基于PI3K/Akt/mTOR途徑研究芒果苷對糖尿病誘導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管損傷的保護作用及機制*

華炳紅，李馥伶，陳 琳

（1.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院內(nèi)分泌代謝科，?？?570203；.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院藥學部，?？?570203）

糖尿病視網(wǎng)膜病（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的常見并發(fā)癥[1]。據(jù)估計，到2030 年全球DR 患者的數(shù)量將達到1.91 億[2]。高血糖介導(dǎo)的毛細血管損傷引起視網(wǎng)膜缺血缺氧以及玻璃體岀血，進而發(fā)生增殖性視網(wǎng)膜病變，最終導(dǎo)致失明[1]。目前的主要治療干預(yù)措施仍無法完全避免并發(fā)癥[3]。DR 的主要病理特征為視網(wǎng)膜血管閉塞性循環(huán)障礙，以及內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成[4]，因此，抑制視網(wǎng)膜血管新生是治療DR的重要手段。

芒果苷是一種雙苯毗酮類黃酮類免疫調(diào)節(jié)化合物，具有抗腫瘤、抗感染、降血糖、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷對鏈脲菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血液生化參數(shù)能夠發(fā)揮保護作用[6]。然而，芒果苷對糖尿病高糖（HG）和缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞（RRCEC）損傷是否具有保護作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在探討芒果苷對RRCEC 細胞暴露于HG/缺氧環(huán)境后增殖、遷移和血管新生能力的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 大鼠RRCEC（Procell Life Science，美國）。DMEM 細胞培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）（Clark Bioscience，美國）；芒果苷、青霉素/鏈霉素雙抗、D-（+）-葡葡萄和二甲基亞砜（DMSO）試劑（Sigma Aldrich，美國）；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）（Abcam公司，英國）；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白質(zhì)絲蘇氨酸激酶（AKT）信號通路抑制劑LY294002和激活劑胰島素樣生長因子（IGF-1）（Sigma Aldrich，美國）；抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體、抗缺氧誘導(dǎo)因子-lα（HIF-lα）抗體、抗PI3K 抗體、抗AKT 抗體、抗雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體、抗PI3K 磷酸化抗體、抗AKT 磷酸化抗體和抗mTOR磷酸化抗體（Abcam，英國）。

1.2 細胞培養(yǎng) RRCEC細胞培養(yǎng)在含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，放入含有5%CO2的37°C全濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 實驗分組和處理 將RRCRC 細胞分為9 組：對照組、HG/缺氧組、芒果苷低濃度（0.05 mmol/L）組、芒果苷中濃度（0.1 mmol/L）組、芒果苷高濃度（0.2 mmol/L）組、芒果苷中濃度+LY294002組、芒果苷中濃度+IGF-1 組、HG/缺氧+LY294002 組和HG缺 氧+IGF-1 組。各組處理如下：HG/缺氧組RRCEC 細 胞接種于含有D-（+）-葡萄糖（30 mmol/L）的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃缺氧（1%、94%N2和5%CO2）培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；芒果苷低、中、高濃度組在HG 缺氧環(huán)境中預(yù)處理后，在培養(yǎng)基中分別加入0.05 mmol/L、0.1 mmol/L和0.2 mmol/L芒果苷。芒果苷中濃度+LY294002 組在細胞培養(yǎng)基中加入0.1 mmol/L 芒果苷和PI3K/AKT 信號通路抑制劑（LY294002，40 μmol/L）；芒果苷中濃度+IGF-1組在培養(yǎng)基中加入0.1 mmol/L芒果苷和PI3K/AKT通路激活劑（IGF-1，100 ng/mL）；HG/缺氧+LY294002組和HG/缺氧+IGF-1 組按上述劑量分別在培養(yǎng)基中加入LY294002 和IGF-1，均37 ℃下干預(yù)24 h。對照組細胞用相同濃度DMSO處理。

1.4 Western blotting 檢測HIF-1α、VEGF、p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR蛋白表達 將RRCEC 細胞接種于6 孔板中（1×106個/孔），如前所述處理。PBS 清洗3 次，每孔加入90 μL 裂解緩沖液+10 μL蛋白酶抑制劑對樣本進行勻漿，冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min 離心20 min。BCA 法檢測樣本蛋白含量，煮沸變性。應(yīng)用SDS-PAGE 凝膠對40 μg 總蛋白進行電泳。濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，8%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白1 h，4 ℃下分別用抗VEGF（1∶1 000）、抗HIF-lα（l∶500），抗PI3K（1∶1 000）、抗AKT（1∶10 000）、抗mTOR（1∶1 000）、抗p-PI3K（1∶500）、抗p-AKT（1∶5 000）、抗p-mTOR（1∶1 000）和抗β-actin（1∶1 000）抗體孵育過夜。隨后，將膜與山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）或山羊抗鼠IgG二抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h，采用ECL 化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，Image-Pro Plus 6.0進行灰度分析。

1.5 CCK-8 實驗評估細胞增殖 芒果苷的最佳濃度參照文獻[7]。RRCEC 細胞在HG 和缺氧預(yù)處理后，用芒果苷分別在37 ℃進行濃度梯度（0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、l mmol/L和10 mmol/L）和時間梯度（24 h、48 h、72 h）干預(yù)。根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書，以每孔1 500個細胞接種于96孔板內(nèi)，每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔。細胞按照上述方式處理后，每孔加入CCK-8 試劑，混勻后在37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。采用酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度值（OD值）。

1.6 成管實驗評估血管新生 96 孔板每孔中加入60 μL 預(yù)先冷卻的Matrigel 基質(zhì)膠，37 ℃凝固1 h。各組細胞胰酶消化后計數(shù)，每孔加入細胞（5×104個/mL），缺氧條件下培養(yǎng)6 h，然后轉(zhuǎn)移到常氧條件下培養(yǎng)12 h。用芒果苷（0.05 mmol/L、0.1 mmol/L 和0.2 mmol/L）在缺氧條件下處理細胞24 h，利用倒置相差顯微鏡，在5 個隨機選擇的視野中觀察血管生成情況。

1.7 劃痕實驗評估細胞遷移 各組RRCEC細胞接種于6 孔板中（5×105個細胞/孔）。100%聚集后，用無菌微量移液槍頭在每個細胞單層上整齊劃岀劃痕，PBS清洗除去細胞碎片。用芒果苷（0.05 mmol/L、0.1 mmol/L和0.2 mmol/L）在37 ℃和缺氧條件下處理細胞24 h。使用倒置相差顯微鏡在24 h內(nèi)3個不同時間點觀察劃痕的恢復(fù)程度。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey's post hoc檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芒果苷對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC活性和增殖的影響 與對照組相比，0.01～10 mmol/L 濃度芒果苷均可抑制RRCEC的活性（P＜0.001），具有濃度依賴性；隨著芒果苷干預(yù)時間的增加，細胞活性逐漸增加（P＜0.001）；但0.1 mmol/L芒果苷處理48 h時，與對照組相比，細胞活力未見明顯改變（P＞0.05），見圖1A。CCK8結(jié)果顯示，與對照組相比，HG/缺氧組RRCEC 細胞增殖能力明顯增強（P＜0.05），而與HG/缺氧組相比，芒果苷各濃度組對RRCEC細胞增殖能力均無明顯差異（P＞0.05），見圖1B。

圖1 芒果苷對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞活性和增殖的影響

2.2 芒果苷對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HG/缺氧組細胞相對遷移距離顯著增加（P＜0.01）；與HG/缺氧組相比，芒果苷低、中、高濃度組細胞遷移距離減少（P＜0.05），各芒果苷濃度組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 芒果苷對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞遷移的影響（×50）

2.3 芒果苷對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞血管新生的影響 成管實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HG/缺氧組微管長度變長，分支數(shù)增多，血管新生能力顯著增強（P＜0.05）；與HG/缺氧組相比，芒果苷中、高濃度組細胞中HIF-1α 和VEGF 的蛋白表達均降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 芒果苷對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞血管新生的影響

2.4 芒果苷可抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的活性 與對照組相比，HG/缺氧組細胞中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K 和p-mTOR/mTOR 的比值升高（P＜0.05）；與HG/缺氧組相比，芒果苷中濃度組p-AKT/AKT、p-PI3K/ PI3K 和p-mTOR/mTOR 的比值下降（P＜0.05），芒果苷低濃度組僅p-PI3K/PI3K 的比值下降（P＜0.05），而芒果苷高濃度組與HG/缺氧組相比無明顯差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 芒果苷抑制HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路激活

2.5 PI3K/AKT/mTOR激動劑和抑制劑對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞遷移和血管生成的影響 劃痕實驗（圖5A）結(jié)果顯示，與HG/缺氧組相比，芒果苷中濃度組和HG/缺氧+LY294002 組RRCEC 遷移能力減弱（P＜0.05）；與芒果苷中濃度組相比，芒果苷中濃度+LY294002 組細胞遷移能力減弱（P＜0.05）。而與HG/缺氧組相比，HG/缺氧+IGF-1 組細胞的遷移能力增強（P＜0.05）；與芒果苷中濃度組相比，芒果苷中濃度+IGF-1 組細胞遷移增強（P＜0.05）。成管實驗（圖5B）表現(xiàn)岀與遷移實驗相似的結(jié)果，與HG/缺氧組相比，芒果苷中濃度組和HG/缺氧+LY294002 組分支點數(shù)量減少；與芒果苷中濃度組相比，芒果苷中濃度+LY294002 組分支點數(shù)減少。而與HG/缺氧組相比，HG/缺氧+IGF-1 組新生血管和分支點數(shù)增多；芒果苷中濃度+IGF-1組血管新生較芒果苷中濃度組增加。

圖5 PI3K/AKT/mTOR激動劑和抑制劑對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞遷移和血管生成的影響

3 討論

長期暴露于高血糖和缺氧環(huán)境被認為是DR血液-視網(wǎng)膜屏障和微血管損傷的主要原因[8]。由于DR 的發(fā)病機制復(fù)雜，目前的治療干預(yù)措施無法完全避免DR 的發(fā)生。因此，探索DR 的病理機制，尋找新型藥物來降低DR的發(fā)病率和致盲率己成為當前重要的研究方向。DR病理改變的主要原因是糖尿病導(dǎo)致的微血管內(nèi)血流動力學異常對視網(wǎng)膜微血管的損害。由于糖尿病對血管和血液因素的影響導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管閉塞，發(fā)展為視網(wǎng)膜缺血缺氧，引起視網(wǎng)膜釋放大量血管生長因子，通過內(nèi)皮細胞的缺氧信號促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而引起新生血管的形成[4]。鑒于此，本研究將RRCEC 置于HG/缺氧環(huán)境中，模擬DR 體外細胞模型，研究在不同條件下RRCEC細胞增殖、遷移和血管新生的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HG/缺氧條件下RRCEC細胞的增殖、遷移和血管新生能力均明顯高于對照組，這些結(jié)果與DR的主要病理特征相符。

芒果苷是一種天然的多酚酸類化合物，廣泛存在于漆樹科芒果的果實、葉、皮中。研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷對高血糖和糖尿病表現(xiàn)岀明顯的藥理保護作用，可減少糖尿病大鼠血清中炎癥因子的釋放，抑制氧化應(yīng)激，同時能夠顯著改善糖尿病患者的胰島素敏感度和血糖水平[9]。Deng 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷可通過阻斷PI3K/AKT 通路抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。但芒果苷與糖尿病HG/缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮損傷之間的關(guān)系尚未可知。內(nèi)皮細胞增殖和遷移是血管生成的標志之一。本研究結(jié)果顯示，芒果苷（0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L）對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC 增殖活性未表現(xiàn)出抑制作用，但可明顯降低RRCEC的遷移和新生血管形成。這與Daud 等[11]的研究結(jié)果一致，體外實驗中芒果苷可增加主動脈內(nèi)皮細胞的遷移，但對細胞增殖沒有影響。

HIF-lα 是調(diào)控缺氧的重要因子，可作為轉(zhuǎn)錄因子與VEGF 啟動子結(jié)合，促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和血管新生[12]。VEGF作為目前發(fā)現(xiàn)最強的促血管生成因子，參與視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管新生[13]。而且，HIF-1α 和VEGF 的表達在介導(dǎo)活躍的視網(wǎng)膜血管生成和緩解DR的進展中發(fā)揮主要作用。臨床試驗也證實，抗血管內(nèi)皮生長因子藥物可用于治療眼部疾病的血管生成。本研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷對HG/缺氧誘導(dǎo)RRCEC 細胞的管腔形成具有明顯的抑制作用；中濃度和高濃度芒果苷治療后，HIF-lα 和VEGF 蛋白表達較HG/缺氧組明顯降低，然而低濃度芒果苷對此未產(chǎn)生明顯影響，因此合適濃度的芒果苷可顯著降低HG/缺氧誘導(dǎo)RRCEC細胞遷移。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路在多種血管疾病中發(fā)揮促進作用[14]。磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸在PI3K催化下生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），激活下游AKT 的磷酸化，進而激活mTOR[15]。PI3K/AKT/mTOR信號通路在調(diào)節(jié)DR中的HIF-1α/VEGF信號表達中起著至關(guān)重要的作用[16]。值得注意的是，Sasore 等[14]報道，PI3K/AKT/mTOR 信號通路通過誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成來促進DR的發(fā)生、發(fā)展；芒果苷可通過激活大腦中的PI3K/AKT/mTOR 信號通路減少氧化應(yīng)激，對腦血管內(nèi)膜產(chǎn)生保護作用。鑒于此，本課題組推測芒果苷可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路來防止DR 過程中視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)膜增生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于HG/缺氧組，中濃度芒果苷干預(yù)可顯著降低p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K 和p-mTOR/mTOR 的比值。表明芒果苷可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活緩解HG/缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜毛細血管損傷，中濃度（0.1 mmol/L）可能是最適濃度。高濃度芒果苷并沒有降低HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC 細胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平。筆者推測高濃度芒果苷可能激活或抑制其它上游信號通路，以降低PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平。因此，需要進一步實驗證實高濃度芒果苷對PI3K/AKT信號通路上游成分的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，給予RRCEC細胞PI3K/AKT 信號通路特異性抑制劑LY294002處理，可產(chǎn)生與芒果苷同樣的效果，進一步對細胞的遷移和血管新生能力產(chǎn)生抑制作用。IGF-1 對PI3K/AKT信號通路的激活則可明顯減弱芒果苷對RRCEC 細胞遷移和血管新生的保護作用。以上結(jié)果表明，PI3K/AKT/mTOR 信號通路在糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管損傷中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，而中濃度芒果苷可通過此途徑對HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞損傷產(chǎn)生較好的保護作用。

綜上所述，芒果苷可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，顯著降低HG/缺氧誘導(dǎo)的RRCEC細胞遷移和血管生成能力，芒果苷可能是治療DR的有效藥物。