廣西某高校細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室污染狀況的調(diào)查研究*

鐘偉月，黃海燕，馮 燚，彭遠(yuǎn)軍，廖艷研,3，王海龍,3，梁敏莉，林成琳，楊 揚(yáng)，葉 力1,,3，潘沛江,3△，梁 浩1,,3△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.中國(guó)（廣西）-東盟新發(fā)傳染病聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室污染仍是目前普遍存在的問(wèn)題。在細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，試劑容器表面、環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)人員操作等因素會(huì)造成污染，如支原體污染、細(xì)菌污染等[1]，可導(dǎo)致細(xì)胞功能和性質(zhì)發(fā)生改變，從而影響實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性和科學(xué)性[2]。支原體污染是最常見(jiàn)、不易察覺(jué)和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的污染原因[3]，調(diào)查顯示細(xì)胞系的支原體污染率在15%～50%[4]，受支原體污染的細(xì)胞可能無(wú)明顯變化，但可使研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性大大下降[1]。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在生物安全柜內(nèi)操作，生物安全柜是一種由特殊氣流組織結(jié)構(gòu)與高效空氣過(guò)濾器組成的具有箱型屬性特點(diǎn)的凈化功能負(fù)壓裝置[5]，但其本身存在使用年限過(guò)長(zhǎng)、過(guò)濾裝置損壞等問(wèn)題而達(dá)不到相應(yīng)的保護(hù)效果。此外，客觀條件如實(shí)驗(yàn)室清潔情況、人員無(wú)菌意識(shí)、實(shí)驗(yàn)操作是否恰當(dāng)?shù)?，均可能?duì)細(xì)胞造成污染[6]。因此，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染檢測(cè)，在日常的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中是十分必要的。本研究通過(guò)結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的客觀條件如人員流動(dòng)情況、清潔制度等，并采集細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室外環(huán)境樣本與生物安全柜表面樣本，檢測(cè)支原體與細(xì)菌污染情況，為促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco公司），15 mL和1.5 mL的EP管（Labselect公司），直徑90 mm培養(yǎng)皿（Biosharp公司），營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉劑（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），PCR 擴(kuò)增試劑（Takara公司）。

1.2 采樣對(duì)象及方法 隨機(jī)抽取8 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行采樣，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均有紫外燈、制冷及新風(fēng)系統(tǒng)，其中6 個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置緩沖間。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室分布10 個(gè)采樣點(diǎn)，其中包括生物安全柜下方落腳處、顯微鏡旁臺(tái)面、培養(yǎng)箱內(nèi)壁、培養(yǎng)箱外側(cè)扶手、培養(yǎng)箱內(nèi)用水、房間地面中央及4 處角落。對(duì)安全柜的采樣分為紫外照射30 min、無(wú)人員操作運(yùn)行30 min與人員操作30 min后不同時(shí)間點(diǎn)，在生物安全柜操作臺(tái)面兩側(cè)及中間3個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣。細(xì)菌采樣以醫(yī)用滅菌級(jí)棉簽蘸取采樣液（生理鹽水4 mL）、支原體采樣使用醫(yī)用滅菌級(jí)棉簽蘸取采樣液（含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液1 mL），生理鹽水和DMEM培養(yǎng)液均進(jìn)行滅菌處理。

將酒精燈點(diǎn)燃并置于采樣點(diǎn)附近（≤15 cm），先將5 cm×5 cm 不銹鋼采樣板經(jīng)火焰進(jìn)行滅菌，冷卻后采樣板置于采樣點(diǎn)保持不動(dòng)，使用滅菌棉簽在采樣板中間5 cm×5 cm 范圍內(nèi)進(jìn)行涂抹后，迅速將棉簽置于相應(yīng)的采樣管中。

1.3 細(xì)菌與支原體檢測(cè)方法 將采集的生理鹽水標(biāo)本短暫渦旋10 s，充分混勻后取1 mL混懸液至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置入高壓后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察平板上細(xì)菌生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。DMEM 培養(yǎng)液標(biāo)本置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用PCR 擴(kuò)增法以及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)支原體污染情況。采用兩對(duì)引物對(duì)支原體的不同片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物1 上游：5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’，下游：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’；引 物2上游：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，下游：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120 mA，30 min）后于凝膠檢測(cè)儀中觀察是否出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶以判斷是否存在支原體感染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料為開(kāi)口資料，采用中位數(shù)（M）表示，行秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，率的比較采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室不同采樣點(diǎn)的污染情況 對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的10個(gè)不同采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣并檢測(cè)細(xì)菌、支原體污染情況，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果如表1所示，房間4個(gè)角落及地面中央、安全柜下方落腳處、培養(yǎng)箱外側(cè)扶手以及內(nèi)壁的樣本均可檢出細(xì)菌，樣本陽(yáng)性檢出率為100.00%。僅在1 個(gè)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱水樣檢出細(xì)菌。各個(gè)采樣點(diǎn)均受到不同程度的支原體污染，其中支原體陽(yáng)性檢出率最高的位置是培養(yǎng)箱水樣，為100.00%，房間地面中央的標(biāo)本支原體陽(yáng)性檢出率最低，為50.00%，見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)室不同采樣點(diǎn)的細(xì)菌污染情況CFU/皿

表2 實(shí)驗(yàn)室不同采樣點(diǎn)的支原體污染情況

2.2 不同類型實(shí)驗(yàn)室的污染情況 將所采樣的8 間實(shí)驗(yàn)室按照實(shí)驗(yàn)操作人員數(shù)大小分為A、B 兩組，A組為實(shí)驗(yàn)人員數(shù)較少組，B組為實(shí)驗(yàn)人員數(shù)較多且流動(dòng)頻繁組，比較兩組污染情況的差異。如表3 所示，B 組實(shí)驗(yàn)室的房間角落1、3、4 及地面中央，以及安全柜落腳處的細(xì)菌數(shù)目均多于A 組（P＜0.05）。A 組實(shí)驗(yàn)室安全柜落腳處的支原體陽(yáng)性檢出率高于B組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 不同類型實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌污染情況CFU/皿，M

表4 不同類型實(shí)驗(yàn)室的支原體陽(yáng)性檢出情況n（%）

2.3 生物安全柜內(nèi)污染情況 對(duì)采樣的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)中安全柜內(nèi)臺(tái)面上從左到右布置3個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣，共采集了36份樣本并予以細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)和支原體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表5所示，所有樣本均未培養(yǎng)出細(xì)菌。通過(guò)對(duì)支原體污染狀況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)采樣點(diǎn)1在人員操作30 min后支原體陽(yáng)性檢出率為25.00%，采樣點(diǎn)2 在風(fēng)機(jī)運(yùn)行30 min、人員操作30 min 后支原體陽(yáng)性檢出率分別為25.00%、25.00%，采樣點(diǎn)3 在紫外照射30 min 后支原體陽(yáng)性檢出率仍有25.00%。可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)紫外照射30 min、風(fēng)機(jī)空運(yùn)行30 min、人員操作30 min 后生物安全柜內(nèi)仍存在一定的支原體污染。

表5 生物安全柜內(nèi)樣本陽(yáng)性檢出率%

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境分為實(shí)驗(yàn)室外環(huán)境和生物安全柜內(nèi)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)室外環(huán)境因人員流動(dòng)頻繁，是空氣污染的易感區(qū)和高發(fā)區(qū)，可通過(guò)消毒、殺菌與值日打掃來(lái)提高其清潔度[5]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)人員流動(dòng)頻繁的公共實(shí)驗(yàn)室房間地面與安全柜落腳處細(xì)菌污染較嚴(yán)重。除房間地面中央以外的其余9 個(gè)采樣點(diǎn)支原體陽(yáng)性檢出率均超過(guò)60.00%，這可能與實(shí)驗(yàn)室人員流動(dòng)性較大以至于管理難度大，以及實(shí)驗(yàn)室未定期開(kāi)展清潔消毒有關(guān)。高校微生物實(shí)驗(yàn)室由于學(xué)生流動(dòng)性大，進(jìn)出人員多，實(shí)驗(yàn)人員衣物表面的微生物會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染[7]。減少實(shí)驗(yàn)人員的活動(dòng)，對(duì)各種實(shí)驗(yàn)用品進(jìn)行表面消毒可減少空氣細(xì)菌污染[8]。因此，應(yīng)合理安排實(shí)驗(yàn)室的使用，如盡量減少無(wú)關(guān)人員進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)入操作間前必須穿工作服，定期打掃衛(wèi)生，定期使用紫外燈光照射進(jìn)行滅菌處理等并加強(qiáng)督導(dǎo)，讓學(xué)生能從自我防范和維護(hù)實(shí)驗(yàn)室安全滅菌環(huán)境的意識(shí)上來(lái)重視實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理[2]。

本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)箱水樣的支原體陽(yáng)性檢出率高達(dá)100.00%，這可能與實(shí)驗(yàn)室的日常清潔制度不力，清潔效果未達(dá)標(biāo)有關(guān)。二氧化碳培養(yǎng)箱污染是導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗的一個(gè)主要因素[9]，為減少和防止污染的發(fā)生，培養(yǎng)箱的消毒和維護(hù)尤為重要，日常細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)所加入的水必須是蒸餾水或去離子水，除需經(jīng)常檢查箱內(nèi)水是否足夠外，還應(yīng)定期更換培養(yǎng)箱用水，并對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行清潔消毒，防止箱內(nèi)微生物滋生。

進(jìn)入安全柜內(nèi)的空氣經(jīng)過(guò)高效過(guò)濾裝置（HEPA）過(guò)濾后達(dá)到百級(jí)潔凈，可降低氣溶膠擴(kuò)散現(xiàn)象，減少實(shí)驗(yàn)室感染現(xiàn)象[10]，然而一旦生物安全柜的有效性和安全性遭到破壞，將對(duì)實(shí)驗(yàn)室以及實(shí)驗(yàn)物品、實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成嚴(yán)重污染。另外，有研究表明實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生物安全柜使用過(guò)久，濾板未定期更換或長(zhǎng)久不更換，過(guò)濾裝置受塵埃堵塞，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，從而導(dǎo)致柜內(nèi)污染[11]，因此日常定期監(jiān)測(cè)生物安全柜內(nèi)污染狀況顯得十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)紫外照射30 min、風(fēng)機(jī)空運(yùn)行30 min 后支原體陽(yáng)性檢出率仍為25.00%，可見(jiàn)抽檢實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜存在一定程度的污染，這可能與生物安全柜的日常維護(hù)不規(guī)范有關(guān)。在使用頻率較高的場(chǎng)所，一般一至兩年后HEPA的通透性會(huì)隨著其表面積累的灰塵、細(xì)菌而下降，進(jìn)而影響生物安全柜的垂直風(fēng)速和窗口平均風(fēng)速，使安全柜內(nèi)的潔凈、無(wú)菌環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)人員的安全無(wú)法得到正常保障[6]。因此，實(shí)驗(yàn)管理人員應(yīng)做好生物安全柜的維修保養(yǎng)，每年對(duì)其有效性和安全性進(jìn)行檢測(cè)，如及時(shí)更換高效空氣過(guò)濾器，準(zhǔn)確測(cè)量流經(jīng)HEPA的氣流速度及負(fù)壓等。

有研究報(bào)道，在生物安全柜動(dòng)態(tài)條件下，如操作不當(dāng)，人員的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)會(huì)造成操作面板及格柵部位的空氣亂流，實(shí)驗(yàn)室外環(huán)境中的部分非潔凈空氣就會(huì)隨空氣亂流進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)域造成實(shí)驗(yàn)樣本污染[10]。本研究結(jié)果顯示，在人員操作30 min 后采樣點(diǎn)1 和采樣點(diǎn)2 的支原體陽(yáng)性檢出率均為25.00%，這可能與實(shí)驗(yàn)人員的操作不當(dāng)有關(guān)。雷亞克等[12]研究表明，在實(shí)驗(yàn)人員手接觸最為頻繁的地方污染最為嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境污染可能多由手部衛(wèi)生措施不到位和常態(tài)化的清潔消毒不徹底所造成的。因此，為避免柜內(nèi)空氣亂流和實(shí)驗(yàn)樣本交叉污染，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，如佩戴口罩、頭套、滅菌手套，以及穿好滅菌實(shí)驗(yàn)服等。

綜上所述，不論是實(shí)驗(yàn)室外環(huán)境還是生物安全柜內(nèi)環(huán)境均有不同程度的污染，應(yīng)加強(qiáng)完善實(shí)驗(yàn)室管理制度，定期檢修生物安全柜，實(shí)驗(yàn)人員注意無(wú)菌操作，做好實(shí)驗(yàn)物品表面消毒和規(guī)范操作，有助于降低細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的污染。