響應(yīng)面優(yōu)化水酶法提取油茶籽油工藝

林莉，董瑋，周敏，楊衛(wèi)林，龍開偉，陳順利

1. 凱里學(xué)院大健康學(xué)院（凱里 556001）；2. 凱里學(xué)院理學(xué)院（凱里 556001）；3. 貴州綠色農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司（錦屏 556704）

油茶籽（Camellia oleiferaseed）也稱山茶籽，是我國四大木本油料之一[1]。油茶籽油具有降血壓血脂、軟化血管等保健作用，是我國理想的“健康型”食用油[2-3]。油茶籽油還可作為高級天然化妝品用油原材料[4]。此外，油茶籽油中微量營養(yǎng)素（維生素E、植物甾醇、角鯊烯等）含量較高，有預(yù)防高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等作用[5]。隨著我國耕地面積少，油茶作為我國的木本科油料作物，大規(guī)模種植可以改善生態(tài)環(huán)境，增加收入，對油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有很大潛力[6]。

油茶籽油的提取方法多樣，通過壓榨法所得到的油脂風(fēng)味好，但存在油脂品質(zhì)不高、得油率偏低等問題。浸出法存在工序復(fù)雜，提取成本較高，在堿煉、脫臭、脫色過程中有機物會損失，制得油茶籽油風(fēng)味較差，存在溶劑殘留等問題[7-8]。水酶法提油與其他提油方法相比，主要是以水為溶劑，利用酶制劑的活性，通過酶與底物反應(yīng)，從而使油脂分離出來。水酶法提取油脂具有安全性高[9-11]、工藝條件較溫和、設(shè)備簡單、油品質(zhì)較高、耗能少、對環(huán)境污染小、資源利用率高等特點[12-15]。近年來，水酶法提油已有推廣，采取水酶法提油的方法，不但能提高提油效率，也能防止致癌物的形成，從而更好地保留茶多酚、維生素等多種成分[16-17]。試驗選擇水酶法提取油茶籽油，為進一步提高油茶籽油的綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

油茶籽（貴州省綠色農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司）。

果膠酶（酶活力60 000 U/g，河南林博生物有限公司）；纖維素酶（100 000 U/g，東勝生物有限公司）；中性蛋白酶（100 000 U/g，和氏壁生物科技有限公司）；所用其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

1002型電子天平（杭州萬特衡器有限公司）；800C型高速粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）；AXTD5A型離心機（鹽城市安信試驗有限公司）；HH-2A型水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；101-3ASB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 操作流程

油茶籽原料預(yù)處理：干燥后的油茶籽脫殼，將殼與仁分開，油茶籽果仁采用粉碎機粉碎后過0.250 mm（60目）孔徑篩，得到油茶籽粉，備用。

水酶法提油工藝流程：稱取5 g過0.250 mm（60目）孔徑篩后的油茶籽粉，按一定料液比加水煮沸1 h，冷卻后調(diào)節(jié)至所用酶制劑的適用作用pH，加入一定量酶制劑在適宜溫度下酶解，待酶解結(jié)束后按4 000 r/min離心30 min，取上層清油旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到油茶籽油。

1.3.2 油茶籽油提取率計算[18]

式中：Y為油茶籽油提取率，%；m1為提取所得油茶籽油質(zhì)量，g；m2為油茶籽的脂肪含量，g；m3為試驗稱取的油茶籽粉質(zhì)量，g。

參照GB/T 5512—2008《糧油檢驗：糧食中粗脂肪含量測定》，經(jīng)測定試驗所用油茶籽仁中含有36.30%的油脂，因此試驗以原料中油脂含量36.30%計算提取率。

1.3.3 酶制劑的篩選

選擇果膠酶（最適作用pH 3.5、作用溫度50 ℃）、纖維素酶（最適作用pH 4.8、作用溫度60 ℃）、中性蛋白酶（最適作用pH 6.0、作用溫度50 ℃）作為酶制劑，分別按1.3.1小節(jié)中水酶法提油工藝流程進行操作，篩出油茶籽油提取率高的酶制劑。

1.3.4 單因素試驗

準確稱取5 g油茶籽粉末，通過單因素試驗考察四因素對油茶籽油提取率的影響，具體方案見表1。

表1 單因素試驗因素與水平

1.3.5 響應(yīng)面試驗

采用響應(yīng)面法優(yōu)化單因素試驗，設(shè)計四因素三水平試驗進行優(yōu)化，因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel與Design Expert 8.06軟件進行統(tǒng)計分析，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對油茶籽油提取率的影響

由圖1可知，在選擇不同酶制劑提取油茶籽油時，果膠酶比纖維素酶、中性蛋白酶對油茶籽油的提取率影響大。果膠是一種多糖，主要存在于植物細胞壁和細胞內(nèi)層，而油茶籽中含有20%～30%的茶籽多糖[19]。果膠酶能使油茶籽細胞壁和細胞內(nèi)層的果膠大分子有效降解，油茶籽細胞破裂油脂被釋放出來。因此，試驗確定果膠酶作為油茶籽油提取工藝的酶制劑。

圖1 酶種類對油茶籽油提取率的影響

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對油茶籽油提取率的影響

每種酶都有其最適反應(yīng)溫度，當反應(yīng)體系溫度低于酶的最適反應(yīng)溫度時，隨著溫度的升高，反應(yīng)物的能量增加，分子間的接觸次數(shù)單位時間內(nèi)增加，加快反應(yīng)速度。反應(yīng)體系溫度高于酶的最適溫度時，能量被酶分子過多吸收，酶蛋白發(fā)生變性，其活性減弱甚至喪失催化活性[20]。由圖2可以看出，酶解溫度在45～50 ℃之間時，油茶籽油提取率上升，但在50 ℃后，提取率開始平緩下降。因此可以得到，在提取油茶籽油過程中最適酶解溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對油茶籽油提取率的影響

2.2.2 酶解時間對油茶籽油提取率的影響

由圖3可以看出，在1～4 h之內(nèi)，酶解時間與油茶籽油提取率呈正相關(guān)，在酶解4 h時，提取率達到峰值。隨著酶解時間的延長，提取率呈現(xiàn)下降趨勢。這是由于酶解時間延長體系中的蛋白質(zhì)、纖維素等成分會和油脂相結(jié)合[21]，導(dǎo)致提取率降低，且酶解時間過長也會影響油的品質(zhì)。因此選擇酶解時間4 h較合適。

圖3 酶解時間對油茶籽油提取率的影響

2.2.3 酶用量對油茶籽油提取率的影響

由圖4可知，酶用量0.5%～1.5%時，油茶籽油提取率隨酶用量的增加而增加，酶用量1.5%時提取率最大。但在酶用量達到1.5%后，提取率隨酶用量的增加而降低。這可能是由于在底物濃度固定的條件下，酶的加入量在一定范圍內(nèi)與酶解效率呈正比關(guān)系，當酶用量高于一定量時，酶解效率略有降低并趨于平緩。綜合考慮，選擇果膠酶用量1.5%較好。

圖4 酶用量對油茶籽油提取率的影響

2.2.4 料液比對油茶籽油提取率的影響

由圖5可見，料液比1∶3～1∶5 g/mL時，油茶籽油提取率與液體占比呈正比，這可能是由于油茶籽中含有一定量的淀粉和蛋白質(zhì)，具有較強的吸水膨脹能力，液體占比較小時物料變得黏稠，流動性差，不易攪拌，故增加液體占比提取率也增大[22-23]。料液比1∶5 g/mL時對油茶籽油提取率影響最大，但在料液比1∶5 g/mL之后，油茶籽油提取率呈下降趨勢，這可能是由于液體占比的增加稀釋了酶與底物的濃度，使酶的作用效果受到影響。因此，該試驗選擇料液比1∶5 g/mL較好。

圖5 料液比對油茶籽油提取率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以油茶籽油提取率作為試驗指標，酶解時間（A）、料液比（B）、酶用量（C）和酶解溫度（D）4個因素作為自變量，采用Box- Behnken模型對提油工藝進行優(yōu)化，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

對表3中的試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行多次擬合回歸分析，得到模型的二次多項回歸方程：Y=84.10+0.54A+ 0.37B+0.80C+0.10D-0.52AB+0.15AC+1AD-0.10BC+ 0.25BD+0.25CD-2.60A2-2.65B2-2.81C2-2.36D2。各項系數(shù)的絕對值的大小表示各影響因素對油茶籽油提取率的影響大小。由此可知，各因素對油茶籽油提取率的影響大小順序為酶用量（C）＞酶解時間（A）＞料液比（B）＞酶解溫度（D）。對該模型方差分析，結(jié)果見表4。

由方差分析表4可得，失擬項不顯著（P＞0.05），回歸模型極顯著（P＜0.000 1），證明該模型擬合程度好。由表4可知，可調(diào)整確定系數(shù)Radj2為0.955 9，方程的決定系數(shù)R2為0.978 0，說明試驗數(shù)據(jù)有較高的可信度，具有統(tǒng)計學(xué)意義。由P值可知，酶用量對油茶籽油提取率的影響極顯著（P＜0.01），酶解時間和料液比影響顯著（P＜0.05），酶解溫度影響不顯著（P＞0.05），二次項A2、B2、C2、D2對模型影響極顯著。

表4 回歸模型方差分析

2.3.2 響應(yīng)面各因素間交互作用分析

如圖6～圖11所示：在因素間交互作用對提取率的影響中，圖6、圖9、圖10和圖11中響應(yīng)曲面雖陡峭，但交互作用的等高線圖呈現(xiàn)圓形，說明交互作用不顯著。由圖7可知：酶解時間保持不變時，油茶籽油提取率隨著液體占比的增大呈現(xiàn)先增后減趨勢，料液比保持不變時，提取率呈現(xiàn)相同趨勢；響應(yīng)曲面陡，等高線接近橢圓形，故酶解時間與料液比兩因素間交互作用顯著。由圖8可知：當酶解時間保持不變時，提取率隨著酶解溫度的增大呈現(xiàn)先升后降趨勢，酶解溫度保持不變時，提取率也隨酶解時間增加呈現(xiàn)先升后降趨勢；響應(yīng)面曲面較陡，等高線呈現(xiàn)橢圓，故酶解時間與酶解溫度兩因素間交互作用極顯著。

圖6 酶解時間與酶用量對油茶籽油提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線

圖7 酶解時間與料液比對油茶籽油提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線

圖8 酶解時間與酶解溫度對油茶籽油提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線

圖9 料液比與酶用量對油茶籽油提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線

圖10 料液比與酶解溫度對油茶籽油提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線

圖11 酶用量與酶解溫度對油茶籽油提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線

2.3.3 最佳提取條件的預(yù)測和驗證

使用Design-Expert分析得出最佳提取方案：酶用量1.64%、酶解溫度50.27 ℃、料液比1∶5.06 g/mL、酶解時間4.10 h。為方便操作，將最佳方案調(diào)整為酶用量1.6%、酶解溫度50 ℃、料液比1∶5 g/mL、酶解時間4 h。經(jīng)過3次驗證后，平均提取率為84.03%，與預(yù)測值84.20%無較大差異，由此可知，該模型擬合效果較好，表明最佳方案可靠。

3 結(jié)論

試驗確定果膠酶為提取油茶籽油最佳酶制劑。通過響應(yīng)面試驗分析，得到最佳方案：酶用量1.6%、酶解溫度50 ℃、料液比1∶5 g/mL、酶解時間4 h。經(jīng)3次驗證，最高提取率為84.03%。上述因素對油茶籽油提取率影響順序為酶用量＞酶解時間＞料液比＞酶解溫度。

試驗所得油茶籽油可進一步測定其脂肪酸組成，酸值、過氧化值等理化指標，與壓榨所得的油茶籽油進行對比分析，為油茶籽油提取方法的多樣性提供理論依據(jù)。同時，探索油茶籽油與其他油脂進行調(diào)和，研究其脂肪酸組成及風(fēng)味成分，可更好地確定油茶籽油的運用方向。