LINC00710靶向miR-367/PTEN軸抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

莫靜欣，馮 莉，楊 力

（十堰市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室，十堰 442000）

肺癌已成為中國(guó)癌癥死亡的主要原因。由于缺乏早期診斷標(biāo)志物，超過(guò)50%肺癌患者確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，使患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致5年生存率未超過(guò)15%[1-2]。因此，探討肺癌的分子機(jī)制對(duì)尋找肺癌診斷和治療靶點(diǎn)有重要的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）是長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，其通過(guò)直接或間接與miRNA、蛋白質(zhì)相互作用等參與腫瘤的發(fā)展[3-4]。Zhao 等[5]采用lncRNA芯片技術(shù)和熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中LINC00710表達(dá)顯著降低，但LINC00710在肺癌細(xì)胞中的具體生物學(xué)作用尚未可知。微小RNA（miR）-367是一種腫瘤相關(guān)因子，miR-367高表達(dá)與肺癌患者較差的預(yù)后、腫瘤大小、腫瘤分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，抑制miR-367能促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)肺癌發(fā)生和發(fā)展[6]。第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源等位基因（PTEN）是一種抑癌基因，PTEN低表達(dá)對(duì)肺癌的發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LINC00710 與miR-367、miR-367 與PTEN 之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，但LINC00710 是否靶向miR-367/PTEN 軸參與肺癌進(jìn)展尚未可知。本研究以miR-367、PTEN 為關(guān)鍵點(diǎn)，旨在探討LINC00710 對(duì)肺癌細(xì)胞惡性行為的影響和可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)組織

收集2017 年12 月至2018 年12 月于本院確診為肺癌的33 例患者，其中男15 例，女18 例；所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或其它治療；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期17 例，Ⅲ期16 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例，未轉(zhuǎn)移13 例。將切除的肺癌患者的癌組織及癌旁組織分割成小塊，生理鹽水漂洗去除血漬和污物，置于液氮中冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存。本研究符合倫理委員會(huì)的規(guī)定，并在患者知情同意的情況下進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞和試劑

肺癌A549 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。青/鏈霉素雙抗、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；TRIzol 試劑、Opti-MEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；LINC00710 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-LINC00710）、空載體質(zhì)粒（pcDNA3.1）、miR-367 模擬物（miR-367 mimic）、雙熒光素酶報(bào)告基因載體購(gòu)于上海吐露港生物技術(shù)公司；miRNA熒光定量PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博生物公司；Prime-ScriptTMRT 試劑盒、2×SYBR Premix ExTaq 試劑盒購(gòu)于大連TAKARA 生物；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8）購(gòu)于上海晶抗生物公司；基質(zhì)膠、Transwell培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)BD 公司；兔源Ki67 抗體、羊抗兔IgG 二抗、兔源PTEN 抗體、兔源上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin）抗體和兔源神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體購(gòu)于上海賽信通公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 中（含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素與100 μg/mL 鏈霉素）。當(dāng)細(xì)胞80%匯合時(shí)進(jìn)行0.25%胰蛋白酶消化，1∶3 比例傳代，每3～4 d 傳代一次。培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、5%CO2。

1.3.2 RT-qPCR檢測(cè)LINC00710和miR-367表達(dá) 用TRIzol 試劑從肺癌組織和癌旁組織中提取總RNA。為檢測(cè)LINC00710和miR-367表達(dá)，分別用PrimeScriptTM和miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再分別用2×SYBR Premix ExTaq熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。LINC00710 上游引物：5’-AGCACCTGTTCCCCTCTACT-3’，下游引物：5’-CCAGGGTGAATGGAAACCCA-3’；miR-367 上游引物：5’-TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3’，下游引物：5’-CGAGCAATTGCACTTTAGCAAT-3’；GAPDH 上游引物：5’-CCCACATGGCCTCCAAGGAGTA-3’，下游引物：5’-GTGTACATGGCAACTGTGA-GGAGG-3’；U6 上游引物：5’-GGTCGGGCAGGA-AAGAGGGC-3’，下游引物：5’-GCTAATCTTCTCTGTATCGTTCC-3’。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算LINC00710（GAPDH 為內(nèi)參）和miR-367（U6 為內(nèi)參）的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 將A549 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種到6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞50%匯合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Opti-MEM 培養(yǎng)基 分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00710、miR-367 mimic、miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，依次記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-LINC00710組、miR-367 mimic組、miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 組。另設(shè)置對(duì)照組，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6 h后更換為新鮮含血清DMEM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，用RT-qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h，每孔加入90 μL 的DMEM 和10 μL 的CCK-8。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)孵育2 h后各孔細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.3.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成數(shù) 取0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 溶液消化各組A549 細(xì)胞。按照每孔600 個(gè)細(xì)胞接種60 mm 培養(yǎng)板，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)停止培養(yǎng)。4%多聚甲醛固定細(xì)胞集落，0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞集落染色。隨后顯微鏡對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 向24孔板下室中加600 μL含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，將包被（侵襲檢測(cè)）或未包被（遷移檢測(cè)）基質(zhì)膠的Transwell上室中加入200 μL。培養(yǎng)24 h后，去除未穿膜細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定侵襲細(xì)胞，PBS 沖洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、觀察和拍照。

1.3.7 Western blotting 檢測(cè)PTEN、Ki67、E-cadherin和N-cadherin 蛋白表達(dá) 預(yù)冷RIPA 緩沖液裂解細(xì)胞，離心收集細(xì)胞上清液，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。按照30 μg 每孔上樣進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，4 ℃下用5%脫脂牛奶封閉1 h，用1∶1 000 稀釋的PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH 一抗溶液室溫孵育2 h，加入1∶1 000 稀釋的二抗溶液孵育，加入化學(xué)發(fā)光試劑暗室顯色后，用Image J 軟件定量分析目的條帶灰度值。結(jié)果以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將含有miR-367預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的LINC00710（或PTEN-3’UTR）野生型序列或不含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的LINC00710（或PTEN-3’UTR）突變型序列分別克隆到pmirGLO載體，構(gòu)建重組載體WT-LINC00710、WT-PTEN、MUTLINC00710、MUT-PTEN。將A549 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，使用Lipofectamine 2000試劑分別將重組載體與miR-367 mimic 或control 共轉(zhuǎn)染到A549 細(xì)胞中。檢測(cè)培養(yǎng)48 h后細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00710、miR-367在肺癌中的表達(dá)

與癌旁組織比較，肺癌組織中LINC00710的表達(dá)水平降低，miR-367 的表達(dá)水平升高（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 LINC00710、miR-367在肺癌組織中的表達(dá)

表1 LINC00710、miR-367在肺癌組織中的表達(dá)

2.2 各個(gè)處理組對(duì)A549增殖遷移、侵襲的影響

與對(duì)照組、pcDNA3.1 組比較，pcDNA3.1-LINC 00710 組A549 細(xì)胞增殖活性降低，克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少（均P＜0.05）；與對(duì)照組比較，miR-367 mimic 組A549 細(xì)胞增殖活性升高，克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增多（均P＜0.05）；與pcDNA3.1-LINC00710 組比較，miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 組A549 細(xì)胞增殖活性升高，克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖1。

圖1 LINC00710、miR-367對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 LINC00710 靶 向miR-367 及miR-367 靶 向PTEN

DIANA Tools 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00710 與miR-367、miR-367 與PTEN 之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組和WT-LINC00710（或WT-PTEN）共轉(zhuǎn)染組比較，miR-367 mimic 和WT-LINC00710（或WT-PTEN）共轉(zhuǎn)染組A549 細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與對(duì)照組和MUT-LINC00710（或MUT-PTEN）共轉(zhuǎn)染組比較，miR-367 mimic 和MUT-LINC00710（或MUT-PTEN）共轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 miR-367與LINC00710、PTEN的靶向關(guān)系

表2 LINC00710、miR-367對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，n=3

表2 LINC00710、miR-367對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與pcDNA3.1組比較，#P＜0.05；與pcDNA3.1-LINC00710組比較，&P＜0.05。

2.4 miR-367 能減輕LINC00710 對(duì)A549 中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組、pcDNA3.1 組比較，pcDNA3.1-LINC00710 組A549 細(xì)胞miR-367 表達(dá)、Ki67 和Ncadherin 蛋白表達(dá)降低，PTEN 和E-cadherin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，miR-367 mimic組A549 細(xì)胞miR-367 表達(dá)、Ki67 和N-cadherin 蛋白表達(dá)升高，PTEN和E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與pcDNA3.1-LINC00710 組比較，miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 組A549 細(xì)胞miR-367 表達(dá)、Ki67 和N-cadherin 蛋白表達(dá)升高，PTEN和E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)表3和圖4。

圖4 PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

表3 miR-367能減輕LINC00710對(duì)A549中PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響，n=3

表3 miR-367能減輕LINC00710對(duì)A549中PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與pcDNA3.1組比較，#P＜0.05；與pcDNA3.1-LINC00710組比較，&P＜0.05。

3 討論

目前肺癌的診斷和治療方法還很有限，其治療效果欠佳[8]。已發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA 與肺癌進(jìn)展相關(guān)。如lncRNA成神經(jīng)細(xì)胞瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（NBAT-1）在肺癌組織標(biāo)本中表達(dá)較癌旁組織顯著降低，NBAT-1 低表達(dá)與患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，過(guò)表達(dá)NBAT-1可抑制A549細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。肺癌細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA X 染色體失活基因（XIST）的表達(dá)顯著高于正常人支氣管上皮細(xì)胞，抑制XIST表達(dá)可降低細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，抑制A549 異種移植小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)[10]。但lncRNA 在肺癌中的潛在分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中LINC00710 表達(dá)較癌旁組織顯著降低，與趙兵等[11]研究結(jié)論相一致。Ki67 是一種標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的核抗原，其表達(dá)水平可準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖活性[12]。E-cadherin 表達(dá)增加可維持細(xì)胞形態(tài)和黏附功能，而N-cadherin 表達(dá)增加則促進(jìn)細(xì)胞骨架發(fā)生改變，降低細(xì)胞黏附能力，使其易于脫離原發(fā)灶，向周?chē)M織侵襲轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LINC00710 可顯著降低A549 細(xì)胞存活率、克隆形成、遷移和侵襲能力，降低Ki67和E-cadherin蛋白表達(dá)水平，提高N-cadherin表達(dá)水平，表明LINC00710對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用。

miRNA 表達(dá)與腫瘤發(fā)生、耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[14]。miR-367 位于染色體4q25位點(diǎn)，骨肉瘤、胰腺癌中miR-367表達(dá)增加，miR-367高表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞遷移、侵襲具有誘導(dǎo)作用，miR-367 抑制劑可以消除這種致癌作用[15-16]。lncRNA癌易感性候選基因2（CASC2）通過(guò)下調(diào)miR-367 還可抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中miR-367 表達(dá)增加，LINC00710 對(duì)miR-367 具有靶向負(fù)調(diào)控作用。過(guò)表達(dá)miR-367可提高A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-367在肺癌中發(fā)揮致癌作用，與Xiao等[18]報(bào)道一致。PTEN已被證實(shí)在肺癌中表達(dá)降低或缺失，恢復(fù)PTEN 表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[19-20]。本研究證實(shí)，miR-367 靶向負(fù)調(diào)控PTEN 表達(dá)，與Ling 等[21]報(bào)道在黑色素瘤葡萄膜細(xì)胞中兩者靶向關(guān)系一致。本實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-367 顯著減弱LINC00710 過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用以及對(duì)PTEN 表達(dá)的促進(jìn)作用，進(jìn)一步說(shuō)明LINC00710 靶向miR-367可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，LINC00710通過(guò)靶向miR-367/PTEN軸可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這對(duì)今后肺癌基因治療具有一定的參考價(jià)值。