，預(yù)計(jì)2026年將達(dá)287億元，年復(fù)合增長率為0.9%，我國是最大的豆芽生產(chǎn)及銷售市場，約占世界87%的市場份額[3]。綠豆萌發(fā)設(shè)備簡易、工藝流程簡單，家庭作坊均可滿足生產(chǎn)條件，一年四季都可以生產(chǎn)，每千克綠豆可產(chǎn)豆芽10～15 kg，回報(bào)豐厚、利潤可觀，因此新鮮綠豆芽是綠豆的主要產(chǎn)品之一。綠豆在發(fā)芽過程中，蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)雖在含量上有所下降，但維生素和膳食纖維等含量大幅提高，部分蛋白質(zhì)也會分解為各種人體所需的氨基酸，可達(dá)到綠豆原含量的7倍[4-6]，所以豆芽也被稱為“活體蔬菜”。綠豆在發(fā)芽的過程中，蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)動態(tài)變化過程[7]，在多種酶的作用下，各種有機(jī)物質(zhì)被釋出，更容易被人體充分吸收和利用[8]，同時(shí)綠豆在發(fā)芽過程中多酚類物質(zhì)明顯增加，類黃酮含量減少，生物效價(jià)和利用率大幅提高，抗氧化保健功能顯著增強(qiáng)[9]。綠豆芽主要以鮮食為主，在深加工研究方面只局限于榨汁和干燥，因此綠豆芽的深加工存在很大的研究空間[10]。為此，試驗(yàn)以綠豆為原料，探討綠豆萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)的變化及分離純化，為從綠豆芽中分離出優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)，對于綠豆芽食品的科學(xué)開發(fā)及綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆（購買于大潤發(fā)超市）；牛血清蛋白（西班牙分裝進(jìn)口）；考馬斯亮藍(lán)G250（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡聚糖凝膠LH-20（上海士鋒生物科技有限公司）；葡糖糖聚凝膠G100（上海士鋒生物科技有限公司）；瓊脂糖凝膠CM（上海士鋒生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DB5-100電腦自動部分收集器（上海瀘西分析儀器廠有限公司）；AL-2B恒流泵（上海青浦瀘西儀器廠）；TG16-ws臺式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；QL-901漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；1.6 cm× 30 cm層析柱（上海瀘西分析儀器廠有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 綠豆芽培養(yǎng)

稱取50 g綠豆，加入適量的水浸泡8 h后將水濾干，把綠豆放入漏盆置于在陰暗處蓋上紗布，按1，2，3和4 d進(jìn)行發(fā)芽，其間要適時(shí)澆水保持紗布濕潤。

1.3.2 樣品處理

稱取100 g 1.3.1小節(jié)方法培養(yǎng)的綠豆芽，加2倍的水，放入打漿機(jī)打漿1 min，并在20 ℃下保溫30 min。紗布過濾，取濾液離心（12 000 r/min）10 min后，取上清液備用。

1.3.3 鹽析

取20 mL上述上清液，加入硫酸銨粉末，使溶液中硫酸銨達(dá)到80%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解，靜止24 h。離心（12 000 r/min）10 min，棄去上清液，收集沉淀物。在沉淀物中加入蒸餾水，攪拌，使其完全溶解，定容至20 mL。

1.3.4 透析

將鹽析后的粗提液裝入處理過的透析袋（用0.01 mol/L的醋酸浸泡1～2 h，用蒸餾水浸泡3～5 h，中間換1～2次純凈水）內(nèi)。將裝有粗提液的透析袋放置燒杯中，加入0.01 mol/L的pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，浸泡24 h，其間換1～2次磷酸鹽緩沖液。收集透析后的粗提液。上柱時(shí)取1 mL粗提液，加9 mL純凈水，稀釋備用。

1.3.5 蛋白質(zhì)的測定

試驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)法G-250測定蛋白質(zhì)濃度。考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后變成深藍(lán)色，在595 nm處有最大吸收峰，且其吸光度與蛋白質(zhì)含量（10～100 μg/mL蛋白質(zhì)濃度）呈正比。

1.3.6 凝膠柱層析

裝柱，將溶脹好的凝膠一次性裝入柱內(nèi)，并避免柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或斷層；平衡，用3～5個(gè)柱體積的平衡液流過柱子直到基線變得平穩(wěn)為止；連接自動部分收集器和恒流泵；上樣，樣品用0.45 μm濾膜過濾，去除色素；洗脫流速控制在約3.5 mL、5 min，每管收集3 mL左右，并在280 nm下測定吸光度A。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同層析分離介質(zhì)對綠豆芽蛋白質(zhì)分離純化效果的影響

2.1.1 G100凝膠柱層析洗脫曲線

將透析得到的粗提液用G100凝膠柱層析進(jìn)行分離所得的洗脫曲線如圖1所示。

圖1 G100凝膠柱層析洗脫曲線

洗脫過程中蛋白質(zhì)共出現(xiàn)3個(gè)紫外吸收峰，即分離出3種蛋白質(zhì)。經(jīng)測定3種蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為361，704和36 μg/mL。

2.1.2 LH-20凝膠柱層析洗脫曲線

將透析得到的粗體液用LH-20凝膠柱層析進(jìn)行分離，所得的洗脫曲線如圖2所示。

圖2 LH-20凝膠柱層析洗脫曲線

洗脫過程中蛋白質(zhì)共出現(xiàn)3個(gè)紫外吸收峰，即分離出3種蛋白質(zhì)。經(jīng)測定3種蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為69，45和33 μg/mL，蛋白質(zhì)的濃度相對偏低。

2.1.3 CM凝膠柱層析洗脫曲線

將透析得到的粗體液用CM凝膠柱層析進(jìn)行分離，所得的洗脫曲線如圖3所示。

圖3 CM凝膠柱層析洗脫曲線

洗脫過程中蛋白質(zhì)只出現(xiàn)1個(gè)紫外吸收峰，蛋白質(zhì)濃度為422 μg/mL，表明用CM凝膠柱層析只能分離出一種蛋白質(zhì)，不適用于試驗(yàn)中豆芽蛋白質(zhì)的分離。

2.2 萌發(fā)天數(shù)對綠豆芽蛋白質(zhì)變化的影響

2.2.1 萌發(fā)1 d綠豆芽中蛋白質(zhì)的分離純化

綠豆芽發(fā)芽1 d后，粗提液經(jīng)過G100凝膠柱層析分離，得到3個(gè)洗脫峰，如圖4所示。經(jīng)測定3種蛋白質(zhì)的濃度分別為2 138，58 310和0 053 μg/g，其中大分子蛋白質(zhì)占主要優(yōu)勢。

圖4 綠豆萌發(fā)1 d蛋白質(zhì)的分離純化曲線

2.2.2 萌發(fā)2 d綠豆芽中蛋白質(zhì)的分離純化

綠豆發(fā)芽2 d后，粗提液經(jīng)過G100凝膠柱層析分離，得到3個(gè)洗脫峰，如圖5所示。經(jīng)測定3種蛋白質(zhì)的濃度分別為6 155，33 189和18 706 μg/g，大分子蛋白質(zhì)略有下降，而小分子蛋白質(zhì)濃度相對第1天時(shí)明顯增加。

圖5 綠豆萌發(fā)2 d蛋白質(zhì)的分離純化曲線

2.2.3 萌發(fā)3 d綠豆芽中蛋白質(zhì)的分離純化

綠豆發(fā)芽3 d后，粗提液經(jīng)過G100凝膠柱層析分離，得到3個(gè)洗脫峰，如圖6所示。經(jīng)測定3種蛋白質(zhì)的濃度分別為22 431，13 931和4 483 μg/g，大分子蛋白質(zhì)保持優(yōu)勢，而小分子蛋白質(zhì)濃度顯著下降。

圖6 綠豆萌發(fā)3 d蛋白質(zhì)的分離純化曲線

2.2.4 萌發(fā)4 d綠豆芽中蛋白質(zhì)的分離純化

綠豆發(fā)芽4 d后，粗提液經(jīng)過G100凝膠柱層析分離，得到3個(gè)洗脫峰，如圖7所示。經(jīng)測定3種蛋白質(zhì)的濃度分別為9 603，14 086和983 μg/g。3種蛋白質(zhì)濃度相對萌發(fā)初期下降顯著。

圖7 綠豆萌發(fā)4 d蛋白質(zhì)的分離純化曲線

2.3 綠豆芽萌發(fā)過程總蛋白質(zhì)含量的變化

圖8為綠豆芽發(fā)芽過程中總蛋白的含量變化圖。綠豆萌發(fā)在1～4 d過程中，總蛋白質(zhì)含量一直處于動態(tài)變化中，并呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，蛋白質(zhì)含量從29 800 μg/g下降至9 155 μg/g。

圖8 綠豆芽萌發(fā)過程總蛋白質(zhì)含量的變化

3 討論

試驗(yàn)中，分別選用葡聚糖凝膠G100、葡聚糖凝膠LH-20、瓊脂糖凝膠CM為柱層析介質(zhì)分離純化綠豆芽蛋白質(zhì)。樣品通過G100洗脫后得到3個(gè)洗脫峰，且分離純化后的蛋白質(zhì)濃度較高；樣品通過葡聚糖凝膠LH-20洗脫后同樣得到3個(gè)洗脫峰，但分離純化后的蛋白質(zhì)濃度偏低；樣品通過瓊脂糖凝膠CM洗脫后，僅得到1個(gè)洗脫峰。葡聚糖凝膠是一種珠狀的凝膠，含有大量羥基，很容易在水中和電解質(zhì)溶液中溶脹，在水、鹽溶液、堿和弱酸性溶液中都非常穩(wěn)定。G型的葡聚糖凝膠有各種不同的交聯(lián)度，葡聚糖凝膠G100的分離范圍在2 000～120 000，基本滿足綠豆的幾種主要蛋白質(zhì)的分離純化[11]，因此，葡聚糖凝膠G100適合用于分離純化綠豆芽蛋白質(zhì)。

綠豆在萌發(fā)過程中，蛋白質(zhì)呈現(xiàn)一個(gè)動態(tài)變化的過程，隨著萌發(fā)天數(shù)的增加，蛋白質(zhì)總含量逐漸降低。綠豆吸水膨脹伸出胚根及胚芽同時(shí)綠豆蛋白酶被激活，綠豆中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解成游離態(tài)的氨基酸供綠豆胚芽生長，在萌發(fā)過程中由于生長機(jī)制所需又有一部份新的蛋白質(zhì)被合成，但蛋白質(zhì)的分解速度大于合成速度，因此測得的總蛋白質(zhì)含量隨著萌發(fā)時(shí)間逐漸下降[12]。

根據(jù)葡聚糖凝膠G100柱層析的分離原理，在分離純化過程中，分子量大的蛋白質(zhì)比分子量小的蛋白質(zhì)先洗脫出來，綠豆萌發(fā)1 d時(shí)是以大分子的蛋白質(zhì)為主（第一峰和第二峰）。綠豆萌發(fā)2 d時(shí)小分子蛋白質(zhì)濃度明顯增加（第三峰），是因?yàn)橐徊糠执蠓肿拥鞍踪|(zhì)在綠豆蛋白酶的作用下降解為可溶性小分子蛋白質(zhì)或氨基酸，為綠豆的萌發(fā)提供能量[13]。綠豆萌發(fā)3和4 d時(shí)小分子蛋白質(zhì)（第三峰）濃度逐漸降低，大分子蛋白質(zhì)濃度總體呈下降趨勢，第一峰蛋白質(zhì)呈先上升后下降趨勢，第二峰蛋白質(zhì)呈先下降后上升趨勢，因?yàn)榫G豆芽在萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)分解為人體更易消化吸收的游離氨基酸[14]，還有一些微量元素會在一定程度上富集，增強(qiáng)綠豆芽的保健功能[15]，同時(shí)也不斷有新的蛋白質(zhì)合成供植株生長發(fā)育[16]，因此綠豆芽蛋白質(zhì)總含量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。

4 結(jié)論

在綠豆芽萌發(fā)1～4 d的過程中，綠豆芽蛋白質(zhì)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，從第1天最高的29 800 μg/g下降至第4天的9 155 μg/g。在綠豆萌芽發(fā)過程中蛋白質(zhì)一直處于動態(tài)變化的過程，蛋白質(zhì)在各種酶的作用下被分解為小分子蛋白質(zhì)和氨基酸，同時(shí)也有新的蛋白質(zhì)被合成，通過葡聚糖凝膠G100分離純化綠豆芽蛋白質(zhì)，可分離出3種蛋白質(zhì)，為從綠豆芽中分離出優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。