海參酶酵液對小鼠急性酒精性肝損傷的作用*

孫東映，韋錦斌

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南寧 530031；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021）

酗酒已成為當(dāng)今世界備受關(guān)注的健康問題，造成了重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，我國酗酒人數(shù)逐年上升并且逐漸年輕化，導(dǎo)致酒精性肝損傷的發(fā)病率不斷升高[1]。酒精性肝損傷的形成是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，初期癥狀以酒精性脂肪肝為主，逐漸進(jìn)展為酒精性肝炎和酒精性肝硬化，直至肝功能衰竭[2-3]。目前，酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。戒酒、藥物治療以及外科肝移植依舊是酒精性肝損傷的主要干預(yù)措施[4]。海參是廣泛分布于全世界各大洋中的一類無脊椎海洋生物，同時(shí)也是調(diào)節(jié)海洋生態(tài)系統(tǒng)的最重要的物種之一[5]。海參除了含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分外，還富含多種生物活性物質(zhì)，如海參多糖、三萜皂苷、海參肽、膠原蛋白、脂類物質(zhì)等[6-8]。研究表明，海參具有抗氧化、抗炎、提高免疫、抗腫瘤、降脂、抗血栓、保肝、延緩衰老等藥理作用[9]。本研究通過酒精灌胃法建立急性酒精性肝損傷小鼠模型，以保肝藥物水飛薊賓為陽性藥物作為對比，研究海參酶酵液（HSMJY）對急性酒精性肝損傷的作用，為HSMJY 應(yīng)用于急性酒精性肝損傷的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級昆明小鼠，雄性，體重（20±2）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2020-0003，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（桂）2020-0004。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)原則。

1.2 藥物 HSMJY由廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供，批號：20220104。250 g生海參（大連產(chǎn)刺參，去除內(nèi)臟），先用蛋白酶酶解，后用益生菌發(fā)酵，得到960 mL 的HSMJY，海參含量為26%。水飛薊賓膠囊購自天津天士力圣特制藥有限公司，批號：150711078。

1.3 主要試劑和儀器 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、蛋白定量（TP）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒均購自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司；無水乙醇（AR）購自廣東光華科技股份有限公司。

高速冷凍離心機(jī)（德國Hettich UNIVERSAL，型號320R臺(tái)式）；電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，型號GZX-DH 400-S-II）；-80 ℃超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司，型號DW-86L628）；全波長全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher，型號Multiskan Go）。

1.4 動(dòng)物分組、給藥及造模 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊賓組（50 mg/kg）、HSMJY 高劑量（HSMJY-H）組（7.8 g/kg）、HSMJY 中劑量（HSMJY-M）組（5.2 g/kg）、HSMJY低劑量（HSMJY-L）組（2.6 g/kg），每組10 只。實(shí)驗(yàn)第1～9 天：各給藥組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，正常組與模型組灌胃給予等體積的蒸餾水，1 次/d，連續(xù)9 d。第9～12天：即實(shí)驗(yàn)第9天起，每天上午正常給予相應(yīng)劑量藥物，1 h 后除正常組外，其余組小鼠灌胃40%乙醇溶液（10 mL/kg），連續(xù)4 d。造模參考Song 等[10-11]方法改良，建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，同時(shí)正常組小鼠灌胃等體積蒸餾水。

1.5 標(biāo)本制備 末次給予乙醇溶液后，禁食不禁水4 h。摘眼球取血，室溫靜置2 h，3500 r/min 離心10 min，取上層血清分裝于不同EP 管內(nèi)，保存于-80 ℃冰箱中備用。取血后頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取肝臟組織，稱重。用4%多聚甲醛固定部分肝臟組織，留待病理檢測；其余肝組織加入9倍量生理鹽水制備10%肝勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液分裝，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.6 肝臟指數(shù)檢測 迅速解剖后取出肝臟，用0.9%生理鹽水洗去血液，濾紙吸凈后稱定肝臟重量，計(jì)算小鼠肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)＝肝臟重量（g）/體重（g）×100%。

1.7 生化指標(biāo)測定 檢測各組小鼠血清AST、ALT含量，測定肝臟組織SOD 活性及MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α含量，具體實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 肝臟組織病理學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)透明、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，行蘇木精—伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSMJY對小鼠肝臟指數(shù)及血清肝功能酶學(xué)指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)和血清AST、ALT活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，HSMJY-H 組、HSMJY-M 組及水飛薊賓組小鼠肝臟指數(shù)和AST、ALT活性降低（P＜0.05），見表1。

表1 HSMJY對小鼠肝臟指數(shù)及血清AST、ALT水平的影響n=10，

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.2 HSMJY對小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 正常組小鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞核清晰可見，位于細(xì)胞中央，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無明顯的脂肪泡、或變性壞死，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等、數(shù)量較多的圓形脂肪空泡（脂滴），出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，少部分肝細(xì)胞核固縮，表明急性酒精性肝損傷模型復(fù)制成功；與模型組比較，水飛薊賓組及HSMJY各劑量組的小鼠肝臟組織的病理損傷均有改善，并且以高劑量的作用效果較好，見圖1。

2.3 HSMJY對小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟抗氧化酶SOD活性降低，MDA 含量顯著升高（均P＜0.01）；與模型組比較，HSMJY 及水飛薊賓可顯著提高SOD 活力，降低MDA含量（P＜0.01），見表2。

表2 HSMJY對小鼠SOD活性和MDA含量的影響n=10，

表2 HSMJY對小鼠SOD活性和MDA含量的影響n=10，

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

2.4 HSMJY對小鼠肝臟炎癥指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HSMJY 中、高劑量及水飛薊賓均可降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量（P＜0.05），見表3。

表3 HSMJY對小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響n=10，

表3 HSMJY對小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響n=10，

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

本研究通過直接酒精灌胃方法構(gòu)建小鼠急性酒精性肝損傷模型，該方法具有周期短、容易復(fù)制、穩(wěn)定性好、死亡率低等優(yōu)點(diǎn)，與人類在短時(shí)間內(nèi)大量飲酒所致的肝臟損傷特點(diǎn)相似；并且以肝臟及血液中一些化學(xué)指標(biāo)的變化為主要特征，為進(jìn)一步研究急性酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制以及后續(xù)保肝藥物研究與開發(fā)提供了一種可行方法。

肝臟指數(shù)可反映肝臟腫大的程度，而肝臟腫大則被認(rèn)為是酒精性肝損傷的一種常見臨床表現(xiàn)[12]。AST、ALT是肝功能評估中敏感的生化指標(biāo)[13]，主要分布于肝細(xì)胞質(zhì)中，臨床上利用這兩個(gè)指標(biāo)水平來代表肝損傷的嚴(yán)重程度，一般情況下，當(dāng)肝臟受到某些有害因素的影響，肝細(xì)胞被破壞，肝臟受損，導(dǎo)致大量AST和ALT被釋放入血，促使血液中AST和ALT 水平顯著提高[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠較正常組肝臟指數(shù)及血清AST、ALT 水平顯著升高，表明肝細(xì)胞受到損傷，急性酒精性肝損傷模型成功建立。HSMJY 各劑量組對急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟腫脹有一定抑制作用，能改善肝臟病變，使血清AST、ALT活性恢復(fù)正常，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)模型組中小鼠肝臟發(fā)生損傷，其肝臟組織病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，肝細(xì)胞索排列紊亂，出現(xiàn)較多的脂滴（脂肪堆積的明顯特征），出現(xiàn)了炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，少部分肝細(xì)胞核固縮。不同劑量HSMJY 干預(yù)可以改善這些異常改變，減少肝臟損傷。

氧化應(yīng)激在急性酒精性肝損傷病程的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。酒精在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），造成機(jī)體的氧化及抗氧化防御功能失衡，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激，是急性酒精性肝損傷產(chǎn)生和發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制[15]。SOD和MDA均會(huì)受到氧化應(yīng)激條件的影響。SOD 活性的降低將引起氧自由基的累積，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞損傷，間接對機(jī)體清除氧自由基的能力產(chǎn)生影響。MDA 作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，不僅可以反映人體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平，還能間接地反映人體肝細(xì)胞的損傷程度[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟中SOD活性顯著降低，同時(shí)MDA的含量明顯升高，表明在模型組小鼠體內(nèi)發(fā)生了較為嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。然而，HSMJY 干預(yù)處理可顯著提高小鼠肝臟中SOD 活性，減少肝臟中MDA 的含量。這一結(jié)果表明，HSMJY 可增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化能力，具有良好的抗氧化應(yīng)激能力，進(jìn)而減少酒精所誘導(dǎo)的急性肝臟損傷，這可能與其所含的抗氧化成分有關(guān)。

在酒精性肝損傷情況下，不僅氧化應(yīng)激系統(tǒng)發(fā)生異常，還常常伴有炎癥反應(yīng)的發(fā)生。炎癥反應(yīng)對肝臟造成損傷，炎癥細(xì)胞激活后分泌的大量炎癥因子對酒精所誘導(dǎo)的急性肝損傷進(jìn)程起到十分重要的作用。炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)性損傷，進(jìn)而發(fā)展為肝纖維化甚至肝功能衰竭[17]。在機(jī)體受到酒精的刺激后，會(huì)誘發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放，包括TNFα、IL-1β和IL-6等[18]，而這些促炎細(xì)胞因子可引發(fā)脂肪變性，造成肝細(xì)胞炎性損傷及凋亡，加速急性酒精性肝損傷的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量較低，急性酒精性肝損傷可顯著增加這些炎癥因子，提示IL-1β、IL-6和TNF-α可能參與了急性酒精性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展。而HSMJY 能顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α的水平，表明HSMJY 還可能通過抗炎作用從而發(fā)揮抗急性酒精性肝損傷作用。

海洋生物因獨(dú)特而豐富的生理和藥理活性而受到關(guān)注，用于開發(fā)新型食品及藥物具有巨大潛力。本研究所采用的HSMJY 與傳統(tǒng)海參食品比較，酶解發(fā)酵可將海參大分子蛋白分解為易吸收的小分組蛋白質(zhì)、寡肽、小肽和游離氨基酸等，所得產(chǎn)物具有活性成分豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，穩(wěn)定性和溶解性良好，易于消化和吸收，食用安全等特點(diǎn)。HSMJY中不僅含有海參多肽，而且還含有其他一些活性強(qiáng)的化合物，如多糖、皂苷及腦苷脂等。近年來，關(guān)于海參提取物各種生物活性已在多種干預(yù)處理模型中均有過報(bào)道。本研究主要評價(jià)了HSMJY在小鼠體內(nèi)抗急性酒精性肝損傷活性，并未明確分析其具體起作用的活性組分，因此后續(xù)將做進(jìn)一步研究。

綜上所述，HSMJY對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。