廣西毛冬青根對放射腦損傷小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用及其機(jī)制研究*

張馨月，李 婷，何改改，滕雨夢，黎 瑩，王紹軍，韋 力△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；3.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，南寧 530005）

頭頸部腫瘤作為危害人類健康的主要疾病之一，其發(fā)病率位于全球惡性腫瘤的前列，占所有癌癥總?cè)藬?shù)的5.3%[1]。目前，臨床上常采用放射治療作為頭頸部腫瘤主要的治療方法，在提高患者生存率的同時(shí)，也帶來了許多并發(fā)癥，如頭痛、惡心、口干、記憶功能減退等，其中，認(rèn)知障礙是頭頸部腫瘤放療后嚴(yán)重并發(fā)癥，很大程度上影響患者的生活質(zhì)量，但目前其具體發(fā)病機(jī)制尚未明確[2]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，抗離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba-1）是小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，在腦損傷狀態(tài)下，星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1表達(dá)增強(qiáng)[3-5]。本課題組前期研究表明，放射可以促進(jìn)小鼠海馬區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)放射誘導(dǎo)活化的膠質(zhì)細(xì)胞在認(rèn)知功能障礙發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起重要作用[6]，雖然其機(jī)制尚未清楚，但也為防治放射腦損傷提供新的途徑。

廣西毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Arn.var.kwangsiensis Hand-Mazz）為本屬植物毛冬青變種，主產(chǎn)于廣西百色和凌云，具有舒張血管、清熱解毒、抗血栓及抗炎等作用[7-8]。有研究表明，毛冬青能夠減輕炎癥反應(yīng)，緩解神經(jīng)細(xì)胞水腫，對腦缺血梗死損傷起到保護(hù)作用[9-10]。然而，毛冬青是否能夠通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞活性及狀態(tài)，改善放射誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙，目前鮮少報(bào)道。本研究通過建立放射性腦損傷小鼠模型，探討廣西毛冬青根對放射性腦損傷學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制，為臨床防治放射帶來的認(rèn)知功能損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性昆明小鼠100 只，5 周齡，體重（25±3）g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（桂）2014-0002。所有小鼠飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)動物房，予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，溫度為（25±2）℃，12 h 明暗交替，自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)按照《國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物關(guān)愛與使用指南》進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

毛冬青湯劑由廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院提供；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；Iba-1 抗體、GFAP 抗體均購于Abcam 公司。Morris水迷宮購于中國科學(xué)研究院；60Co 治療儀由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型與分組 將100只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、毛冬青組、放射組和放射+毛冬青組，每組25 只。毛冬青組和放射+毛冬青組小鼠于放射前給予毛冬青溶液連續(xù)灌胃7 d（1 mL/30 mg），其余各組在同等條件下給予等量生理鹽水。采用0.3%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，并將小鼠固定于自制模具中，放置于照射臺上，照射范圍為雙眼后眥連線和雙耳后連線之間。采用60Co γ射線進(jìn)行照射，放射組和放射+毛冬青組照射劑量10 Gy/次，隔天照射，總劑量為20 Gy。對照組和毛冬青組實(shí)驗(yàn)條件一致，照射劑量為0 Gy。

1.3.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 造模成功后，每組隨機(jī)選取5 只小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，將一圓柱形平臺放置于第Ⅱ象限的中央處，倒入墨水，水溫維持在24～26 ℃，周圍環(huán)境保持相對穩(wěn)定。放射前8 d 開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，前3 d 平臺高出水面1 cm，后5 d 平臺沉于水面下1 cm，記錄每只小鼠找到平臺的時(shí)間，即為小鼠的逃避潛伏期（EL）。放射后撤去平臺，記錄小鼠的平均速度、第1次穿越平臺的時(shí)間、穿越平臺的次數(shù)、中環(huán)停留時(shí)間、外環(huán)停留時(shí)間以及中心區(qū)域的停留時(shí)間。

1.3.3 曠場試驗(yàn) 各組隨機(jī)選取5只小鼠于放射前3 d 和放射后，放進(jìn)100 cm×100 cm×100 cm 的無蓋黑色方箱中，通過動物運(yùn)動軌跡記錄系統(tǒng)觀察記錄小鼠5 min 內(nèi)的平均速度、目標(biāo)區(qū)域的運(yùn)動距離以及第1次進(jìn)入目標(biāo)區(qū)域的時(shí)間。

1.3.4 避暗實(shí)驗(yàn) 避暗箱分為前半部明室和后半部暗室兩部分，兩室之間以直徑為3 cm 的空洞相通。避暗箱底部為銅柵，后半部暗室通以36 V的電壓，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將小鼠背對入口放入明室內(nèi)，記錄小鼠從放入明室到鉆進(jìn)暗室觸電的時(shí)間，即為EL，同時(shí)記錄小鼠在3 min 內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)，即為錯(cuò)誤次數(shù)。

1.3.5 ELISA實(shí)驗(yàn)測定血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）的水平 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用0.3%戊巴比妥鈉溶液對小鼠進(jìn)行腹腔注射，眼球取血，4 ℃離心，取上清。將ELISA試劑盒室溫復(fù)溫30 min后，根據(jù)說明書流程進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測各組的吸光度（A）值，并計(jì)算出各組血清中IL-6的濃度。

1.3.6 HE 染色觀察腦組織病理變化 麻醉后取腦，將腦組織固定于4%多聚甲醛固定液中，24 h 后脫水包埋，將組織切成厚度為4 μm 的切片，按照試劑盒說明書行HE染色，觀察腦組織病理改變。

1.3.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測小鼠腦組織Iba-1 和GFAP 表達(dá)水平 石蠟切片經(jīng)過脫蠟和抗原修復(fù)后，分別加入一抗：抗Iba-1（1∶1 500）和抗GFAP（1∶800）抗體4 ℃孵育過夜，經(jīng)二抗孵育、DAPI 染色后封片，于熒光顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，并用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛冬青對放射后小鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

放射前，各組小鼠EL未見明顯差異（P＞0.05）；放射后，與對照組比較，放射組平均速度、穿越平臺次數(shù)減少，中環(huán)停留時(shí)間和中心區(qū)停留時(shí)間均縮短（均P＜0.05）；第1次穿越平臺所用時(shí)間和外環(huán)的停留時(shí)間延長（均P＜0.05）；與放射組比較，放射+毛冬青組平均速度、穿越平臺次數(shù)增加，中環(huán)停留時(shí)間和中心區(qū)停留時(shí)間增加，第1 次穿越平臺所用時(shí)間和外環(huán)的停留時(shí)間縮短（均P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 毛冬青對放射后小鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

與對照組比較，放射組小鼠平均速度降低，目標(biāo)區(qū)域的運(yùn)動距離縮短（均P＜0.05）；第1次進(jìn)入目標(biāo)區(qū)域的時(shí)間延長（P＜0.05）；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠平均速度及在目標(biāo)區(qū)域的運(yùn)動距離均增加，第1 次進(jìn)入目標(biāo)區(qū)域的時(shí)間縮短（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 毛冬青對放射后小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

與對照組比較，放射組小鼠EL縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加（均P＜0.05）；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠EL 較放射組延長，錯(cuò)誤次數(shù)也減少（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠避暗實(shí)驗(yàn)比較

2.4 各組小鼠血清IL-6水平比較

與對照組比較，放射組小鼠血清IL-6水平增高（P＜0.05），與放射組相比較，放射+毛冬青組小鼠血清IL-6水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠血清IL-6水平比較

2.5 各組小鼠腦組織海馬區(qū)組織病理學(xué)改變

對照組和毛冬青組海馬區(qū)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)清晰完整，染色均勻，細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞周圍間隙較為致密，無明顯水腫；放射組細(xì)胞排列分散，間質(zhì)水腫，胞體縮小、胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，經(jīng)毛冬青干預(yù)后，放射+毛冬青組小鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)明顯改善，見圖5。

圖5 各組小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

2.6 各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1表達(dá)水平比較

與對照組比較，放射組小鼠腦組織中Iba-1表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05），小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，排列緊密，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞突起增粗、增長，呈激活狀態(tài)；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞體積變小，突起變細(xì)、變短，排列較為稀疏，Iba-1表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1表達(dá)水平比較（免疫熒光染色，×200）

2.7 各組小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 表達(dá)水平比較

對照組和毛冬青組GFAP 陽性表達(dá)較少，胞體小，分布稀疏，突起較細(xì)。放射組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 表達(dá)水平升高（P＜0.05），細(xì)胞排列密集、胞體增大，突起變粗；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠腦GFAP表達(dá)水平降低（P＜0.05），細(xì)胞排列較稀疏、胞體變小，突起較細(xì)，見圖7。

圖7 各組小鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)水平比較（免疫熒光染色，×200）

3 討論

放射性腦損傷是放射治療頭頸部腫瘤后最為嚴(yán)重的并發(fā)癥，以神經(jīng)系統(tǒng)的功能損害為主，可出現(xiàn)海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[11]。本研究通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，放射后，小鼠在水迷宮中游泳的平均速度、穿越平臺次數(shù)、中環(huán)停留時(shí)間及外環(huán)停留時(shí)間減少，第1 次穿越平臺和外環(huán)停留時(shí)間明顯增加，與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道一致。而經(jīng)毛冬青干預(yù)后，小鼠記憶功能明顯好轉(zhuǎn)，這提示毛冬青對于放射性腦損傷小鼠的認(rèn)知功能具有保護(hù)作用。

曠場實(shí)驗(yàn)主要用于檢測小鼠自發(fā)性活動和探索行為，是評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物在新環(huán)境中自主行為、探索行為和緊張度的方法[14]。小鼠曠場行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，放射組小鼠平均速度降低，目標(biāo)區(qū)域的運(yùn)動距離縮短，第1 次進(jìn)入目標(biāo)區(qū)域的時(shí)間有所延長。而放射+毛冬青小鼠的平均速度及在目標(biāo)區(qū)域的運(yùn)動距離均有所增加，第1 次進(jìn)入目標(biāo)區(qū)域的時(shí)間縮短。這表明放射后動物多處于多動與焦慮狀態(tài)，相對于放射組小鼠，毛冬青干預(yù)后焦慮狀態(tài)得到改善。避暗實(shí)驗(yàn)操作簡單，且便于觀察，被廣泛地用于動物學(xué)習(xí)和記憶能力的測試[15]。本實(shí)驗(yàn)中放射后小鼠的EL明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加；與放射組相比，毛冬青干預(yù)后小鼠的EL有所延長，錯(cuò)誤次數(shù)也有所減少，并且接近對照組水平。進(jìn)一步表明毛冬青對放射誘導(dǎo)的腦損傷小鼠的認(rèn)知功能具有保護(hù)作用。因此，從行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以推測，放射能引起小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，經(jīng)毛冬青治療后小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力得到改善，表明毛冬青可以有效改善放射性腦損傷小鼠的記憶認(rèn)知功能障礙。

海馬是與認(rèn)知功能密切相關(guān)的腦區(qū)，具有獲取、形成、維持記憶等多種功能，其中包含多種模式識別受體，容易受到炎癥介質(zhì)的影響，造成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知功能障礙[16]。膠質(zhì)細(xì)胞的功能復(fù)雜且多樣化，除了作為填充物質(zhì)存在于各個(gè)神經(jīng)元之間，還參與調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化、軸突延伸與重塑及記憶睡眠等生理行為[17]。有研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能和維持大腦認(rèn)知過程起到關(guān)鍵作用[18-19]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的免疫細(xì)胞，可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并調(diào)控其功能活動，且海馬是小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞密度最高的結(jié)構(gòu)之一[20]。大量研究證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放的大量炎性介質(zhì)，如IL-1β、IL-6等，是神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵因子，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[21-22]；同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞定位的連接蛋白與記憶的形成和惡化密切相關(guān)，生理情況下參與了記憶的形成，而病理情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認(rèn)知能力下降，且對海馬神經(jīng)的發(fā)生起調(diào)控作用[23-24]。而Iba-1和GFAP作為兩種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，其表達(dá)水平反映了神經(jīng)膠質(zhì)的功能活化狀態(tài)，對認(rèn)知功能的影響也尤為重要。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，射線在治療頭頸部腫瘤患者時(shí)，也可能造成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不同程度的損傷[25]。本研究通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，放射后海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了病理學(xué)改變，而毛冬青治療后得到緩解；而免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，放射后小鼠腦組織中Iba-1和GFAP陽性表達(dá)水平顯著增高，小膠質(zhì)細(xì)胞體積增大，細(xì)胞突起增粗、增長；星形膠質(zhì)細(xì)胞排列密集、胞體增大，突起變粗。毛冬青干預(yù)后，小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化被抑制，Iba-1 和GFAP 陽性表達(dá)水平降低，這提示放射改變了Iba-1 和GFAP 的表達(dá)水平，影響了小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)，造成了機(jī)體認(rèn)知能力的下降，而毛冬青可能通過保護(hù)小鼠海馬區(qū)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)放射性腦損傷小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)，從而改善小鼠的認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，毛冬青對放射性腦損傷認(rèn)知功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。毛冬青作為一種常見的天然中草藥，來源廣泛，價(jià)格低廉，本研究為臨床上治療放射性腦損傷提供了新的思路。后續(xù)將對其潛在的分子機(jī)制以及途徑進(jìn)行更深入的研究。