cGAS-STING 信號(hào)通路相關(guān)靶向藥物的研究進(jìn)展

張穎，李真，王全逸，王琛,2*

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2. 中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

固有免疫在病原體入侵人體時(shí)首先發(fā)揮作用，是機(jī)體免疫的首道防線。當(dāng)病原體突破體表屏障，侵入和擴(kuò)散時(shí)，體內(nèi)固有免疫細(xì)胞可直接吞噬、殺傷病原體或通過(guò)細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原體，從而促進(jìn)Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)和釋放，同時(shí)樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）將抗原呈遞至T 和B 淋巴細(xì)胞，以啟動(dòng)適應(yīng)性免疫[1]。PRRs 不僅能夠識(shí)別病原體上某些高度保守的病原相關(guān)分子模式，如肽聚糖和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等，還能識(shí)別自身細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下或死亡時(shí)釋放的損傷相關(guān)分子模式，如熱休克蛋白和高遷移率族蛋白B1 等，并進(jìn)一步調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答，刺激多種細(xì)胞因子的表達(dá)[2]。

越來(lái)越多的研究表明，環(huán)磷酸鳥苷-腺苷一磷酸合成酶-干擾素基因刺激因子（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthasestimulator of interferon genes，cGAS-STING） 信 號(hào)通路是體內(nèi)介導(dǎo)DNA 免疫應(yīng)答的主要途徑[3-4]。cGAS 既是生物合成酶，又是一種胞內(nèi)DNA 感受器，能夠識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中異常存在的雙鏈脫氧核糖核酸（double-stranded deoxyribonucleic acid，dsDNA），催化第二信使的生成，觸發(fā)STING 的活化，從而激活固有免疫[5]。當(dāng)來(lái)自細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞的外源DNA 或來(lái)自線粒體損傷、細(xì)胞凋亡的自身DNA在細(xì)胞質(zhì)中積聚時(shí)，都能被cGAS 識(shí)別和結(jié)合[2]。cGAS-STING 信號(hào)通路與病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，該通路異?？赡軐?dǎo)致多種疾病的發(fā)生[6-8]。由于cGAS-STING 通路在抵御病原體感染、抗腫瘤免疫中發(fā)揮出強(qiáng)大的功能，近年來(lái)已引起廣泛關(guān)注，成為免疫治療中的“新星”。本文將對(duì)cGAS-STING 信號(hào)通路和該信號(hào)通路靶向藥物的最新研究成果進(jìn)行討論和總結(jié)，為相關(guān)抑制劑、激動(dòng)劑的研發(fā)工作提供參考。

1 cGAS-STING 通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控

1.1 cGAS 和STING 的結(jié)構(gòu)特征

人源cGAS 肽鏈N 末端（N-terminal domain，NTD）通過(guò)與磷脂酰肌醇4，5-二磷酸相互作用，決 定cGAS 的 亞 細(xì) 胞 定 位；C 末 端（C-terminal domain，CTD）具有核酸轉(zhuǎn)移酶活性[9]。cGASdsDNA 復(fù)合物由2 分子的cGAS 和2 分子的dsDNA組裝而成，cGAS 通過(guò)CTD 結(jié)構(gòu)域與dsDNA 的磷酸-脫氧核糖骨架相連[10]。同時(shí)，cGAS 上富含鋅的區(qū)域與DNA 相互作用，這種離子作用促進(jìn)兩者之間的結(jié)合，使cGAS-dsDNA 復(fù)合物能夠穩(wěn)定存在[9-10]。cGAS 和dsDNA 的結(jié)合與dsDNA 序列的特異性無(wú)關(guān)，且長(zhǎng)鏈dsDNA（＞45 bp）更能有效地激活cGAS[11]。

人源STING（human STING，hSTING）包含1 個(gè)跨膜的N 末端區(qū)域和1 個(gè)C 末端區(qū)域，NTD 負(fù)責(zé)將STING 錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及其他細(xì)胞器膜上；CTD 由二聚化結(jié)構(gòu)域、配體與蛋白結(jié)合區(qū)域及C 末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal tail，CTT）組成[12]。未結(jié)合2'，3'-環(huán)化鳥苷酸腺苷酸（2'，3'-cyclic guanosine monophosphateadenosine monophosphate，2'，3'-cGAMP） 時(shí)，STING以二聚體形式存在，2分子CTD面向胞質(zhì)形成“開放”的V 型結(jié)合口袋；與2'，3'-cGAMP 結(jié)合時(shí)，CTD發(fā)生構(gòu)象變化，V 型二聚體采用更為緊密的“閉合”構(gòu)象并形成“蓋子”覆蓋在cGAMP 的結(jié)合部位[13]。

1.2 cGAS-STING 信號(hào)通路

cGAS 與dsDNA 結(jié)合后被激活，其催化口袋會(huì)進(jìn)行重新排列，激活的cGAS 以腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP） 和 鳥 苷 三 磷 酸（guanosine triphosphate，GTP）為底物，催化生成2'，3'-cGAMP。2'，3'-cGAMP 作為接收上游細(xì)胞信號(hào)并傳遞給下游接頭蛋白的第二信使，結(jié)合STING 并使STING 蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)[14]。STING 構(gòu)象的改變促使自身向高爾基體轉(zhuǎn)位，隨后進(jìn)行翻譯后修飾，分別在位于NTD 的第88 和91 位2 個(gè)半胱氨酸殘基（Cys88/Cys91）處進(jìn)行棕櫚?；?，這有利于促進(jìn)STING 寡聚化和招募TANK 結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）[15]。轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）可以調(diào)控Ⅰ型IFN 的轉(zhuǎn)錄，但TBK1 無(wú)法單獨(dú)激活I(lǐng)RF3，需要STING 的協(xié)助。在TBK1 二聚體介導(dǎo)下，STING 的CTT 處第366 位絲氨酸殘基（Ser366）發(fā)生磷酸化，使IRF3 發(fā)生磷酸化修飾而被活化，IRF3 二聚化并移動(dòng)至細(xì)胞核內(nèi)，驅(qū)動(dòng)多種細(xì)胞因子包括Ⅰ型IFN 等的表達(dá)和分泌[16]。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子核因子κB 也被STING 激活，進(jìn)入細(xì)胞核后誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細(xì)胞因子的基因表達(dá)[9]。cGAS-STING 信號(hào)通路見圖1 所示。

圖 1 cGAS-STING 信號(hào)通路示意圖Figure 1 Schematic diagram of cGAS-STING signaling pathway

一直以來(lái)，人們認(rèn)為cGAS 只分布于細(xì)胞質(zhì)中，但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，cGAS 也存在于細(xì)胞核內(nèi)，但核內(nèi)DNA 并未激活cGAS 酶活性，刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答。Michalski 等[17]通過(guò)低溫電鏡觀察到，細(xì)胞核內(nèi)cGAS 僅與染色質(zhì)中的組蛋白結(jié)合，使得cGAS上的DNA 結(jié)合位點(diǎn)被阻擋，不能與DNA 相互作用，揭示了染色質(zhì)抑制cGAS 從而阻止自身免疫反應(yīng)的機(jī)制。

2 cGAS-STING 信號(hào)通路與相關(guān)疾病

侵入人體的病原體DNA 和腫瘤細(xì)胞泄露的DNA，被細(xì)胞質(zhì)中的DNA 感受器cGAS 迅速識(shí)別、結(jié)合，生成能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)的2'，3'-cGAMP。2'，3'-cGAMP 將接收到的上游細(xì)胞信號(hào)遞送給下游的接頭蛋白——STING，STING 激活后觸發(fā)免疫應(yīng)答，分泌Ⅰ型IFN 和TNF-α 等細(xì)胞因子。Ⅰ型IFN具有雙重功能，一方面增強(qiáng)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）通過(guò)多種途徑特異性殺傷抗原靶細(xì)胞的能力，抵御病原體的入侵，從而實(shí)現(xiàn)抗病毒感染；另一方面在腫瘤微環(huán)境（tumor microenviroment，TME）中通過(guò)招募更多的效應(yīng)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，參與免疫應(yīng)答。若該通路中任一組分結(jié)構(gòu)或功能異常，使信號(hào)傳導(dǎo)受阻，無(wú)法順利啟動(dòng)固有免疫或適應(yīng)性免疫，將會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生；若異常積聚的DNA 緩慢、持續(xù)刺激，使cGAS-STING 通路一直處于激活狀態(tài)，則導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的過(guò)度合成與釋放，造成組織炎癥或自身免疫性疾病。

2.1 cGAS-STING 信號(hào)通路與感染性疾病

在病毒的侵染進(jìn)程中，進(jìn)化出多種使cGASSTING 信號(hào)通路不能被有效激活的逃逸機(jī)制，避免病毒引起機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)答。例如很多DNA 病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，可以將核酸包裹在衣殼中，待順利穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)后，進(jìn)入細(xì)胞核中將核酸整合至宿主基因組進(jìn)行復(fù)制[4]。如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)STING 激活后，促使炎性因子的產(chǎn)生和肺部淋巴細(xì)胞的激活，在一定程度上規(guī)避了病毒S 蛋白突變?cè)斐傻拿庖咛右荩篕18-ACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠感染后，通過(guò)鼻內(nèi)吸入的方式給予STING 激動(dòng)劑，顯著抑制了感染過(guò)程，體內(nèi)病毒載量顯著降低[18]。Ma 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi,s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）能夠通過(guò)膜蛋白直接結(jié)合cGAS，破壞上游傳感器cGAS 活性，通過(guò)KSHV 的病毒干擾素調(diào)節(jié)因子削弱STING 與TBK1 的結(jié)合能力和抑制STING 磷酸化，最終使cGAS-STING 信號(hào)通路失活。

2.2 cGAS-STING 信號(hào)通路與癌癥

cGAS-STING 信號(hào)通路能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞DNA，從而啟動(dòng)固有免疫誘導(dǎo)Ⅰ型IFN 的表達(dá)和分泌。為逃逸這種DNA 識(shí)別，腫瘤細(xì)胞已進(jìn)化出多種途徑從多方面抑制或破壞cGAS-STING 信號(hào)通路的激活。例如在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中，腫瘤細(xì)胞通過(guò)超甲基化cGAS 和STING 啟動(dòng)子、降低cGAS 和STING 蛋白表達(dá)量、中斷STING 向高爾基體的轉(zhuǎn)位過(guò)程等機(jī)制，使cGAS-STING 信號(hào)通路發(fā)生異常[15]。

整合素相關(guān)蛋白（integrin-associated protein，IAP，即CD47）與信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α 結(jié)合后抑制巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬，通常在腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)，成為腫瘤免疫逃逸的“幫兇”。Shi 等[19]觀察到雙歧桿菌通過(guò)在TME 中積累，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗CD47 抗體，促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)局部抗CD47 免疫，確定了腸道微生物優(yōu)先在腫瘤部位定植的機(jī)制并通過(guò)STING 信號(hào)通路促進(jìn)免疫治療；同樣，Kosaka等[20]發(fā)現(xiàn)在小鼠乳腺癌細(xì)胞EO771 中，cGAMP和抗CD47 單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而單獨(dú)使用抗CD47 單克隆抗體時(shí)無(wú)作用。研究表明小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）中DNA 損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）基因異常表達(dá)，DDR 異常與腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）具有密切關(guān)系，TMB 可作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）抗程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）抗體治療效果評(píng)估的標(biāo)志物，同時(shí)DDR 缺陷能提高腫瘤細(xì)胞表面程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）蛋白的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)ICI 治療更為敏感[21]。在SCLC 體內(nèi)模型中靶向DDR 的藥物如DNA 修復(fù)酶抑制劑和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1 抑制劑，使DNA 損傷增加，激活了STING-TBK1-IRF3 通路，使CXCL10和CCL5 等炎性因子水平升高，增強(qiáng)CTL 的浸潤(rùn)，促進(jìn)其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；而敲除cGAS 和STING 削弱了DDR 抑制和抗PD-L1 抗體聯(lián)合使用的抗腫瘤作用[22]。這些研究表明STING 在抗腫瘤免疫中具有積極作用，cGAS-STING 信號(hào)通路將固有免疫與適應(yīng)性免疫聯(lián)系在一起，使機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)效抗腫瘤的免疫記憶性。

2.3 cGAS-STING 信號(hào)通路與自身免疫性疾病

病原體感染是激活cGAS-STING 信號(hào)通路的主要方式，但因損傷而泄露到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞核和線粒體DNA 也能夠激活該通路。細(xì)胞質(zhì)中大多數(shù)游離的自身DNA 和RNA 能被機(jī)體內(nèi)的核酸酶如3'-核酸修復(fù)外切酶1（three repair exonuclease 1，TREX1）、核糖核酸酶RNase H2、不育-α-基序結(jié)構(gòu)域和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)域包涵蛋白1、RNA 腺苷脫氨酶降解。在自身免疫性疾病患者中發(fā)現(xiàn)核酸酶的基因突變伴隨cGAS-STING 信號(hào)通路的激活[23]。如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosu，SLE）由于TREX1的突變使得細(xì)胞內(nèi)游離的自身DNA 不能被降解，致使cGASSTING 信號(hào)通路持續(xù)激活，在15% SLE 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測(cè)到cGAS 和cGAMP 水平升高[24]。除了核酸代謝酶功能異常外，單基因突變也可使STING 功能異常增強(qiáng)，甚至引起細(xì)胞因子風(fēng)暴。例如家族性凍瘡樣紅斑狼瘡（familial chilblain lupus，F(xiàn)CL）患者的STING 為G166E 突變型，表現(xiàn)為STING 二聚體結(jié)構(gòu)更為緊密，即使缺乏第二信使2'，3'-cGAMP 也能夠激活下游通路，釋放Ⅰ型IFN[25]。STING 相關(guān)嬰兒期發(fā)病血管?。⊿TINGassociated vasculopathy with onset in infancy，SAVI）是一種由于STING 編碼基因突變引起的自身免疫性疾病，包括V147L，N154S，V155M，G166E，C206Y，R281Q 和R284G 等多個(gè)突變位點(diǎn)，這些突變導(dǎo)致STING 寡聚化并激活，引起早發(fā)的全身炎癥和皮膚血管病變[26]。綜上所述，開發(fā)靶向STING的抑制劑將有助于自身免疫性疾病的治療。

2.4 cGAS-STING 信號(hào)通路與其他疾病

除了上述疾病外，已有多項(xiàng)研究表明cGASSTING 信號(hào)通路與心血管疾病、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病密切相關(guān)。Zhang 等[27]發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型或肥厚型心肌病患者和心肌肥厚小鼠心肌中的STING 表達(dá)水平與疾病進(jìn)程相關(guān)，Sting基因敲除小鼠中心房鈉尿肽、腦鈉肽、β-肌球蛋白重鏈等肥大標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，心肌炎癥和纖維化減輕，并最終改善了心臟功能，體外分析證實(shí)STING 是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)的促進(jìn)心肌肥大的重要信號(hào)。同樣，STING 在動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用，細(xì)胞內(nèi)壓力升高使得核、線粒體DNA 受損，DNA 異常積累激活了cGASSTING 信號(hào)通路，STING 信號(hào)刺激巨噬細(xì)胞的促炎激活，釋放大量炎性因子，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生無(wú)菌炎癥，促進(jìn)了AS 的發(fā)生和發(fā)展[28]。

研究表明，cGAS-STING 通路在大腦中異常激活可能導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病。E3 泛素連接酶Parkin 和線粒體自噬相關(guān)蛋白PTEN 誘導(dǎo)的假定激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）在損傷線粒體的自噬中發(fā)揮重要作用，線粒體功能損傷可能導(dǎo)致帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）。在Parkin 和PINK1 功能缺陷的小鼠模型中，受損的線粒體不能通過(guò)自噬被清除，導(dǎo)致泄露的線粒體DNA 激活cGAS-STING 信號(hào)通路，產(chǎn)生更多的炎癥因子和Ⅰ型IFN，當(dāng)Sting基因敲除時(shí)，炎癥有所緩解[29]。Zhao 等[30]報(bào)道了一種具有治療PD潛力的天然藥物——醉茄素A，通過(guò)靶向多巴胺神經(jīng)元中DJ1-Nrf2-STING 通路，下調(diào)STING 表達(dá)以減緩神經(jīng)炎癥誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，在PD 中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

此外，Donnelly 和Wang 等[31-32]報(bào)道了STING可通過(guò)直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活性以及通過(guò)免疫調(diào)節(jié)緩解骨癌伴發(fā)的疼痛。特異性敲除Sting基因的小鼠對(duì)傷害性刺激極為敏感，向正常小鼠鞘內(nèi)注射STING激動(dòng)劑顯著提高了疼痛的閾值，對(duì)骨癌痛和神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型也同樣具有鎮(zhèn)痛效果。同時(shí)該研究證實(shí)STING 通路的激活上調(diào)了Ⅰ型IFN 的表達(dá)，Ⅰ型IFN 通過(guò)直接減弱傷害感受器的鈉電流和鈣電流影響神經(jīng)元的興奮性而實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛，STING-IFN 信號(hào)軸作為生理性疼痛調(diào)節(jié)的關(guān)鍵，為治療慢性疼痛提供了有希望的靶點(diǎn)。

3 cGAS-STING 信號(hào)通路靶向藥物的開發(fā)

隨著對(duì)cGAS-STING 通路的深入研究，科研人員發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路的紊亂將會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此靶向cGAS 和STING 蛋白的藥物開發(fā)備受關(guān)注。目前，已有一些靶向cGAS-STING 通路的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，有望應(yīng)用于腫瘤和自身免疫性疾病的治療。

3.1 cGAS 抑制劑

雖然某些金屬離子（鋅、錳、鈷離子等）可以調(diào)控cGAS 酶活性，但由于所需濃度過(guò)高，易對(duì)人體產(chǎn)生不良影響，甚至引起中毒，因此有關(guān)cGAS激動(dòng)劑的報(bào)道還未出現(xiàn)[33]。cGAS-STING 通路的過(guò)度激活可導(dǎo)致炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生，使cGAS 成為一種有望治療自身免疫性疾病的新型潛在靶點(diǎn)。抗瘧疾藥物阿的平（quinacrine，QC）是一種很有潛力的cGAS 抑制劑，鼠源cGAS dsDNA共結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯示，QC 通過(guò)破壞dsDNA 構(gòu)象，間接抑制cGAS 酶的活性。在人髓系白血病單核細(xì)胞中QC 的IC50為3.7 μmol · L-1，但該藥物尚未在小鼠模型中進(jìn)行測(cè)試[34]。cGAS 調(diào)控因子GTP 酶激活蛋白SH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1[GTPase-activating protein-(SH3domain)-binding protein 1，G3BP1]能夠增強(qiáng)cGAS 和DNA 的結(jié)合，促進(jìn)cGAS-DNA 復(fù)合物的形成。Liu 等[35]從綠茶茶多酚中發(fā)現(xiàn)的天然小分子表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），能夠作為G3BP1 的抑制劑，干擾G3BP1 與cGAS 的結(jié)合，從而阻止cGAS 識(shí)別異常DNA，導(dǎo)致下游通路無(wú)法激活。EGCG 抑制cGAS 的有效性在自身免疫性疾病動(dòng)物模型和艾卡迪綜合征（Aicardi-Goutières syndrome，AGS）患者中得到了驗(yàn)證。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)cGAS 蛋白第384，394，414 位 處 賴 氨 酸 殘 基（Lys384，Lys394，Lys414）的乙?；瘜?duì)酶活性存在顯著影響，其使cGAS 蛋白保持非活性狀態(tài)，同時(shí)在AGS 患者細(xì)胞和小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)阿司匹林可使cGAS 在上述位點(diǎn)發(fā)生乙酰化修飾，阻止cGAS 激活下游信號(hào)通路，抑制自身免疫反應(yīng)[36]。Vincent 等[37]利用高通量篩選發(fā)現(xiàn)了cGAS 小分子抑制劑RU.521，共結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯示，RU.521 通過(guò)占據(jù)cGAS 催化位點(diǎn)，影響第二信使2'，3'-cGAMP 的形成而特異性抑制cGAS 信號(hào)通路。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，相較于人源cGAS，RU.521 對(duì)鼠源cGAS 酶活抑制作用更明顯，于是進(jìn)一步篩選出能夠顯著抑制人源cGAS 蛋白的化合物G140 和G150[38]。

近日，Chu 等[39]報(bào)道了紫蘇醛通過(guò)抑制cGAS活性抑制胞質(zhì)DNA 引起的自身固有免疫。紫蘇醛是從紫蘇中提取的一種具有甲酰基的單萜化合物，給予紫蘇醛后的小鼠更易感染1 型單純皰疹病毒。接受紫蘇醛治療的AGS 疾病模型——Trex1基因敲除（Trex1-/-）小鼠的Cxcl10，Isg15，Isg56，Ifit3等多個(gè)干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISG）表達(dá)水平降低，自身免疫炎癥明顯減弱。Tan 等[40]根據(jù)cGAS 結(jié)構(gòu)特征，采用生物電子等排、側(cè)鏈延長(zhǎng)等策略合成了Ⅰ和Ⅱ 2 個(gè)系列小分子抑制劑，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用骨架遷移獲得系列Ⅲ和Ⅳ，再在系列Ⅳ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行環(huán)化或重排，進(jìn)一步得到系列Ⅴ和Ⅵ；隨后在人源急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞來(lái)源的THP1-Dual 細(xì)胞與小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞來(lái)源的RAW-Lucia ISG 細(xì)胞中，測(cè)試新化合物對(duì)cGAS 信號(hào)通路的抑制活性，結(jié)果表明這些新化合物均有較好的cGAS 抑制作用；其中，新化合物25 表現(xiàn)優(yōu)異，LPS 誘導(dǎo)的急性炎癥模型小鼠經(jīng)腹腔注射該化合物后，小鼠血清中的TNF-α，IL-6，IL-12 細(xì)胞因子水平顯著下降，表明其抗炎效果良好，具有應(yīng)用于臨床治療的潛力。目前處于臨床前研究的cGAS 抑制劑見表1。

表1 處于臨床前研究的cGAS 抑制劑Table 1 cGAS inhibitors under pre-clinical research

3.2 STING 抑制劑

隨著對(duì)cGAS-STING 信號(hào)通路認(rèn)識(shí)的加深，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)核酸代謝酶的缺陷或STING 蛋白突變會(huì)引起STING 過(guò)度激活，導(dǎo)致Ⅰ型IFN 等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的持續(xù)表達(dá)與分泌，最終引起自身免疫性疾病，由此促進(jìn)了STING 抑制劑的發(fā)展。目前STING 抑制劑的設(shè)計(jì)都是基于該化合物能夠與2'，3'-cGAMP 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合STING 蛋白。Siu 等[41]應(yīng)用自動(dòng)配體鑒定系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)了化合物C18，2 分子C18 能夠結(jié)合1 個(gè)STING 二聚體蛋白，從而抑制STING 信號(hào)。Li 等[42]從藥用植物紫苑中分離出的AstinC，能夠與STING CTD區(qū)域結(jié)合，通過(guò)阻斷STING 招募IRF3 的過(guò)程，抑制STING 下游通路。Trex1-/-小鼠模型中，給予AstinC，可顯著緩解由于Trex1缺陷導(dǎo)致的自發(fā)性炎癥。

近來(lái)，研究人員開始關(guān)注STING N 端序列中第88 位和第91 位的半胱氨酸殘基（Cys88/Cys91）發(fā)生的棕櫚?；诩せ頢TING 信號(hào)中的重要作用[11]。由此，Hansen 等[43]發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性硝基共軛亞油酸可與STING 蛋白Cys88/Cys91 發(fā)生共價(jià)修飾，破壞STING 棕櫚?；?，影響STING 信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)化學(xué)篩選獲得的化合物C-176 和C-178，也是通過(guò)阻止Cys91 位發(fā)生棕櫚糖基化，抑制STING 通路，但C-176 和C-178 只能抑制鼠源STING（murine STING，mSTING），無(wú)法結(jié)合hSTING[44]。該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步篩選出化合物H-151，是一種選擇性的STING 抑制劑，作用機(jī)制與上述化合物相同，抑制hSTING Cys91 的棕櫚?；?，減少TBK1 磷酸化，在Trex1-/-小鼠模型中顯著改善了自身免疫性疾病發(fā)展的進(jìn)程[44]。Hong 等[45]通過(guò)虛擬篩選和生物活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)了4 種對(duì)STING 具有顯著抑制作用的化合物，并進(jìn)一步確定小分子SN-011 能特異性結(jié)合在STING 與內(nèi)源性配體2'，3'-cGAMP 結(jié)合的口袋內(nèi)，使STING 蛋白保持“開放”的V 型構(gòu)象，阻礙STING 寡聚化、轉(zhuǎn)位和激活。在體內(nèi)外多種模型中，SN-011 能夠顯著降低Ⅰ型IFN 等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌。此外，研究人員對(duì)比了SN-011和H-151 潛在的細(xì)胞毒性，向小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）、3T3 細(xì)胞和敲除Sting基因的MEF 中分別添加不同濃度的SN-011 和H-151，12 ～ 36 h 后檢測(cè)細(xì)胞活力及細(xì)胞存活數(shù)，實(shí)驗(yàn)證明H-151 嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞活力甚至引起死亡，而SN-011 對(duì)細(xì)胞基本無(wú)影響，有望成為一種安全有效的STING 抑制劑。目前處于臨床前研究的STING 抑制劑見表2。

表 2 處于臨床前研究的STING 抑制劑Table 2 STING inhibitors under pre-clinical research

3.3 STING 激動(dòng)劑

STING 是啟動(dòng)下游Ⅰ型IFN 等炎癥因子表達(dá)的重要分子，因此在病毒感染、癌癥中，如何有效激活STING，介導(dǎo)機(jī)體免疫防御，成為近年來(lái)免疫治療的研究熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)cGAS 生成的2'，3'-cGAMP 以及細(xì)菌胞內(nèi)的代謝物環(huán)化二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs）都可與STING 直接結(jié)合，激活STING 下游通路。結(jié)構(gòu)方面，2'，3'-cGAMP與CDNs 主要是磷酸二酯鍵的連接位置不同。與STING 的結(jié)合能力方面，2'，3'-cGAMP 是天然存在的最有效的STING 激動(dòng)劑，研究表明2'，3'-cGAMP與STING 結(jié)合的解離常數(shù)（Kd）是c-di-GMP 和3'，3'-cGAMP 的1/300，是2'，2'-cGAMP 的1/75[46]。然而，直接將天然CDNs 作為STING 激動(dòng)劑應(yīng)用于腫瘤免疫治療，存在穩(wěn)定性差、透過(guò)細(xì)胞膜難等問(wèn)題，影響了誘導(dǎo)Ⅰ型IFN 表達(dá)的能力[47]，且體內(nèi)存在一種核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶1，廣泛分布于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，該酶可水解2'，3'-cGAMP和CDNs，阻止STING 的激活[48]。因此，可對(duì)天然CDNs 進(jìn)行脂質(zhì)體包裹，或納米顆粒多聚體包裹，增強(qiáng)CDNs 在體內(nèi)的透膜性；也可利用硫原子替代磷酸二酯鍵中的氧原子，獲得硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)的CDNs 類似物，使其不易被酶水解[46]，如MLRR-S2-CDA（也稱為MIW815 或ADU-S100），與目前最有效的天然STING 激動(dòng)劑2'，3'-cGAMP（與STING 的結(jié)合能力強(qiáng)于天然CDNs）相比，在小鼠B16 腫瘤模型中表現(xiàn)出更強(qiáng)的IFN-β 誘導(dǎo)能力和腫瘤消退現(xiàn)象。目前，通過(guò)對(duì)天然CDNs 改造、修飾，制備的CDNs 類似物在性能上得到了優(yōu)化，其中一些作為候選藥物已進(jìn)行臨床試驗(yàn)。據(jù)報(bào)道，由強(qiáng)生公司最近開發(fā)的一種CDNs 類STING 激動(dòng)劑JNJ-67544412（簡(jiǎn)稱為JNJ-4412）能與hSTING 所有主要等位基因結(jié)合，比其他CDNs 的親和力更強(qiáng)[49]。在同系腫瘤小鼠模型中，瘤內(nèi)注射JNJ-4412 使腫瘤細(xì)胞和血漿中促炎癥細(xì)胞因子水平升高，CD8+T 細(xì)胞數(shù)量增加，腫瘤細(xì)胞加速凋亡。3'，3'-cyclic AIMP 也是一種新型STING 激動(dòng)劑，在肝細(xì)胞癌（hepatic cell carcinoma，HCC）小鼠模型中，腹腔注射3'，3'-cyclic AIMP 后，STING 功能缺陷小鼠肝表面結(jié)節(jié)變小，腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。在HCC 發(fā)展后期，給予3'，3'-cyclic AIMP，大部分腫瘤出現(xiàn)消退現(xiàn)象[50]。

在臨床開發(fā)中，大多數(shù)CDNs 類似物的STING激動(dòng)劑由于穩(wěn)定性差，導(dǎo)致對(duì)腫瘤中重要免疫細(xì)胞脫靶以及滲漏而引起毒性作用，限制了它們?cè)谀[瘤治療方面的應(yīng)用。為解決這一問(wèn)題，研究人員正試圖用細(xì)菌載體將STING 激動(dòng)劑靶向遞送到腫瘤內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）或是開發(fā)能在全身傳遞的新型化合物。例如，基于細(xì)菌載體的免疫治療法STACT 就是利用減毒鼠傷寒沙門菌攜帶對(duì)TREX1 具有抑制作用的微小RNA。已有研究表明，在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26 和MC38 腫瘤模型中，靜脈注射STACT-TREX1 與體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的極低水平有關(guān)，STACT-TREX1 可特異性定植于腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤消退及再攻時(shí)的持久免疫。與早期的STING 激動(dòng)劑相比，STACT-TREX1 更具優(yōu)勢(shì)，其可靶向腫瘤細(xì)胞更精準(zhǔn)地給藥[51]。

對(duì)STING 激動(dòng)劑的開發(fā)，除了CDNs 類似物的篩選，一些非核苷類的小分子化合物也正在研究中。5，6-二甲基呫噸酮-4-乙酸（5，6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA）是一種強(qiáng)效的小分子mSTING 激動(dòng)劑，在多種小鼠模型中均表現(xiàn)出抗腫瘤活性，但由于種屬特異性，無(wú)法激活hSTING，導(dǎo)致在非小細(xì)胞肺癌Ⅲ期臨床試驗(yàn)中失敗[52]。然而對(duì)mSTING 和hSTING 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)二者僅存在細(xì)微差別[53]。Gao 等[53]發(fā)現(xiàn)，突變后的hSTING 能夠與DMXAA 結(jié)合，且通過(guò)其結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，確定了hSTING 突變的3 個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)均促進(jìn)了hSTING 與DMXAA 的結(jié)合。這為STING 激動(dòng)劑的設(shè)計(jì)提供了新方向，以DMXAA為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，或許能克服種屬問(wèn)題，激活hSTING。其中，單甲基7-methyl-XAA和8-methyl-XAA已被確認(rèn)能激活hSTING，具有一定的抗癌活性[54]。

此外，STING 蛋白的結(jié)合口袋較大，需要結(jié)合的配體相對(duì)分子質(zhì)量約為700 ，但配體相對(duì)分子質(zhì)量較大，就會(huì)存在與天然CDNs 相同的問(wèn)題，因此小分子激動(dòng)劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。通過(guò)與STING 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的高通量篩選法，篩選到小分子STING 激動(dòng)劑二聚氨基苯并咪唑（dimeric amidobenzimidazole，diABZI），其結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)與CDNs 類似物完全不同，但其效力比cGAMP 高約18 倍，能誘導(dǎo)IFN-β 的大量分泌[55]。將diABZI靜脈注射到結(jié)腸腫瘤模型小鼠中，產(chǎn)生了很強(qiáng)的抗腫瘤作用。對(duì)diABZI 進(jìn)一步優(yōu)化得到的diABZI2，活性更高，比cGAMP 強(qiáng)400 多倍。目前處于臨床試驗(yàn)中的STING 激動(dòng)劑見表3，處于體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的STING 激動(dòng)劑見表4。

表 3 處于臨床試驗(yàn)中的STING 激動(dòng)劑Table 3 STING agonists under clinical trial

表 4 處于體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的STING 激動(dòng)劑Table 4 STING agonists in vitro or in animal experiments

續(xù)表3

4 總結(jié)與展望

cGAS-STING 信號(hào)通路是一種細(xì)胞質(zhì)DNA 傳感途徑，啟動(dòng)固有免疫后，驅(qū)動(dòng)Ⅰ型IFN 等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌，進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫，在體內(nèi)發(fā)揮重要的抗感染、抗腫瘤等免疫功能。體內(nèi)存在多種調(diào)控機(jī)制以確保該信號(hào)通路的激活保持在適度的范圍。當(dāng)cGAS-STING 信號(hào)通路紊亂時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致病原體感染和自身免疫性疾病的發(fā)生，甚至促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。

大量臨床前研究和臨床研究表明，cGAS 和STING 靶向藥物在增強(qiáng)腫瘤免疫、改善疾病方面極具潛力，如Bristol-Myers Squibb（BMS）公司開發(fā)的CDNs 類激動(dòng)劑BMS-986301 在臨床前研究中獲得令人滿意的結(jié)果，瘤內(nèi)注射至CT26 和MC38 小鼠腫瘤模型，注射和非注射部位90%以上的腫瘤完全消退，而ADU-S100 僅能使13%的腫瘤消退[66]，目前正在對(duì)晚期實(shí)體瘤患者進(jìn)行BMS-986301 的臨床試驗(yàn)，這些患者在接受腫瘤免疫治療后往往無(wú)明顯療效；Fu 等[67]研發(fā)了一款腫瘤疫苗STINGVAX，在不同腫瘤模型中都表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤作用，其主要組分為CDNs，CDNs 可激活cGAS-STING 信號(hào)通路，促使大量CD8+T 細(xì)胞活化，同時(shí)產(chǎn)生免疫記憶。

雖然cGAS 和STING 相關(guān)藥物研發(fā)前景廣闊，但仍然存在一些問(wèn)題，如：STING 配體結(jié)合口袋較大，而大體積配體的穩(wěn)定性往往較差，對(duì)后續(xù)成藥性造成困難[68]；第1 代CDNs 類化合物的STING激動(dòng)劑只能通過(guò)瘤內(nèi)注射，其應(yīng)用受到限制[48]。因此，應(yīng)積極對(duì)現(xiàn)有化合物進(jìn)行改造或篩選新型化合物，以期改善化合物性能，使其能夠在全身穩(wěn)定地給藥。使用靶向藥物時(shí)，cGAS-STING 信號(hào)通路被激活后是否引發(fā)負(fù)循環(huán)反饋，抑制STING 激動(dòng)劑的作用，這一問(wèn)題仍有待進(jìn)一步的研究。

在開發(fā)藥物的過(guò)程中，除了需要考慮物種特異性外，還應(yīng)考慮個(gè)體的差異。個(gè)體由于自身情況不同，所需的藥物有效劑量上可能存在差異，使用STING激動(dòng)劑時(shí)，應(yīng)兼顧安全性與有效性，使用過(guò)量會(huì)使STING 過(guò)度激活，從而可能會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)——細(xì)胞因子風(fēng)暴[9]，對(duì)身體產(chǎn)生毒性甚至導(dǎo)致死亡。此外，由于單核苷酸多態(tài)性，一些患者可能對(duì)常用的靶向藥物不敏感，因此在腫瘤治療中，應(yīng)針對(duì)不同患者進(jìn)行個(gè)性化治療。

盡管cGAS-STING 信號(hào)通路的過(guò)程較為復(fù)雜，基于該通路的藥物研發(fā)尚處于起步階段，但已發(fā)現(xiàn)多個(gè)明確的切入點(diǎn)：配體結(jié)合、轉(zhuǎn)位、棕櫚?；龋@些研究成果可指導(dǎo)新型靶向藥物的開發(fā)。另外，一些輔助手段的發(fā)展，如cGAS 抑制劑篩選試劑盒和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等也加快了cGAS 和STING靶向藥物開發(fā)的進(jìn)程。同時(shí)，對(duì)調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路過(guò)程中DNA 傳感和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的深入研究，將有利于了解該通路中每一組分的功能，開發(fā)某些間接靶向藥物。進(jìn)一步對(duì)cGAS 和STING 蛋白晶體結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)的分析，也將有助于理解蛋白與配體間的相互作用，發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。