酒精性心肌病大鼠模型中凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1表達與細胞凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達關系研究

蘆 蘭，王 鑫，張瑞琦，趙 偉，袁 博，張一凡，馮占斌

(1.西安醫(yī)學院，陜西 西安 710021；2.西安市第九醫(yī)院，陜西 西安 710054)

長期過量飲酒會對心臟造成嚴重損害，酒精是最重要的損傷因子，在體內可以分解為乙醛和脂肪酸乙酯等毒性產(chǎn)物，并通過激活多種信號轉導通路改變心肌細胞的功能，引起心肌代謝和組織學異常，最終導致心肌肥大、心臟擴大、心肌纖維化、心肌細胞凋亡、心功能下降等一系列改變，臨床上稱之為酒精性心肌病(Alcohol cardiomyopathy，ACM)[1]。ACM的病理生理學改變涉及心肌細胞凋亡和心肌細胞功能變化等多方面因素，是導致非缺血性擴張型心肌病的主要原因，其特點是左心室舒張期內徑(LVEDD)增加和左心室射血分數(shù)(LVEF)降低[2]。有研究發(fā)現(xiàn)：ACM患者的心肌組織中可見大量的凋亡細胞，ACM動物細胞模型中也同樣檢測到了Bax、Cleaved caspase-3等細胞凋亡標志物升高的現(xiàn)象，提示酒精與細胞凋亡密切相關[3-5]，凋亡是導致ACM發(fā)病的主要因素之一[6]。

凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)是氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，OxLDL)的清道夫受體之一[7]，它的表達受多種促炎性細胞因子、氧化應激反應和機械刺激等因素調控[8]，與心肌缺血損傷后的炎癥反應和心臟重構有關。LOX-1已被證實在心血管疾病中起重要作用，如動脈粥樣硬化等。研究表明，心肌缺血后LOX-1的表達量增多，促進心肌細胞的凋亡、局部炎癥和成纖維細胞的活化，最終導致心肌功能的喪失[9]。LOX-1在ACM中的表達如何以及是否誘發(fā)細胞凋亡目前國內外報道較少。本研究計劃建立ACM大鼠模型，并通過外源性shRNA干預，觀察LOX-1和細胞凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表達量變化，旨在探討LOX-1與酒精誘導心肌細胞凋亡的關系，為ACM的防治提供新的研究思路和方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 該研究得到了西安市第九醫(yī)院動物護理委員會的批準，并遵守了美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)的指導方針。選取2周齡的健康雄性SD大鼠(麟美生物，中國)9只，體重200～250 g，隨機分為三組，正常對照組(n=3)、ACM組(n=3)和ACM+shLOX-1組(n=3)。所有大鼠均置于45 ℃和50%濕度的環(huán)境中，正常飲食，在12 h光/暗循環(huán)下自由活動。正常對照組：正常飼養(yǎng)16周不做干預處理；ACM組：第1周，50%的乙醇[6 ml/(kg·d)]，每天灌胃1次，且自由獲取5%的乙醇(用來替代水)；第2周，50%的乙醇[8 ml/(kg·d)]，每天灌胃1次，且自由獲取10%的乙醇(用來替代水)；第3周，50%的乙醇[10 ml/(kg·d)]，每天灌胃1次，且自由獲取20%的乙醇(用來替代水)；第4～16周，50%的乙醇[12 ml/(kg·d)]，每天灌胃2次，且自由獲取20%的乙醇(用來替代水)，誘發(fā)ACM，建立ACM大鼠模型(心臟彩超示模型組較正常組心腔擴大、心肌變薄視為ACM模型成功)；ACM+shRNA組：相同方法誘發(fā)ACM，并在體內尾靜脈注射預先設計的腺病毒相關的shRNA進行LOX-1沉默抑制LOX-1的表達。16周后，將各組大鼠處死，取出心臟標本，測定分析相關指標。

1.2 qRT-PCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen,美國)從大鼠心肌組織勻漿液中分離總RNA。提取總RAN后，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；NanoQuant酶標儀(TECAN，瑞士)檢測RNA純度，RNA純度=OD260/OD280，該比值應在1.8～2.0之間。按照SuperScript Ⅲ RT反轉錄試劑盒(ABI-invitrogen，美國)說明制備20 μl反應體系，使用StepOne Software熒光定量PCR儀(Applied biosystems，美國)進行反轉錄，反應條件：65 ℃ 5 min；85 ℃ 10 min。使用Step One Software熒光定量PCR儀(Applied biosystems，美國)按照superscript Ⅲ逆轉錄試劑盒(ABI-invitrogen，美國)制備反應體系，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s 40個循環(huán)。各因子引物如表1，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 Western blot 收集樣品，用PBS在冰浴中以最大功率超聲破碎細胞(3×10 s)，使其在4 ℃下12000 r/min離心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃測量蛋白濃度。離心物的等分物在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后將分離的蛋白質轉移到 PVDF膜(默克，美國)。隨后使用抗LOX-1(1∶1000,ab60178)、Bax(1∶1000，ab32503)、Cleaved caspase-3(1∶1000,ab184787)的一抗，在4 ℃下處理12 h。用TBST(索萊寶，中國)沖洗后，加入二次HRP偶聯(lián)的抗體，孵育1 h。接下來，在TBST洗滌后，使用 DAB試劑盒(索萊寶，中國)觀察條帶。通過 ImageJ1.53f(NIH，美國)獲得蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 用Graphpad Prism 8.3.0(Graphpad LLC，美國)進行分析和繪圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；相關性分析采用Pearson檢驗；P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組LOX-1及凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3 mRNA表達量分析 通過qRT-PCR檢測各組心肌細胞凋亡相關蛋白mRNA表達情況顯示：ACM組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3 mRNA表達量明顯高于Blank組[(1.51±0.02)與(0.97±0.03)、(2.21±0.08)與(1.05±0.04)、(2.10±0.09)與(1.07±0.09)，均P<0.0.1)]；ACM+shRNA組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3表達量明顯低于ACM組[(0.64±0.01)與(1.51±0.02)、(1.63±0.02)與(2.21±0.08)、(1.58±0.01)與(2.10±0.09)，P<0.01]，見圖1。

A：Bax mRNA表達量對比；B：Cleaved caspase-3 mRNA表達量對比；C：LOX-1 mRNA表達量對比。Blank組：空白對照組；ACM組：酒精性心肌病組；ACM+shRNA組：shRNA抑制LOX-1表達的酒精性心肌病組。*P<0.01

2.2 LOX-1及凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達量分析 通過Western blot檢測各組心肌細胞凋亡蛋白表達情況顯示：ACM組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達量明顯高于Blank組[(0.99±0.02)與(0.89±0.02)、(0.61±0.01)與(0.30±0.01)、(0.61±0.01)與(0.20±0.01)，均P<0.01]；ACM+shRNA組LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達量明顯低于ACM組[(0.57±0.14)與(0.99±0.02)、(0.45±0.03)與(0.61±0.01)、(0.42±0.01)與(0.61±0.01)，均P<0.01]，上述指標提示蛋白檢測結果與mRNA檢測結果具有相同的趨勢，見圖2。

A：各組大鼠Western blot蛋白印跡圖；B：各組大鼠LOX-1、Bax、Cleaved caspase-3 的蛋白表達量對比。Blank組：空白對照組；ACM組：酒精性心肌病組；ACM+shRNA組：shRNA抑制LOX-1表達的酒精性心肌病組。*P<0.01

2.3 LOX-1與凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3相關性分析 使用Pearson檢驗對LOX-1與凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3進行相關性分析結果顯示，在ACM大鼠模型中 LOX-1與心肌凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3呈正相關(r=0.323,P=0.080；r=0.370,P=0.082),見圖3。

注：P>0.05表示相關性太弱。相關系數(shù)r在0.8～1.0之間是極強相關；0.6～0.8之間是強相關；0.4～0.6 之間是中等程度相關；0.2～0.4之間是弱相關；0.0～0.2則是極弱相關或無相關

3 討 論

ACM是以酒精劑量依賴性的方式逐步進展的，過量飲酒是導致左心功能障礙的主要原因之一，酒精的毒性作用可導致心力衰竭、心臟傳導阻滯、心房顫動、心肌重構、心臟代謝和功能異常[10]。目前，關于ACM的研究多集中在氧化應激、細胞器功能障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、細胞死亡、蛋白代謝異常、神經(jīng)體液系統(tǒng)紊亂、炎癥、基因改變、營養(yǎng)失衡及自噬等方面[11]，其具體發(fā)病機制尚未完全明確。有研究提出酒精可抑制蛋白質的合成，誘導炎癥和心肌細胞凋亡，且凋亡誘導的心臟組織的丟失是導致酗酒者射血分數(shù)和舒張末期升高的原因[5]。此外，這種凋亡導致的組織丟失也會引起心室壁變薄和心室擴張，最終導致心力衰竭發(fā)生[12]。酒精分解產(chǎn)生的乙醛被認為是導致組織和細胞毒性的主要物質，其毒性比乙醇更強，能顯著抑制心肌蛋白質合成，損傷心肌收縮功能，破壞心肌興奮-收縮偶聯(lián)，導致氧化損傷和脂質過氧化反應[12]。因此，乙醛是導致酒精性心肌病最重要的物質，大量攝入酒精可誘導心肌細胞線粒體凋亡，并刺激氧化應激反應，提示酒精誘導的心肌細胞凋亡可能是由活性氧(ROS)信號通路介導的[13]。乙醛能夠誘導ROS產(chǎn)生增加，激活ERK1/2、SPAK/JNK和P38 MAPK，進而導致細胞凋亡[14-15]。

1972年Kerr最先提出細胞凋亡的概念，它是細胞死亡的形式之一，是細胞的一種主動程序性死亡，與各種基因的激活存在密切關聯(lián)[16]。細胞凋亡有時也被稱為程序性細胞死亡(或更通俗地說是“細胞自殺”)，細胞凋亡的啟動依賴于一系列半胱氨酸-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活[17]。caspase家族是在細胞凋亡發(fā)揮關鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，其中Cleaved caspase-3在凋亡級聯(lián)反應中處于核心地位[8]。Cleaved caspase-3可引起DNA損傷修復酶降解，與此同時激活核酸內切酶，從而引起細胞凋亡[18]。另外，Ge等[19]發(fā)現(xiàn)，長期大量攝入酒精會導致Cleaved caspase-3活性增高，并促進細胞凋亡。引起細胞凋亡的另一個因素是Bcl-2蛋白家族，包括抗凋亡蛋白(如 Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等)和促凋亡蛋白(如 Bax、Bad、Bak、Bid和 Bcl-xs等)，其中促凋亡蛋白Bax水平的高低與細胞凋亡調控直接相關，即Bax促進細胞凋亡[20]。這些研究結果均表明Bax、Cleaved caspase-3與細胞凋亡有明顯的關系。

LOX-1是最早被鑒定為引起血管內皮細胞攝取ox-LDL的受體之一，隨后在心肌細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、動脈粥樣硬化斑塊、血小板中也發(fā)現(xiàn)了LOX-1的存在，提示LOX-1在體內可能有多種功能。在正常生理情況下，LOX-1的表達較低，主要功能是參與ox-LDL的結合、內吞和蛋白降解，但在高血壓(血管緊張素Ⅱ、內皮素-1)、糖尿病(葡萄糖)、缺氧和機械應激(剪切應力)等病理狀態(tài)下卻呈現(xiàn)出表達上調的現(xiàn)象。此外，LOX-1的激活與許多病理生理過程有關,包括內皮細胞和血管平滑肌細胞增殖、細胞周期信號改變及細胞凋亡等，但LOX-1介導細胞凋亡的機制，國內外報道甚少。

本研究通過構建ACM模型，并給予外源性shRNA干預從基因以及蛋白水平檢測凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表達量，研究發(fā)現(xiàn)：ACM組凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達量明顯升高，提示ACM大鼠存在心肌細胞凋亡情況；我們進一步通過shRNA抑制LOX-1表達后發(fā)現(xiàn)：LOX-1在ACM+shRNA組表達降低，而在qRT-PCR檢測結果中，凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3也出現(xiàn)協(xié)同性降低現(xiàn)象，提示LOX-1可能通過正向調節(jié)凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表達參與酒精誘導心肌細胞凋亡的發(fā)展過程。Pearson檢驗結果提示：隨著自變量LOX-1的增大，相關變量Bax、Cleaved caspase-3也會隨之變化，且r值表明兩變量存在正相關關系，但該現(xiàn)象缺乏統(tǒng)計學意義，可能與樣本數(shù)量較少有關，難免存在統(tǒng)計學偏倚，在后續(xù)的研究中會進一步擴大樣本量進一步驗證現(xiàn)有結論。

綜上所述，本研究結果發(fā)現(xiàn)：ACM模型中LOX-1及凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達明顯升高，且LOX-1與凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3成正相關。推測LOX-1可能通過對凋亡相關蛋白Bax、Cleaved caspase-3的正向調節(jié)參與酒精誘導心肌細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程。