紅托竹蓀菌托多糖純化工藝

羅麗平，李冰晶，趙景芳，楊玲，陸剛

貴州省生物研究所（貴陽 550009）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovalvata）隸屬鬼筆目（Phallales）鬼筆科（Phallaceae）竹蓀屬（Dictyophora），是一種擔子菌（Eumycota）。主生長于竹林下腐殖土[1]，主要分布于我國貴州、云南、四川等省[2]，因菌托部分為紫紅色故而得名紅托竹蓀，又稱竹蓀。紅托竹蓀的子實體包括菌蓋、菌柄、菌裙、菌托4個部分，總高約20 cm，最高的可達30 cm，菌蓋、菌柄、菌裙均為食用部分[3]，菌托為副產物。

對于紅托竹蓀的研究主要集中在栽培技術的研究上，有研究表明竹蓀主要食用部分提取的多糖具有治療慢性氣管炎、增強免疫力[3]、降血糖（壓）[4]、減少血液中的膽固醇含量等作用[5-6]，而對于竹蓀菌托多糖的研究報道相對較少。吳雪艷等[7]利用水提法提取竹蓀菌托多糖，考察溫度、時間、料液比、提取次數(shù)對多糖提取率的影響并用響應面法建立數(shù)學模型，試驗結果證明方法具有可行性，可用于實際生產；林陳強等[8]在提取料液比1∶30（g/mL）、溫度90 ℃、時間3 h條件下提取竹蓀菌托多糖，多糖提取率為1.356%；趙凱等[9]采用熱水浸提法提取得到菌托多糖，并對其進行體外抗腫瘤研究，結果表明竹蓀菌托多糖對小鼠S180肉瘤具有一定的抑制作用；張軼博等[10]將竹蓀菌托多糖作為沙琪瑪制作的糖漿配料。

竹蓀為貴州省特色食用菌之一，因鄉(xiāng)村振興貴州助推產業(yè)扶貧需要，近年來竹蓀種植規(guī)模迅速擴增。竹蓀產量增加的同時副產物菌托產量也增加，菌托的處理均是丟棄，這不僅造成環(huán)境的污染，而且因菌托中的有效成分沒有得到合理利用從而造成資源浪費。為充分利用有效資源，項目組前期對竹蓀菌托多糖的抗氧化作用進行研究[11]，并對相關護膚品進行研發(fā)，產品試用得到一致好評。但其中所含色素影響產品的色澤，以及蛋白質含量嚴重影響產品功效。因此，試驗對菌托多糖進行純化研究，主要是針對改善所研發(fā)產品的色澤、質地和提高相應功效，最終提高加工產品價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

竹蓀菌托（匯苑特色農業(yè)有限公司）；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、姜黃素標準品（上海葉源生物科技有限公司）；活性炭（重慶茂業(yè)化學試劑有限公司）；無水乙醇、濃硫酸、磷酸、苯酚、考馬斯亮藍G250（均為分析純，重慶川東化工有限公司）；試驗用水（娃哈哈純凈水）。

1.1.2 儀器與設備

101-2AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DZ-2BCIV真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；TG-15離心機（四川蜀科儀器有限公司）；HH-M8電熱恒溫水浴鍋（金壇區(qū)金城春蘭實驗儀器廠）；ISO9001型電子天平（北京賽多麗斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-800DE超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LGJ-18真空冷凍干燥箱（北京松源華興科技發(fā)展公司）；HP-845紫外可見分光光度計（上海精科實業(yè)有限公司）；HPLC Agilent 1260（美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

將新鮮竹蓀菌托洗凈，晾干水分，用75%乙醇浸泡24 h，過濾并揮盡乙醇，將菌托置于烘箱中50 ℃烘干粉碎。稱取一定量菌托粉末于燒瓶中，以水為溶劑，沸水浴回流提取，提取2次，每次2 h。經紗布過濾，在4 ℃以10 000 r/min離心，合并上清液，于50 ℃減壓濃縮至浸膏，用85%乙醇處理，于4 ℃靜置過夜，過濾濃縮上清回收溶劑，收集沉淀，揮發(fā)盡乙醇后置于真空干燥箱中45 ℃烘干，得到竹蓀菌托多糖提取物（菌托多糖）。

1.3 單因素試驗

脫色試驗考察吸附劑不同固料比、吸附時間、吸附溫度對竹蓀多糖中色素脫除率的影響；脫蛋白試驗考察木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復合酶（木瓜蛋白酶和胰蛋白酶1∶1混合）、酶用量、酶解時間、酶解溫度對竹蓀多糖中蛋白質脫除率的影響。通過計算菌托多糖含量、色素和蛋白質的脫除率確定最佳因素條件。

1.3.1 脫色試驗方案設計

1.3.1.1 固料比的篩選

配制質量濃度5 mg/mL的樣品水溶液，等體積分組，靜態(tài)吸附1 h，37 ℃條件下，分別考察固料比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）對竹蓀多糖中色素脫除率的影響。

1.3.1.2 吸附時間的篩選

配制質量濃度5 mg/mL的樣品溶液，等體積分為組，37 ℃條件下，固料比1∶50（g/mL），分別考察靜態(tài)吸附時間（0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 h）對竹蓀多糖中色素脫除率的影響。

1.3.1.3 吸附溫度的篩選

配制質量濃度5 mg/mL的樣品溶液，等體積分組，靜態(tài)吸附時間2 h，固料比1∶50（g/mL），考察吸附溫度（20，40，60，80和100 ℃）對竹蓀多糖中色素脫除率的影響。

1.3.1.4 正交試驗優(yōu)化脫色工藝

在各單因素試驗的基礎上，分別選擇吸附劑固料比、吸附時間和吸附溫度為因素自變量，以菌托多糖含量、色素脫除率為考察指標，因素水平設計見表1。

表1 活性炭脫色正交試驗因素水平表

1.3.2 脫蛋白試驗方案設計

1.3.2.1 酶種類的篩選

將質量濃度5 mg/mL的樣品溶液，等體積分組，樣品溶液體積均為100 mL，考察木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復合酶在用量均為10 mg，溫度為37 ℃條件下，酶解1 h時各酶對菌托多糖中蛋白質脫除率的影響。

1.3.2.2 酶用量的篩選

將質量濃度5 mg/mL的樣品溶液，等體積分組，在37 ℃條件下酶解1 h，考察木瓜蛋白酶用量（5，10，15，20，25和30 mg）對菌托多糖中蛋白質脫除率的影響。

1.3.2.3 酶解時間的篩選

將質量濃度5 mg/mL的樣品溶液，等體積分組，在37 ℃條件下，木瓜蛋白酶用量10 mg，考察酶解時間（0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 h）對菌托多糖中蛋白質脫除率的影響。

1.3.2.4 酶解溫度的篩選

將質量濃度5 mg/mL的樣品溶液，等體積分組，木瓜蛋白酶用量10 mg，酶解時間2 h，考察酶解溫度（20，40，60，80和100 ℃）對菌托多糖中蛋白質脫除率的影響。

1.3.2.5 正交試驗優(yōu)化脫蛋白工藝

在已考察各單因素試驗結果的基礎上，分別選擇木瓜蛋白酶用量、酶解時間及酶解溫度為自變量，以菌托多糖含量、蛋白質脫除率為考察指標，因素水平設計表2。

表2 脫蛋白正交試驗因素水平表

1.3.3 測定項目與方法

1.3.3.1 多糖含量

采用苯酚硫酸法[12]測定樣品中多糖的含量。葡萄糖標準曲線的制作：配制0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，取相應體積分別配制質量濃度為0.005，0.015，0.025，0.035和0.045 mg/mL的溶液，取1 mL樣品加入6%苯酚1 mL，緩慢加入5 mL濃硫酸反應，搖勻冷卻后在490 nm下測定吸光度（A），以質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線并得到回歸方程y=8.829x+0.014 4，R2=0.999。

1.3.3.2 蛋白質含量

使用的考馬斯亮藍G-250法[13]測定樣品中的蛋白質含量。蛋白質標準曲線的制作：配制2 mg/mL牛血清蛋白溶液，取相應體積分別配制質量濃度為0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 mg/mL的溶液，取1 mL樣品于試管中并加入5 mL的考馬斯亮藍G250溶液，搖勻靜置反應5 min后在595 nm處測定吸光度A。以質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制蛋白質標準曲線并得到回歸方程y=3.816 2x+0.166 3，R2=0.999 4。

1.3.3.3 色素種類及含量

采用高效液相色譜法（HPLC）對比確定樣品中的主要色素種類，采用紫外分光光度法[14]測定樣品中的色素含量。取配制好的樣品溶液，在紫外分光光度計中進行光度（200～700 nm）掃描，得到最大吸收波長。經高效液相色譜法（HPLC）比對，確定竹蓀菌托中主要色素為姜黃素（圖1）。

圖1 竹蓀菌托中色素HPLC圖譜

以蒸餾水作為空白參比，用紫外分光光度法測定被試樣品的消光值和吸光度，帶入色素計算公式[16]計算相應色素含量。

式中：E1%1cm425 nm為所測樣品吸光度；1 607為姜黃素純品的吸光度；A為樣品溶液的消光值；C為樣品濃度。

1.3.4 數(shù)據處理

采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據進行方差和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 脫色試驗

2.1.1 固料比的確定

由圖2可知，固定吸附時間1 h、吸附溫度60 ℃，固料比1∶50（g/mL）時菌托多糖含量開始緩慢下降而脫色率仍在上升，綜合脫色后菌托多糖含量和脫色率結果，選擇固料比1∶50（g/mL）為宜。

圖2 固料比對菌托多糖脫色效果的影響

2.1.2 吸附時間的確定

由圖3可知，固定固料比1∶50（g/mL）、吸附溫度60 ℃，吸附時間0～1 h時菌托多糖含量下降較明顯，色素脫除率顯著升高，吸附時間2 h時，菌托多糖含量和色素脫除率均較緩慢，吸附時間高于3 h時，菌托多糖含量下降較明顯，色素脫出率仍較緩慢，因此吸附時間選擇2～3 h為宜。

圖3 吸附時間對菌托多糖脫色效果的影響

2.1.3 吸附溫度的確定

由圖4可知，固定固料比1∶50（g/mL）、吸附時間1 h，溫度由室溫（15 ℃）升至20 ℃時菌托多糖含量下降較為明顯，而色素脫率顯著升高，溫度在20～ 60 ℃時多糖含量和脫色率變化較小，溫度高于80 ℃時菌托多糖含量下降較明顯，色素脫出率仍在緩慢上升。綜合脫色后菌托多糖的含量和脫色率結果，選擇吸附溫度60 ℃較合適。

圖4 吸附溫度對菌托多糖脫色效果的影響

2.1.4 脫色正交試驗結果

由表3中R值可知：影響菌托多糖含量因素主次順序為C＞B＞A，影響脫色率的主次因素B＞A＞C。由表4方差分析結果可知，以菌托多糖的含量為評價指標，吸附溫度對菌托多糖在脫色中含量的影響顯著（P＜0.05）。以色素脫出率為評價指標，活性炭用量和吸附時間對竹蓀菌托多糖脫色率影響顯著（P＜ 0.05）。根據正交試驗結果可知：綜合脫色后菌托多糖含量和脫色率結果，最優(yōu)脫色組合為A1B3C3，即固料比1∶50（g/mL）、吸附時間2.5 h、吸附溫度60 ℃。

表3 L9(33)脫色正交試驗結果

表4 活性炭脫色正交試驗結果分差分析

2.2 脫蛋白試驗

2.2.1 酶種類的確定

由圖5可知，固定酶解時間1 h、酶解溫度45 ℃、沸水滅活10 min，木瓜蛋白酶對提取物的蛋白質脫除率優(yōu)于其他2種酶，且多糖含量也有所提高。因此選擇木瓜蛋白酶為目標酶。

圖5 不同酶對菌托多糖脫蛋白效果的影響

2.2.2 酶用量的確定

由圖6可知：固定酶解時間1 h、酶解溫度45 ℃、沸水滅活10 min，隨著酶用量的增加，多糖含量逐漸增加，但幅度較小，蛋白質含量在酶用量0～5 mg時下降較顯著，隨后隨著酶用量的增加下降幅度較小，根據試驗結果選取酶用量10～30 mg為宜。

圖6 酶用量對菌托多糖脫蛋白效果的影響

2.2.3 酶解時間的確定

由圖7可知：在固定酶用量10 mg、酶解溫度45 ℃、沸水滅活10 min條件下，酶解時間0～2 h時多糖含量升高較明顯，蛋白質含量下降也較明顯，酶解時間達到2 h時，多糖含量達到最高，酶解時間繼續(xù)延長至3 h時，多糖含量升高不明顯而蛋白質含量與2 h時基本不變，因此選擇酶解時間1～2 h為宜。

圖7 酶解時間對菌托多糖脫蛋白效果的影響

2.2.4 酶解溫度的確定

由圖8可知，固定酶用量10 mg、酶解時間2 h、沸水滅活10 min，酶解溫度50 ℃時酶對菌托提取物蛋白質較好，溫度繼續(xù)升高時，多糖含量不再升高且有下降趨勢，蛋白質脫除率變化不明顯。因此酶解溫度不高于60 ℃為宜。

圖8 酶解溫度對菌托多糖脫蛋白效果的影響

2.2.5 脫蛋白正交試驗結果

由表5中R值可知，影響菌托多糖含量的主次因素D＞E＞F，影響菌托多糖脫蛋白因素主次順序為E＞F＞D。由表6方差分析結果可知：以菌托多糖含量為評價指標，酶解時間對竹蓀菌托多糖在進行脫蛋白中多糖的含量影響顯著（P＜0.05）；以蛋白質脫除率為評價指標，酶用量對菌托多糖在進行脫蛋白時蛋白質的脫除率影響顯著（P＜0.05）。根據正交試驗結果可知，綜合脫色后菌托多糖的含量和蛋白質脫除率結果，最優(yōu)的脫蛋白組合為D3E1F3，即酶用量30 mg、酶解時間1 h、酶解溫度60 ℃。

表5 L9(33)木瓜蛋白酶脫蛋白正交試驗結果

表6 木瓜蛋白酶脫蛋白正交試驗結果分差分析

3 結論

研究結果表明：吸附劑用量、吸附時間和吸附溫度均顯著影響菌托多糖的色素脫除率，經菌托多糖脫色研究得出最優(yōu)脫色工藝為固料比1∶40（g/mL）、吸附時間2.5 h、吸附溫度60 ℃。酶解時間、酶解溫度、酶用量均能影響菌托多糖中蛋白質的脫除率，其中酶解時間對蛋白質的脫除率影響顯著。經菌托多糖脫蛋白研究得出最優(yōu)脫蛋白工藝：酶用量30 mg、酶解時間1 h、酶解溫度60 ℃。在上述條件下菌托多糖色素脫除率可達67.83%，多糖含量由原來的27.77%提高到49.07%，蛋白質含量由原來的12.87%下降到6.33%。此研究不僅變廢為寶且成本低廉，具有廣闊的開發(fā)利用前景。

4 討論

研究結果顯示所選三個因素對菌托多糖含量和色素脫除率的影響一致，活性炭用量逐漸增加、吸附時間變長、吸附溫度升高均會導致多糖含量的下降，原因可能是用量和吸附時間的增加使得多糖分子進入活性炭空隙概率增大，從而導致多糖含量降低，吸附溫度升高可能是增加糖分子運動，使得更多糖分子進入到活性炭的空隙中，從而導致多糖含量的降低。在進行酶解溫度考察時，當溫度在80 ℃時多糖含量下降較為明顯；在酶解時間3 h和4 h時多糖含量上升幅度較小?？赡艿脑蚴牵弘S著酶解溫度繼續(xù)升高和酶解時間變長，酶的活性逐漸降低，因為酶本質是蛋白質，失活后的酶附在糖分子的表面，導致糖含量的降低。

隨著人工馴化技術的不斷提高，食用菌產業(yè)規(guī)模增長也越來越迅速，食用菌產出量也越來越大，因此所產生的食用菌廢棄物也越來越多，此研究對竹蓀高附加值產品的開發(fā)提供研究基礎，有助于延長竹蓀產業(yè)鏈。菌托中所含的其他活性成分和更多生物活性需要進一步研究。