丙泊酚減低EZH2對miR-34a抑制效應(yīng)與腸癌細(xì)胞增殖侵襲能力變化的研究

梁偉華,蔣 淼

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院寶山分院 上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院麻醉科，上海200431)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)為世界常見的惡性疾病，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。手術(shù)治療仍為結(jié)直腸癌治療的主要方式；近年研究發(fā)現(xiàn)，麻醉劑可引起細(xì)胞代謝、炎癥或免疫狀態(tài)，并在圍手術(shù)期甚至長遠(yuǎn)影響患者預(yù)后和復(fù)發(fā)，然而其機(jī)制不明[2-3]。丙泊酚(Propofol)為廣泛用于手術(shù)的麻醉劑。Wu等[4]發(fā)現(xiàn)丙泊酚用于結(jié)直腸癌治療與患者良好生存有關(guān)。機(jī)制研究方面，丙泊酚可增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷能力，抑制腫瘤免疫逃避作用[5-6]；有研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力，發(fā)揮抗腫瘤活性[7-8]，但其具體調(diào)控靶點尚不明朗。

微小RNA(microRNA，miRNAs)為一類可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥等廣泛生物學(xué)反應(yīng)的小分子非編碼RNA[9-10]。據(jù)報道微小RNA異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。miR-34為結(jié)直腸癌重要抑癌miRNA，可通過干預(yù)諸如STAT3、SNAIL、ZEB1等多種促癌因子表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲功能[13-14]。miR-34a在腸癌組織中表達(dá)下調(diào)[15-17]，其下調(diào)與一種表觀沉默蛋白卷曲同源2增強(qiáng)子(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)密切相關(guān)；研究證實EZH2可招募至miR-34a啟動子，引起組蛋白發(fā)生甲基化修飾，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抑制miR-34a轉(zhuǎn)錄[18-20]。因此，抑制EZH2結(jié)合、誘導(dǎo)恢復(fù)miR-34a表達(dá)水平具有重要的臨床價值。最新研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚具有調(diào)控細(xì)胞miRNA表達(dá)水平的作用，如miR-141、miR-200c及miR-9等[21-23]。本文擬對丙泊酚對腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲作用進(jìn)行研究；探究其對miR-34a是否存在誘導(dǎo)作用，并對誘導(dǎo)機(jī)制展開初步研究，為丙泊酚抗腫瘤活性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT116購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。丙泊酚購自美國Sigma Aldrich公司；miR-34a mimics及inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 3000試劑購自美國Invitrogen公司；EZH2及GAPDH定量采用逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-34a及U6定量檢測試劑盒購自德國QIAGEN公司；染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR(SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit)購自美國CST公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物有限公司；Transwell小室購自Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT116購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。用含10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素和 100 U/ml青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于27 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞處理和實驗分組：研究丙泊酚對EZH2和miR-34a作用，分成兩組：①對照組，即0.9%氯化鈉溶液處理；②丙泊酚組，即丙泊酚處理。研究丙泊酚和miR-34a對腸癌細(xì)胞增殖、侵襲作用，分成四組：①對照組，即0.9%氯化鈉溶液，同時細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miRNA陰性對照mimics；②丙泊酚組，即丙泊酚處理；③miR-34a組，即細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a mimics；④丙泊酚+miR-34a inhibitor組，細(xì)胞同時受到丙泊酚及miR-34a inhibitor處理。丙泊酚用培養(yǎng)液稀釋與終濃度為10 μg/ml，與腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)。miR-34a mimics及inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用Lipo3000，按廠商說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量(RT-qPCR)：EZH2定量按總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR按試劑盒說明書操作。其中各基因引物為：EZH2：F：5’-AAT-CAGAGTACATGCGACTGAGA-3’，R：5’-GCTG-TATCCTTCGCTGTTTCC-3’；GAPDH為內(nèi)參基因：F:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，R:5’-AG-GAGTGGGTGTCGCTGT-3’。miR-34a定量按miRNA熒光定量PCR按試劑盒說明書操作，其中U6為內(nèi)參基因。Real-time定量PCR條件為：95 ℃ 10 min后,95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 循環(huán)。Real-time定量PCR使用ABI 7500儀器進(jìn)行。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以GAPDH或U6作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)倍數(shù)變化。

1.2.4 染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)：按說明書進(jìn)行處理，通過細(xì)胞甲醛交聯(lián)、染色體酶促消化、EZH2免疫沉淀、洗脫及解交聯(lián)、最后純化DNA，利用qPCR檢測 EZH2沉淀DNA中靶基因的含量。

1.2.5 細(xì)胞增殖活性檢測(CCK-8)：對照組及各處理組細(xì)胞以每孔1000細(xì)胞接種96孔板，經(jīng)過各種處理后，于終止時刻加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。通過酶標(biāo)儀測量該樣品在450 nm處的吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力：分析腸癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度至5×104接種于Transwell小室(鋪有Matrigeal膠)，下室加入正常含胎牛血清完全培養(yǎng)基700 μl，培養(yǎng)48 h后取出小室。預(yù)冷甲醇，固定10 min，在PBS中用棉簽刮去小室上層細(xì)胞后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，ddH2O清洗。倒置顯微鏡取3個視野，計數(shù)取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；多組間比較采用Dunnet-t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丙泊酚對miR-34a及EZH2表達(dá)的影響 分別對腸癌細(xì)胞株HCT116及SW480進(jìn)行丙泊酚處理。與對照組比較，丙泊酚組細(xì)胞miR-34a表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，而EZH2表達(dá)水平明顯抑制(P<0.01)。見表1。

表1 miR-34a及EZH2在對照組及丙泊酚組中表達(dá)比較

2.2 對照組細(xì)胞和丙泊酚組細(xì)胞EZH2在miR-34a啟動子富集程度的比較 利用ChIP-qPCR方法，我們檢測了對照組細(xì)胞和丙泊酚組細(xì)胞中，EZH2于miR-34a啟動子富集程度的變化。如表2所示，丙泊酚組SW480及HCT116細(xì)胞的EZH2在miR-34a啟動子富集程度顯著低于對照組細(xì)胞(P<0.01)，提示EZH2對miR-34a轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱。

表2 對照組細(xì)胞和丙泊酚組細(xì)胞EZH2在miR-34a啟動子富集程度的比較

2.3 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯(lián)合處理組與對照組腸癌細(xì)胞SW480增殖活性比較 鑒于丙泊酚對miR-34a抑制作用，我們分析了兩者對腸癌細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙泊酚和miR-34a處理SW480、HCT116細(xì)胞48 h，顯著抑制其增殖活性(P<0.01)。為分析丙泊酚的抑制作用是否依賴miR-34a，我們又進(jìn)行了丙泊酚與miR-34a inhibitor聯(lián)合處理，丙泊酚的抑制增殖活性被miR-34a inhibitor減弱，提示miR-34a是丙泊酚發(fā)揮抑制作用的重要干預(yù)靶點。見表3、4。

表3 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯(lián)合處理組與對照組腸癌細(xì)胞SW480增殖活性比較

表4 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯(lián)合處理組與對照組腸癌細(xì)胞HCT116增殖活性比較

2.4 丙泊酚及miR-34a對腸癌細(xì)胞侵襲的影響 Transwell小室試驗表明丙泊酚和miR-34a處理SW480、HCT116細(xì)胞48 h后，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少。此外，我們也進(jìn)行了丙泊酚與miR-34a inhibitor聯(lián)合處理，丙泊酚的抑制增腸癌細(xì)胞侵襲能力被miR-34a inhibitor減弱，提示miR-34a為丙泊酚重要靶點。見圖1(表5)。

圖1 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯(lián)合處理組與對照組腸癌細(xì)胞侵襲能力比較(迪夫快速染色，×20)

表5 丙泊酚、miR-34a mimics及丙泊酚+miR-34a inhibitor聯(lián)合處理組與對照組腸癌細(xì)胞侵襲能力比較

3 討 論

丙泊酚作為靜脈麻醉劑有諸多優(yōu)點，如鎮(zhèn)靜、催眠、遺忘效應(yīng)、作用時間短、起效快、易于控制、清醒時間快、不易藥物蓄積等[24-25]，因此廣泛用于腫瘤切除手術(shù)中。最近研究表明丙泊酚除麻醉效應(yīng)外，還具有抗腫瘤活性，但其藥理機(jī)制不明確。miR-34a為抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)表型的重要抑癌miRNA；然而在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中由于EZH2導(dǎo)致miR-34a啟動子區(qū)域染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化，顯著抑制了miR-34a轉(zhuǎn)錄表達(dá)[18,20,26]。因此，解除EZH2-miR-34a作用，可恢復(fù)miR-34a生物學(xué)功能，為前景較好的干預(yù)療法。

據(jù)報道丙泊酚具有調(diào)控細(xì)胞miRNA表達(dá)水平的作用，我們推測丙泊酚是否可能通過EZH2-miR-34a發(fā)揮其抗腫瘤活性呢？我們首先對腸癌細(xì)胞SW480和HCT116進(jìn)行了丙泊酚處理，利用qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可明顯誘導(dǎo)miR-34a表達(dá)升高，并抑制EZH2表達(dá)，證實了丙泊酚對miR-34a和EZH2的調(diào)控作用。同時，我們也發(fā)現(xiàn)丙泊酚不僅可以減低EZH2的表達(dá)，而且也可影響EZH2在miR-34a啟動子區(qū)的結(jié)合程度。利用ChIP-qPCR發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞EZH2相對富集程度可達(dá)到38.20～69.36；而丙泊酚處理后，EZH2相對富集程度僅為6.28～11.25，EZH2對miR-34a啟動子抑制能力顯著減低，進(jìn)一步闡明了丙泊酚對miR-34a的抑制機(jī)理。據(jù)文獻(xiàn)報道，EZH2結(jié)合靶基因啟動子后，可催化組蛋白3的第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27me3)修飾甲基化修飾，從而影響靶基因轉(zhuǎn)錄活性[27]；同時EZH2作為多梳復(fù)合物(Polycomb Group Protein)的催化亞單位，還與其他因子共同介導(dǎo)靶基因的表觀沉默[28]。本研究僅揭示了丙泊酚可減少EZH2在miR-34a啟動子的富集程度，可能丙泊酚還參與更為復(fù)雜的表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尚需進(jìn)一步研究。

我們揭示了miR-34a為丙泊酚靶點后，我們驗證了丙泊酚的抗腫瘤作用。有文獻(xiàn)報道，丙泊酚可抑制淋巴瘤、宮頸癌、乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲作用[20,23]，本研究也同樣發(fā)現(xiàn)了丙泊酚可在體外抑制腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。此外，我們也證實了腸癌細(xì)胞過表達(dá)miR-34a具有抑制細(xì)胞增殖和侵襲作用。為進(jìn)一步研究丙泊酚是否依賴miR-34a的表達(dá)發(fā)揮其抗腫瘤活性，我們也進(jìn)行了補(bǔ)救實驗，即在丙泊酚處理同時，特異性抑制miR-34a，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙泊酚的抑制增殖和侵襲作用減弱，佐證了我們的推測。

綜上所示，我們發(fā)現(xiàn)丙泊酚對腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力具有顯著抑制能力。丙泊酚通過減低EZH2的表達(dá)及在miR-34a啟動子的富集，促進(jìn)miR-34a轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從機(jī)理上揭示了丙泊酚的抗腫瘤作用，為其成為潛在臨床腫瘤治療提供了實驗依據(jù)。