鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的制備及其對炎性內(nèi)皮細(xì)胞的改善作用*

莫瑩瑩，李京濤，梁彬彬，吳 棘

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，南寧 530021）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種危害人類健康的慢性心血管疾病，是導(dǎo)致冠心病、腦梗死和外周血管疾病的高危因素[1-2]。RhoA/ROCK通路調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，包括細(xì)胞遷移、應(yīng)力纖維形成、收縮性和膜突起，導(dǎo)致AS進(jìn)展[3]。鹽酸法舒地爾是目前應(yīng)用于臨床的RhoA/ROCK 通路選擇性阻斷劑，在臨床上對于心絞痛、腦動(dòng)脈及冠狀動(dòng)脈痙攣等心腦血管疾病有較好的治療效果[4-5]。但鹽酸法舒地爾生物利用性低，體內(nèi)半衰期短[6]，治療指數(shù)也隨之降低。脂質(zhì)體是臨床上應(yīng)用最成功的納米藥物載體[7]，在腫瘤等疾病的臨床治療中得到應(yīng)用，其具有靶向性、緩釋性、提高藥物穩(wěn)定性、降低藥物毒性等優(yōu)點(diǎn)[8]。目前國內(nèi)、外對于鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的制備工藝的優(yōu)化及其作用評價(jià)研究較少，本研究擬優(yōu)化鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的制備方法，并評價(jià)其對于血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的炎性保護(hù)作用，為AS的預(yù)防及治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波細(xì)胞破碎儀（Bioruptor Plus，比利時(shí)）；Nicomp PSS 380ZLS 激光納米粒度儀（美國）；EVOS FL Auto 顯微鏡（美國Life Technologies公司）；超高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN COULTER，美國）；全波長酶標(biāo)讀數(shù)儀（Multiskan GO，美國Thermo）；Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（IC1000，中國上海）；UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津）。

1.2 主要試劑 膽固醇、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、CCK8試劑盒、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）試劑盒、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPE-PEG2000-COOH）（湖南華騰制藥有限公司）；鹽酸法舒地爾原料藥（上海源葉生物科技有限公司）；即用型CE 膜透析袋（美國光譜醫(yī)學(xué)公司）；HUVECs 及內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基ECM（美國Sciencell 公司）；Ang Ⅱ（美國Sigma 公司）；DiI 熒光染料試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；一氧化氮（NO）測定試劑盒（南京建成生物有限公司）。

1.3 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體。按一定比例稱量DPPC、膽固醇、DSPE-PEG2000-COOH，將混合物用氯仿水浴超聲充分溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器35 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其在瓶底形成均勻的薄膜，放在真空干燥機(jī)中干燥過夜。通過主動(dòng)載藥法或被動(dòng)載藥法來包載藥物。被動(dòng)載藥法中，用PBS緩沖液稀釋的鹽酸法舒地爾并結(jié)合水浴超聲將瓶底的薄膜水化成懸濁液，用超聲細(xì)胞破碎儀超聲10 min（4 ℃，5 s/5 s，on/off，320 W，60 個(gè)循環(huán)），在4℃超聲后用3 000 r/min 離心去除大分子物質(zhì)，立即吸取上清液轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)（透析袋截留分子量1 000 D），用PBS緩沖液透析24 h以除去未包封的藥物。用同樣的方法制備空白對照脂質(zhì)體（脂質(zhì)體內(nèi)包封的是PBS緩沖液）。主動(dòng)載藥法中，先用醋酸鈣溶液水化干燥的薄膜成懸濁液并用0.9%氯化鈉溶液透析至適宜的跨膜梯度，將藥物在一定溫度下孵育，用超聲細(xì)胞破碎儀均一粒徑后離心并透析。制備的脂質(zhì)體在4 ℃下保存，以備后續(xù)研究。

1.4 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的質(zhì)量評價(jià) 取少量制備好的鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體，光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)及分布情況，PSS 納米粒度儀測定脂質(zhì)體的平均粒徑及平均電位。

用直接法測定載藥脂質(zhì)體的包封率，10μL 脂質(zhì)體經(jīng)990 μL 甲醇裂解后超聲30 min，離心（10 000 r/min，10 min），將藥物從脂質(zhì)體中分離，用紫外分光光度計(jì)在320 nm 測定上清液中鹽酸法舒地爾的含量，可得到包封于脂質(zhì)體內(nèi)法舒地爾的質(zhì)量，同時(shí)將一定量制備好的鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體凍干并稱量，即可得鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體總質(zhì)量，根據(jù)以下公式計(jì)算包封率和載藥量：包封率（%）=包封于脂質(zhì)體內(nèi)的法舒地爾質(zhì)量/投入的法舒地爾總質(zhì)量；載藥量（%）=包封于脂質(zhì)體內(nèi)的法舒地爾質(zhì)量/鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體總質(zhì)量。

在透析袋內(nèi)加入2 mL鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體，放入50 mL 離心管內(nèi)，加入20 mL PBS 緩沖液（pH=7.4），于37 ℃搖床（100 r/min）進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。分別于0.2 h、0.4 h、0.8 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、12 h、24 h取樣5 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量的PBS緩沖液。用同體積PBS 稀釋的鹽酸法舒地爾作鹽酸法舒地爾組。用紫外分光光度計(jì)（320 nm）測量取出藥物濃度，計(jì)算藥物累積釋放率。

1.5 體外細(xì)胞攝取 采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的攝取情況。配制濃度為10 μmol/L的DiI熒光染料，將鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體與DiI 染料避光孵育20 min，于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，除去游離染料，沉淀重懸即制成帶熒光的脂質(zhì)體。將HUVECs接種于6孔板中，待細(xì)胞生長貼壁80%～90%后，加入500 μL 熒光脂質(zhì)體及1 mL 完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)空白對照孔（只加完全培養(yǎng)基），孵育2 h 后PBS 沖洗3 次，胰酶消化，1 000 r/min 離心3 min，PBS 重懸后用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 將HUVECs細(xì)胞隨機(jī)分為4組，（1）對照組：培養(yǎng)液中只加等量的培養(yǎng)液；（2）AngⅡ組：培養(yǎng)液中加入10-7mol/L Ang Ⅱ；（3）載藥脂質(zhì)體組：培養(yǎng)液中加入0.1 mg/mL鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體培養(yǎng)8 h，再加入10-7mol/L Ang Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)；（4）空白脂質(zhì)體組：培養(yǎng)液中加入0.1 mg/mL 空白法舒地爾脂質(zhì)體培養(yǎng)8 h，再加入10-7mol/L Ang Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 CCK8 法檢測細(xì)胞活力 將HUVECs 細(xì)胞接種于96孔板中，取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化，完全培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液，待細(xì)胞生長貼壁80%～90%后，分組處理細(xì)胞（每組6個(gè)副孔），另設(shè)空白調(diào)零孔（不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液），培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK8 緩沖液10μL，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h 于酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光值。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO 含量檢測 將HUVECs細(xì)胞接種于6 孔板中，分組處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。采用硝酸還原法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)上清液VCAM-1、ICAM-1含量檢測 將HUVECs細(xì)胞接種于6孔板中，分組處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VCAM-1和ICAM-1蛋白水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體制備的優(yōu)化 在醋酸鈣濃度120 mmol/L、孵育時(shí)間30 min、孵育溫度60 ℃條件下，不同藥脂比的主動(dòng)載藥法（即醋酸鈣梯度法）包封率較被動(dòng)載藥法升高（P＜0.01），見表1。

表1 主動(dòng)載藥法與被動(dòng)載藥法包封率比較，n=3

表1 主動(dòng)載藥法與被動(dòng)載藥法包封率比較，n=3

與被動(dòng)載藥法比較，#P＜0.01。

在相同的條件下，隨著醋酸鈣濃度增高，脂質(zhì)體的包封率也逐漸增高；相同條件下藥脂比為1∶15時(shí)包封率最高，加大藥物投放時(shí)包封率逐漸下降；相同條件下孵育時(shí)間為30 min時(shí)包封率最高，當(dāng)孵育時(shí)間延長至90 min 時(shí)，包封率下降；相同條件下孵育溫度在60 ℃時(shí)包封率最高，見表2。綜合考慮制備成本及脂質(zhì)體穩(wěn)定性的問題，最終的制備方案為醋酸鈣梯度法，醋酸鈣濃度120 mmol/L，藥脂比為1∶10，孵育時(shí)間30 min，孵育溫度60 ℃，所制備的脂質(zhì)體包封率為（91.48±5.64）%，載藥量為（41.86±2.35）%。

表2 相同條件下不同醋酸鈣濃度、不同藥脂比、不同孵育時(shí)間和不同孵育溫度包封率比較，n=3

表2 相同條件下不同醋酸鈣濃度、不同藥脂比、不同孵育時(shí)間和不同孵育溫度包封率比較，n=3

a 條件為藥脂比1∶10，孵藥時(shí)間30 min，孵藥溫度60 ℃；b條件為醋酸鈣濃度120 mmol/L，孵藥時(shí)間30 min，孵藥溫度60 ℃；c條件為醋酸鈣濃度120 mmol/L，藥脂比1∶10，孵藥溫度60 ℃；d 條件為醋酸鈣濃度120 mmol/L，藥脂比1∶10，孵藥時(shí)間30 min。

2.2 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體表征 光學(xué)顯微鏡下可見鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體分布均勻（圖1）。激光納米粒度儀測定結(jié)果顯示：載藥脂質(zhì)體的平均粒徑為（185.12±20.90）nm，粒徑分布均勻（圖2），平均電位為（-25.22±1.23）mV，表面較高的負(fù)電產(chǎn)生靜電排斥作用，避免了脂質(zhì)體之間發(fā)生聚集現(xiàn)象，有利于脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性。

圖1 光鏡下鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體形態(tài)分布（×400）

圖2 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體粒徑分布

2.3 脂質(zhì)體體外模擬釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果 鹽酸法舒地爾在1 h 釋藥72.63%，在5 h 基本釋放全部的藥物，達(dá)到平臺期；而鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體在1 h 僅釋放37.93%，12 h 達(dá)到平臺期，24 h 可釋放87.62%的藥物，從而達(dá)到緩釋效果，見圖3。

圖3 體外模擬釋藥曲線

2.4 細(xì)胞攝取 流式細(xì)胞儀檢測顯示熒光強(qiáng)度約為39.30%，說明脂質(zhì)體可被細(xì)胞攝取，見圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測HUVECs對脂質(zhì)體的攝取率

2.5 脂質(zhì)體對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活力影響 對照組細(xì)胞存活率為100%，Ang Ⅱ組細(xì)胞存活率為（69.31±3.00）%，載藥脂質(zhì)體組細(xì)胞存活率為（88.38±1.86）%，空白脂質(zhì)體組細(xì)胞存活率為（67.92±3.98）%。與對照組比較，Ang Ⅱ組、載藥脂質(zhì)體組、空白脂質(zhì)體組細(xì)胞存活率均降低（均P＜0.01，n=6）；與Ang Ⅱ組比較，載藥脂質(zhì)體組細(xì)胞存活率升高（P＜0.01，n=6）。

2.6 各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO、VCAM-1、ICAM-1含量比較 與對照組比較，Ang Ⅱ組、載藥脂質(zhì)體組、空白脂質(zhì)體組NO 含量降低，ICAM-1、VCAM-1 含量升高（均P＜0.01）；與Ang Ⅱ組比較，載藥脂質(zhì)體組NO 含量升高，VCAM-1、ICAM-1 含量降低（均P＜0.01）；空白脂質(zhì)體組與Ang Ⅱ組NO、VCAM-1 和ICAM-1 含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO、ICAM-1、VCAM-1含量比較，n=6

表3 各組HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO、ICAM-1、VCAM-1含量比較，n=6

與對照組比較，#P＜0.01；與Ang Ⅱ組比較，*P＜0.01。

3 討論

目前，靶向給藥已成為疾病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，脂質(zhì)體日益被視為靶向藥物傳遞系統(tǒng)的理想載體[9]。由于鹽酸法舒地爾是弱酸性親水分子（pH 為4.5～6.0），在脂類制劑中包封的效率較低，主動(dòng)載藥法可高效提高弱酸或弱堿性的親水性藥物的包封率。醋酸鈣梯度法屬于主動(dòng)載藥法中的一種，其有利于弱酸性藥物的脂質(zhì)體包載，醋酸鈣梯度可誘導(dǎo)產(chǎn)生pH 梯度，高效驅(qū)動(dòng)弱酸性藥物使其從脂質(zhì)體的外水相主動(dòng)進(jìn)入到內(nèi)水相，因此達(dá)到優(yōu)化包封率的效果[10]。本研究通過比較被動(dòng)和主動(dòng)載藥法，改變藥脂比、醋酸鈣濃度、孵藥時(shí)間及溫度，優(yōu)化了鹽酸法舒地爾在脂質(zhì)體中的包封率，使其成為包封率及載藥量高的納米制劑，并可成功被HUVECs攝取。緩釋效應(yīng)是脂質(zhì)體制劑的重要特征之一，可延長藥物的消除半衰期，延長血液循環(huán)時(shí)間，提高藥物利用率和藥物治療指數(shù)。鹽酸法舒地爾在人體內(nèi)的半衰期相對較短，約為2～3 h 左右，藥效持續(xù)時(shí)間較短。本研究體外模擬釋藥結(jié)果表明，與鹽酸法舒地爾比較，鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的緩釋特征更為明顯。

RhoA/ROCK 通路參與AS 炎性反應(yīng)的多個(gè)階段[11-13]。血管氧化應(yīng)激反應(yīng)和NO在AS的早期發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用[14]，內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）生物活性減低是內(nèi)皮功能損傷的表現(xiàn)[15]，在生理?xiàng)l件下eNOS 產(chǎn)生NO。炎癥因子如ICAM-1、VCAM-1通過促進(jìn)細(xì)胞黏附，參與AS發(fā)展的全過程[16]。鹽酸法舒地爾通過特異性抑制RhoA/ROCK 信號通路，抑制炎癥細(xì)胞浸潤，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并上調(diào)eNOS 表達(dá)，促進(jìn)NO 生成。Ang Ⅱ在AS 病理生理中起著核心作用[17]。Ang Ⅱ作為血管活性肽，對于血管的影響包括調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞遷移和增殖[18]，并通過促進(jìn)斑塊的破裂和高血栓的形成狀態(tài)加速AS 進(jìn)展。研究表明，Ang Ⅱ可破壞HUVECs活力、功能及細(xì)胞骨架等，在AS發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[19]。本研究采用Ang Ⅱ誘導(dǎo)HUVECs 成功建立炎性細(xì)胞模型，載藥脂質(zhì)體組與Ang Ⅱ組比較，NO 含量升高，VCAM-1、ICAM-1 含量降低，表明載藥脂質(zhì)體中釋放的鹽酸法舒地爾能夠?qū)ng Ⅱ誘導(dǎo)的炎性內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)及改善作用。空白脂質(zhì)體組與Ang Ⅱ組比較，未見明顯差異，表明空白脂質(zhì)體對于炎性細(xì)胞無明顯改善作用。

綜上，本研究所制備的鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體對炎性內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可降低其炎性反應(yīng)及Ang Ⅱ?qū)?nèi)皮細(xì)胞的損害。