活血榮絡(luò)方調(diào)控生物鐘蛋白Bmal1改善bEnd.3細(xì)胞糖氧剝奪/復(fù)氧損傷后血管新生的機(jī)制研究

張宇星，張 瑛，曾富康，郭 純，高曉峰，李 中，陳 瑤，周德生*，劉利娟*

活血榮絡(luò)方調(diào)控生物鐘蛋白Bmal1改善bEnd.3細(xì)胞糖氧剝奪/復(fù)氧損傷后血管新生的機(jī)制研究

張宇星1，張 瑛1，曾富康1，郭 純2，高曉峰2，李 中2，陳 瑤2，周德生2*，劉利娟2*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410000

基于陰陽理論及活血榮絡(luò)方（Huoxue Rongluo Recipe，HXRL）對腦梗死后血管新生的影響，探討HXRL調(diào)控生物鐘蛋白腦和肌肉芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，Bmal1）促內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的作用機(jī)制。采用Western blotting檢測小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（bEnd.3）受到糖氧剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷后各時(shí)間點(diǎn)生物鐘蛋白Bmal1和Clock的表達(dá)；利用染色質(zhì)免疫共沉淀-測序分析（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）明確Bmal1在全基因組中發(fā)揮的作用，以及對bEnd.3細(xì)胞生物進(jìn)程、細(xì)胞組成及分子功能的影響。采用CCK-8法檢測HXRL含藥血清最佳干預(yù)濃度，敲降bEnd.3細(xì)胞基因，設(shè)置對照組、模型組、HXRL含藥血清組、si-Bmal1組和si-Bmal1＋HXRL含藥血清組，通過劃痕、遷移、成管等實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及血管形成能力；采用免疫熒光檢測各組血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）表達(dá)；采用Western blotting檢測VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP2）、Notch1蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（notch1 intracellular domain，NICD）和δ樣蛋白4（delta-like protein 4，DLL4）蛋白表達(dá)。bEnd.3細(xì)胞受到OGD/R損傷后，Bmal1及Clock蛋白表達(dá)逐漸升高，造模8、12、16、20 h后具有顯著差異（＜0.05、0.001）。ChIP-seq提示Bmal1在內(nèi)皮細(xì)胞中參與細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖等進(jìn)程，靶向調(diào)節(jié)VEGF、Notch1啟動子區(qū)域。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，bEnd.3細(xì)胞受到OGD/R損傷后，10%的HXRL含藥血清可有效改善細(xì)胞活力（＜0.001）。劃痕、遷移及成管實(shí)驗(yàn)證實(shí)HXRL含藥血清可有效改善bEnd.3細(xì)胞OGD/R損傷后的遷移能力及血管生成能力（＜0.05、0.01、0.001），但在敲降株中，該促進(jìn)作用被抑制（＜0.05、0.01、0.001）。免疫熒光及Western blotting結(jié)果顯示，HXRL含藥血清可進(jìn)一步升高OGD/R損傷的bEnd.3細(xì)胞中VEGF、MMP2、NICD、DLL4、Bmal1及Clock蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001），在敲降株中，HXRL含藥血清對VEGF、MMP2、NICD及DLL4的促表達(dá)作用被抑制（＜0.05、0.01、0.001）。HXRL可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)OGD/R損傷后的血管生成能力，其作用機(jī)制與調(diào)控生物鐘Bmal1蛋白密切相關(guān)。

活血榮絡(luò)方；腦梗死；生物鐘蛋白Bmal1；氧糖剝奪；Bmal1敲降株；血管新生

缺血性腦卒中（ischemic cerebral stroke，ICS）是嚴(yán)重危害我國國民健康的重大慢性非傳染性疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)5大特點(diǎn)[1-2]。研究表明，腦梗死周圍區(qū)域的缺血區(qū)微血管密度（microvessel density，MVD）增加可提高ICS患者的生存時(shí)間[3]。盡快建立三級側(cè)支循環(huán)——新生血管可恢復(fù)局部血流供應(yīng)，挽救缺血半暗帶內(nèi)瀕臨死亡的神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)-血管結(jié)構(gòu)的可塑性創(chuàng)造良好的微環(huán)境，恢復(fù)缺損的神經(jīng)功能，改善患者預(yù)后，是當(dāng)前治療的有效策略之一[4-6]。生物節(jié)律是生物體在進(jìn)化過程中，為適應(yīng)光照、溫度等自然節(jié)律變化而形成的以24 h為周期的節(jié)律活動[7]。眾多生物鐘基因[、腦和肌肉芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，）、、]的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋回路（transcriptional/translational feedback loops，TTFLs）產(chǎn)生細(xì)胞自主節(jié)律，影響著機(jī)體的炎癥免疫、代謝等生理病理過程[8-9]。生物節(jié)律顯著影響腦卒中的易感性、損傷、恢復(fù)和對治療的反應(yīng)機(jī)制[10]，生物節(jié)律紊亂可加重腦梗死后神經(jīng)功能缺損癥狀，增加腦梗死面積[11]。過表達(dá)生物鐘基因可促進(jìn)腦梗死后血管新生，研究表明，機(jī)體受到缺血缺氧損傷后，可通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）的血管內(nèi)皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素（angiopoietin，ANG）的表達(dá)，促進(jìn)血管新生[12-13]。

活血榮絡(luò)方是本課題組根據(jù)治療腦梗死多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，在“榮氣虛滯理論”的指導(dǎo)下，依據(jù)陰虛血瘀病機(jī)，制定的具有調(diào)和陰陽、養(yǎng)陰生津、活血養(yǎng)血、舒筋活絡(luò)通脈功效的科室協(xié)議方，其組成以雞血藤、石楠藤為君，生地黃、玄參、黃精為臣，乳香、沒藥為佐、川芎為使[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，活血榮絡(luò)方可明顯增加腦梗死大鼠海馬區(qū)CD34陽性細(xì)胞及皮質(zhì)區(qū)VEGF表達(dá)，增加缺血區(qū)MVD，促血管新生[15]。本研究旨在探討生物鐘蛋白Baml1對內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響以及活血榮絡(luò)方的干預(yù)機(jī)制。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞株

SPF級SD雄性大鼠20只，12～15周齡，體質(zhì)量250～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)許可證號SYXK（湘）2015-0003，依照實(shí)驗(yàn)動物中心管理辦法，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%，通風(fēng)良好，晝夜交替，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號ZYFY20211016）。

1.2 細(xì)胞株

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（bEnd.3，批號CL-0598）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 藥材

雞血藤、石楠藤、生地黃、玄參、黃精、乳香、沒藥、川芎均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張?jiān)Ｃ裰魅嗡帋熻b定分別為豆科植物密花豆Dunn的干燥藤莖、胡椒科植物石楠藤(Miq.) Hand.-Mazz.的干燥帶葉莖枝、玄參科植物地黃Libosch.的干燥塊根、玄參科植物玄參Hemsl.的干燥根、百合科植物黃精Red.的干燥根莖、橄欖科乳香樹屬植物乳香樹Birdw.樹皮滲出的樹脂、橄欖科植物地丁樹Engl.的干燥樹脂、傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖，均符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

1.4 藥品與試劑

嘌呤霉素（批號P8230）購自北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（批號164210-50）、青霉素-鏈霉素混合液（批號PB180120）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（批號PB180229）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號PM150210）、DMEM無糖培養(yǎng)基（批號PM150270）、PBS緩沖液（批號PB180327）、無血清非程序凍存液（批號PB180438）均購自武漢Procell公司；CCK-8試劑盒（批號CK04）購自日本同仁公司；Matrigel基質(zhì)膠（批號356234）購自美國BD公司；Transwell 24孔板（批號3422）購自美國Corning公司；β-actin抗體（批號20536-1-AP）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體（批號10373-2-AP）、神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）抗體（批號10062-2-AP）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號SA00001-2）購自武漢Proteintech公司；VEGF抗體（批號ab52917）、Bmal1抗體（批號ab3350）、驢抗兔IgG H&L抗體（批號ab150075）購自英國Abcam公司；Clock抗體（批號sc-271603）購自美國Santa公司；δ樣蛋白4（delta-like protein 4，DLL4）抗體（批號A12943）購自武漢Abclonal公司；Dylight 549標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號A23320）購自美國Abbkine公司；siRNA慢病毒載體由上海漢恒基因科技有限公司提供。

1.5 儀器

3427型普通培養(yǎng)箱、3131型三氣培養(yǎng)箱、900Series型超低溫冰箱、Fresco17型低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；TD5A型低速離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）；SYG-1210型恒溫水浴鍋（美國Crystal儀器公司）；Axio Vert.A1型倒置顯微鏡（德國ZEISS公司）；Cytation3型多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 活血榮絡(luò)方的制備

取雞血藤30 g、石楠藤30 g、生地黃15 g、玄參10 g、黃精15 g、乳香10 g、沒藥10 g、川芎10 g，加入10倍量水浸泡12 h后，煎煮2 h，濾過；加入8倍量水煎煮1 h，濾過；加入5倍量水，煎煮1 h，濾過，合并3次提取液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮為浸膏，于4 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)高效液相色譜檢測其主要有效成分芒柄花素、薯蕷皂苷、正丁烯基苯酚、黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.298、3.568、1.779、18.634 mg/g。

2.2 活血榮絡(luò)方含藥血清的制備

雄性SD大鼠20只按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組和給藥組（生藥23.4 g/kg）。給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)7 d。于末次給藥1 h后，大鼠ip 10%水合氯醛（3 mg/kg）深度麻醉，暴露腹主動脈，使用負(fù)壓采血管采集全血5 mL至無抗凝劑的普通采血管中，靜置1 h，3000 r/min離心10 min，收集上清于離心管中，于56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過除菌，即為活血榮絡(luò)方含藥血清和對照血清，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)

bEnd.3細(xì)胞用含5% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.4 活血榮絡(luò)方含藥血清對糖氧剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損傷模型細(xì)胞存活率的影響

取對數(shù)生長期的bEnd.3細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，另設(shè)調(diào)零孔（不接種細(xì)胞）。設(shè)置對照組、模型組和給藥組，對照組于正常條件下培養(yǎng)；模型組將培養(yǎng)基更換為DMEM無糖培養(yǎng)基，并將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、95% N2、1% O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，隨后移出三氣培養(yǎng)箱，更換為完全培養(yǎng)基于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；給藥組將培養(yǎng)基更換為DMEM無糖培養(yǎng)基，缺氧培養(yǎng)6 h，隨后移出三氣培養(yǎng)箱，分別加入5%、10%、15%、20%的活血榮絡(luò)方含藥血清，于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－調(diào)零)/(對照－調(diào)零)

2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀-測序分析（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）獲取轉(zhuǎn)錄因子Bmal1的DNA結(jié)合片段

以37%的甲醛溶液交聯(lián)固定培養(yǎng)瓶內(nèi)bEnd.3細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中加入甘氨酸室溫終止反應(yīng)，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，離心，使用細(xì)胞裂解液和ChIP緩沖液混合物充分裂解細(xì)胞；冰上超聲處理DNA片段，10 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA長度（200 bp左右）；各取100 μL超聲產(chǎn)物置于2 mL EP管中并標(biāo)記為IgG組、IP組和Input組，其余上清分裝后于?80 ℃保存。在各EP管中加入900 μL ChIP緩沖液，IP組加入5 μL Bmal1抗體，IgG組加入5 μL IgG血清，充分混勻后4 ℃孵育過夜；加入40 μL經(jīng)過洗滌、魚精DNA封閉、TE洗滌的Protein G凝膠，于4 ℃混合器中孵育1～2 h，3000 r/min離心2 min沉淀凝膠，取上清暫存，留沉淀，依次用低鹽洗脫緩沖液、高鹽洗脫緩沖液和TE緩沖液沖洗，3000 r/min離心2 min后沉淀凝膠，吸取上清；每管加200 μL ChIP洗脫緩沖液，溫和渦旋，65 ℃孵育30 min，間隔5 min拿出溫和振蕩；每管加入NaCl解交聯(lián)；DNA產(chǎn)物純化回收，將回收的DNA進(jìn)行高通量測序。

2.6 bEnd.3細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染及鑒定

bEnd.3細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)感染復(fù)數(shù)（MOI）＝30計(jì)算，使用10 μLsiRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染bEnd.3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基。72 h后加入含5 μg/mL嘌呤霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況達(dá)到95%以上，最終得到si-Bmal1慢病毒轉(zhuǎn)染的bEnd.3細(xì)胞穩(wěn)定株。

2.7 分組及給藥

設(shè)置對照組、模型組、活血榮絡(luò)方組、si-Bmal1組和si-Bmal1＋活血榮絡(luò)方組。對照組于正常條件下培養(yǎng)；模型組按“2.4”項(xiàng)下方法處理；活血榮絡(luò)方組將培養(yǎng)基更換為DMEM無糖培養(yǎng)基，缺氧培養(yǎng)6 h后，加入10%活血榮絡(luò)方含藥血清，于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；si-Bmal1組在模型組基礎(chǔ)上進(jìn)行si-Bmal1慢病毒轉(zhuǎn)染；si-Bmal1＋活血榮絡(luò)方組在si-Bmal1組基礎(chǔ)上加入10%活血榮絡(luò)方含藥血清干預(yù)24 h。

2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測bEnd.3細(xì)胞遷移能力

用標(biāo)記筆在6孔板背后劃5條間距均勻的橫線，以作參考。每孔加入2×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到85%，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h進(jìn)行周期同步化，用移液槍頭尖端劃過單層細(xì)胞，用PBS清洗脫落的細(xì)胞。按“2.7”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及給藥，于顯微鏡下觀察并拍照，記錄0、24 h劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。

劃痕愈合率＝(0 h劃痕面積－24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積

2.9 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測bEnd.3細(xì)胞遷移能力

將bEnd.3細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種到Transwell上腔室，按“2.7”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及給藥，對照組、模型組和si-Bmal1組上、下室均添加含藥血清的DMEM無糖培養(yǎng)基，給藥組添加10%活血榮絡(luò)方含藥血清的DMEM無糖培養(yǎng)基。缺氧處理6 h后，將下室的培養(yǎng)基替換為600 μL含20% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基及質(zhì)量濃度為20 μg/L的VEGF，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后，去除殘留在上室膜表面的細(xì)胞。下室膜表面的bEnd.3細(xì)胞用4%甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。染色細(xì)胞拍照并在5個(gè)隨機(jī)鏡下計(jì)數(shù)，用Image J軟件進(jìn)行定量。

2.10 Matrigel基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測bEnd.3細(xì)胞管腔形成能力

將基質(zhì)膠于4 ℃冰箱過夜融化，96孔板和200 μL槍頭在4 ℃冰箱預(yù)冷備用。于冰上以基質(zhì)膠（50 μL/孔）包被96孔板，置于培養(yǎng)箱凝固60 min。取處于對數(shù)生長期的bEnd.3細(xì)胞，用含10%對照血清和活血榮絡(luò)方含藥血清的DMEM高糖培養(yǎng)基分別重懸細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種至提前用基質(zhì)膠包被的96孔板，缺氧培養(yǎng)6 h，于顯微鏡下觀察，拍照成管細(xì)胞，并隨機(jī)選取3個(gè)視野，用Image Pro Plus 6.0分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每孔4個(gè)隨機(jī)選定視野下分支點(diǎn)。

2.11 Western blotting檢測細(xì)胞中Bmal1、Clock、VEGF、MMP-2、Notch-1及DLL4蛋白表達(dá)

bEnd.3細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，缺氧處理6 h后，分別于4、8、12、16、20、24 h收集細(xì)胞，用以檢測生物鐘蛋白變化。藥物組則分別加入10%對照血清和活血榮絡(luò)方含藥血清作用24 h后收集細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫?fù)u床封閉2 h，分別加入Bmal1抗體（1∶2000）、Clock抗體（1∶400）、VEGF抗體（1∶2000）、MMP2抗體（1∶1000）、Notch1抗體（1∶1500）、DLL4抗體（1∶1500）和β-actin抗體（1∶8000），4 ℃孵育過夜；洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶8000），室溫?fù)u床孵育2 h；洗膜后加入ECL超敏發(fā)光液，采用凝膠成像儀進(jìn)行成像，運(yùn)用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.12 免疫熒光檢測細(xì)胞中VEGF和Notch-1蛋白表達(dá)

取處于對數(shù)生長期的bEnd.3細(xì)胞，以5×103/孔接種于預(yù)先放置好爬片的24孔板中，當(dāng)融合度達(dá)到20%～30%時(shí)，缺氧處理6 h，再給予10%活血榮絡(luò)方含藥血清正常處理24 h。棄去培養(yǎng)液，各孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min；PBS緩沖液潤洗細(xì)胞后，加入500 μL 0.25% TritonX-100破膜3 min；PBS緩沖液潤洗后，加入5%牛血清白蛋白，室溫封閉30 min；分別添加100 μL VEGF和Notch1抗體（1∶100），4 ℃過夜；PBS潤洗后，分別滴加100 μL驢抗兔IgG H&L抗體和Dylight 549標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體和（1∶500），室溫避光孵育60 min；PBS緩沖液潤洗細(xì)胞，滴加DAPI，室溫避光孵育3～5 min；PBS緩沖液潤洗后，取載玻片，滴加10 μL抗熒光衰減封片劑，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 OGD/R增加bEnd.3生物鐘蛋白Bmal1及Clock表達(dá)

首先對bEnd.3細(xì)胞進(jìn)行周期同步化，糖氧剝奪6 h后復(fù)糖復(fù)氧，并在隨后的20 h內(nèi)，每4小時(shí)提取蛋白，檢測生物鐘蛋白Bmal1與Clock表達(dá)變化。如圖1所示，復(fù)糖復(fù)氧4 h，生物鐘蛋白Bmal1與Clock表達(dá)無明顯變化，復(fù)糖復(fù)氧8 h二者表達(dá)量與對照組比較均明顯升高（＜0.05），復(fù)糖復(fù)氧12～20 h，Bmal1與Clock蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.001）。表明OGD/R損傷可使內(nèi)皮細(xì)胞生物鐘發(fā)生改變，且呈不斷升高的趨勢，根據(jù)本研究結(jié)果，將糖氧剝奪6 h/復(fù)糖復(fù)氧12 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)方案。

3.2 Bmal1蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能分析

生物鐘蛋白可調(diào)控分子功能，參與細(xì)胞增殖、遷移、分化等生物進(jìn)程。Bmal1可促進(jìn)血管新生，減輕缺氧缺氧損傷，但其在內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚未報(bào)道，故借助ChIP-seq技術(shù)探究Bmal1在內(nèi)皮細(xì)胞中的全基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。使用特異性抗體Bmal1（IP級別）與DNA片段進(jìn)行交聯(lián)形成復(fù)合物后發(fā)生免疫沉淀（圖2）。

A-對照組 B-4 h組 C-8 h組 D-12 h組 E-16 h組 F-20 h組 與對照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

解交聯(lián)后純化的DNA片段進(jìn)行高通量測序，得到與蛋白質(zhì)相結(jié)合的DNA序列信息，通過對該序列的長度和比對到該序列上的Pair and Read數(shù)來確定該序列對應(yīng)的峰的相對豐度。圖3顯示Peak在基因組的不同功能區(qū)分布情況，結(jié)合啟動子-轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（promotor-transcriptional start site region，promotor-TSS）達(dá)7.77%，圖4顯示在TSS上下游2000個(gè)bp所捕獲reads數(shù)?；虮倔w（gene ontology，GO）功能富集分析獲得生物進(jìn)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）相關(guān)基因的分布（圖5），靶點(diǎn)涉及的BP條目主要富集在細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)再生分化、細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等，靶點(diǎn)涉及的MF相關(guān)的條目主要富集在離子結(jié)合、小分子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶激活等，靶點(diǎn)涉及CC相關(guān)主要富集在胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞骨架、神經(jīng)元細(xì)胞等。

圖2 Western blotting檢測bEnd.3細(xì)胞免疫共沉淀

圖3 Peak在基因組功能區(qū)的分布

圖4 Reads在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS區(qū)) 兩側(cè)的分布(n = 3)

圖5 Bmal1在內(nèi)皮細(xì)胞潛在靶點(diǎn)GO功能富集分析

關(guān)聯(lián)分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，Bmal1蛋白可以靶向結(jié)合小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管新生關(guān)鍵基因，如17號染色體上基因的啟動子序列（位點(diǎn)46030452～46030695），2號染色體上基因的增強(qiáng)子序列（位點(diǎn)26463954～26464324），16號染色體上基因的啟動子序列（位點(diǎn)30066868～30067165、30065082～30065373、30064015～30064496）。

3.3 活血榮絡(luò)方含藥血清對OGD/R誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損傷模型細(xì)胞存活率的影響

為探索活血榮絡(luò)方對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及與生物節(jié)律聯(lián)系的作用機(jī)制，首先通過CCK-8檢測活血榮絡(luò)方含藥血清對OGD/R損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。如圖7所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，10%、15%活血榮絡(luò)方含藥血清組細(xì)胞存活率均顯著升高（＜0.01、0.001），且10%活血榮絡(luò)方含藥血清作用最佳。表明活血榮絡(luò)方含藥血清能減輕OGD/R誘導(dǎo)的bEnd.3細(xì)胞損傷，具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，故以10%含藥血清作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

圖6 Reads在關(guān)聯(lián)基因VEGF、Notch1和HES1的分布情況(n = 3)

3.4 活血榮絡(luò)方含藥血清對OGD/R誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損傷模型遷移能力的影響

本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，活血榮絡(luò)方可有效促進(jìn)腦梗死大鼠血管新生，為探索活血榮絡(luò)方對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及與生物節(jié)律聯(lián)系的作用機(jī)制，利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建生物鐘基因敲降bEnd.3細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，用于體外驗(yàn)證。于熒光顯微鏡下觀察慢病毒綠色熒光蛋白表達(dá)率，轉(zhuǎn)染效率達(dá)97%以上時(shí)，提取RNA及蛋白驗(yàn)證的mRNA與蛋白敲降效率，如圖8所示，在3組siRNA中，siRNA2的敲降效率最佳，的mRNA及蛋白表達(dá)均下降50%左右，故將siRNA2穩(wěn)轉(zhuǎn)株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

A-對照組 B-模型組 C-5% HXRL組 D-10% HXRL組 E-15% HXRL組 F-20% HXRL組 與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001

A-對照組 B-siRNA1沉默組 C-siRNA2沉默組 D-siRNA3沉默組 與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

利用劃痕、Transwell研究內(nèi)皮細(xì)胞血管生成表型，如圖9所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞遷移率顯著升高（＜0.01、0.001），表明OGD/R損傷促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞遷移；與模型組比較，si-Bmal1組細(xì)胞遷移率顯著降低（＜0.05、0.01），提示敲降后，細(xì)胞遷移能力受限；活血榮絡(luò)方可進(jìn)一步提升bEnd.3細(xì)胞OGD/R損傷后的遷移能力（＜0.01、0.001），敲降細(xì)胞株中，活血榮絡(luò)方的促遷移能力受到限制（＜0.01、0.001）。

3.5 活血榮絡(luò)方含藥血清對OGD/R誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損傷模型成管能力的影響

管腔形成是評價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力的另一重要指標(biāo)，利用成管實(shí)驗(yàn)評價(jià)Bmal1與HXRL對bEnd.3細(xì)胞OGD/R損傷模型的影響。如圖10所示，與對照組比較，模型組血管分支總長度顯著增加（＜0.01），提示OGD/R損傷顯著促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞成管能力；與模型組比較，si-Bmal1組血管分支總長度明顯下降（＜0.01），表明敲降可降低bEnd.3細(xì)胞的管腔形成能力；活血榮絡(luò)方組血管分支總長度增加（＜0.05），敲降后，血管分支總長度則明顯下降（＜0.05），表明活血榮絡(luò)方具有促bEnd.3細(xì)胞OGD/R損傷后的管腔形成能力，而在敲降株中該促進(jìn)作用被抑制。

3.6 活血榮絡(luò)方含藥血清對OGD/R誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損傷模型中生物鐘及血管新生關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

VEGF及Notch1是內(nèi)皮細(xì)胞參與血管新生的重要分子，Bmal1可調(diào)控上述關(guān)鍵分子的轉(zhuǎn)錄過程，采取免疫熒光法檢測各組細(xì)胞中VEGF及Notch1蛋白表達(dá)。如圖11所示，與對照組比較，模型組VEGF及Notch1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，si-Bmal1組VRGF及Notch1蛋白表達(dá)水平顯著下降（＜0.01、0.001）；活血榮絡(luò)方含藥血清可進(jìn)一步上調(diào)VEGF及Notch1蛋白表達(dá)水平（＜0.001），敲降后，VEGF及Notch1蛋白表達(dá)水平顯著下降（＜0.01、0.001）。

A-對照組 B-模型組 C-HXRL組 D-si-Bmal1組 E-si-Bmal1+HXRL組 與對照組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與HXRL組比較：&P＜0.05 &&P＜0.01 &&&P＜0.001；與si-Bmal1組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖10 Bmal1及活血榮絡(luò)方對bEnd.3細(xì)胞成管能力的影響(, n = 3)

Western blotting檢測結(jié)果見圖12、13，與對照組比較，模型組Clock、Bmal1、NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）；給予活血榮絡(luò)方含藥血清干預(yù)后，Clock、Bmal1、NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高（＜0.05、0.01、0.001），敲降后，NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

圖11 Bmal1及活血榮絡(luò)方對bEnd.3細(xì)胞內(nèi)VEGF和Notch1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖12 活血榮絡(luò)方對bEnd.3細(xì)胞Clock和Bmal1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖13 Bmal1及活血榮絡(luò)方對bEnd.3細(xì)胞NICD、DLL4、MMP2及VEGF蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

腦梗死的損害主要來源于血液灌注不足引起的持續(xù)缺氧損傷，側(cè)支循環(huán)作為重要的保護(hù)補(bǔ)償機(jī)制，可通過增加血液灌注，恢復(fù)氧供，改善ICS的預(yù)后[16]。血管新生屬于三級側(cè)支循環(huán)，由現(xiàn)有的血管中分離形式微血管網(wǎng)絡(luò)，向發(fā)生在邊界區(qū)的受影響區(qū)域提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，是應(yīng)對腦梗死的關(guān)鍵保護(hù)機(jī)制[17-18]。研究表明，在腦梗死患者和動物模型中，血管生成可通過促進(jìn)組織修復(fù)、血管重塑、改善缺血周圍組織灌流，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[19-21]。因此，促進(jìn)缺血后血管生成是臨床治療腦梗死的關(guān)鍵目標(biāo)之一[5,21-23]。

哺乳動物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)由中樞下丘腦視交叉上核和外周器官（包括血管、心臟等器官）中的晝夜節(jié)律振蕩器組成。這些振蕩器通過多個(gè)生物鐘基因（包括、、、家族基因）的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋回路產(chǎn)生細(xì)胞自主節(jié)律。這種多振蕩器系統(tǒng)在所有生理系統(tǒng)（包括心血管、代謝、免疫和炎癥功能）中產(chǎn)生內(nèi)源性晝夜節(jié)律，該網(wǎng)絡(luò)的破壞會導(dǎo)致內(nèi)部不同步和晝夜節(jié)律紊亂，促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律紊亂可升高ICS發(fā)病率，與高密度脂蛋白膽固醇水平降低、三酰甘油水平升高、皮質(zhì)醇節(jié)律紊亂、C反應(yīng)蛋白升高、血壓升高、胰島素敏感性降低和葡萄糖水平升高的糖尿病前期狀態(tài)密切相關(guān)[10,26-29]。此外，晝夜節(jié)律紊亂可增加ICS梗死面積，加重免疫炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮功能[11,30]。晝夜節(jié)律不僅是ICS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在ICS后的血管新生進(jìn)程中，同樣發(fā)揮著不可替代的作用。研究表明，生物鐘蛋白調(diào)控促血管生成因子的分泌、基底膜（basement membrane，BM）降解、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）重塑及內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移。?∕?小鼠中MMPs家族蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)BM降解與ECM重塑[31]。過表達(dá)可通過調(diào)控VEGF啟動子活性，上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)缺血缺氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力，敲降表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Bmal1的促血管新生作用[13]。綜上，晝夜節(jié)律影響著腦梗死發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，其關(guān)鍵分子在腦梗死后的血管新生發(fā)揮不可替代的作用。

晝夜節(jié)律與祖國醫(yī)學(xué)中的陰陽平衡理論高度契合。自然界的晝夜變化之間，陰陽在不斷地進(jìn)行節(jié)律性的交替轉(zhuǎn)化，人體的生理活動隨著晝夜變化發(fā)生相應(yīng)變化，影響著人體內(nèi)的陰陽平衡[32]。《雜病廣要》記載：“夫中風(fēng)者，皆因陰陽不調(diào)，臟腑氣偏，榮衛(wèi)失度”，指出陰陽失衡是腦梗死發(fā)生的根本，恢復(fù)臟腑功能、調(diào)節(jié)榮衛(wèi)之司為診治腦卒中的關(guān)鍵。其中精、血、津液屬陰，氣屬陽，“陰在內(nèi)，陽之守也；陽在外，陰之使也”，即達(dá)到人體陰陽動態(tài)平衡，故陰陽平衡理論對診治腦梗死具有較高的臨床指導(dǎo)意義。本課題組根據(jù)多年的臨床實(shí)踐與理論探索，在腦藏象理論的指導(dǎo)下，提出榮氣為精、氣、血、津液等精微物質(zhì)的總稱，各種成分相互依存、平衡轉(zhuǎn)化，是維持生命健康的重要條件[14]。當(dāng)腦梗死疾病發(fā)生后，陰陽失調(diào)，榮氣虛滯，精微物質(zhì)匱乏致滋養(yǎng)不足，榮氣之榮養(yǎng)、化變、成形功能障礙，新生血管受限[33]?；陉庩柪碚摷皹s氣理論，創(chuàng)制具有調(diào)和陰陽、養(yǎng)陰生津、活血養(yǎng)血等功效的活血榮絡(luò)方，該方為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，納入臨床路徑達(dá)13年。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，活血榮絡(luò)方可上調(diào)VEGF、Kruppel樣因子4（kruppel-like factor 4，KLF4）、微囊蛋白-1（caveolin-1，CAV-1）表達(dá)，下調(diào)MMP9表達(dá)，激活Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，減輕腦梗死急性期炎性反應(yīng)，增加MVD，促進(jìn)血管新生，改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損癥狀[15]。

本研究結(jié)果表明，活血榮絡(luò)方具有促進(jìn)OGD/R損傷的bEnd.3細(xì)胞的血管新生能力，且該促進(jìn)作用依賴于對生物鐘蛋白Bmal1的調(diào)控。首先，bEnd.3細(xì)胞受到OGD/R損傷后，生物鐘蛋白Bmal1及Clock的表達(dá)隨時(shí)間延長而升高，表達(dá)量于12～20 h顯著升高，提示二者可能在OGD/R損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用，故利用ChIP-seq探究Bmal1在內(nèi)皮細(xì)胞中全基因組的調(diào)控功能，發(fā)現(xiàn)Bmal1參與細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)再生分化、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖等生物進(jìn)程，并與血管新生關(guān)鍵分子VEGF、Notch1等啟動子區(qū)靶向結(jié)合，可作為轉(zhuǎn)錄激活因子，直接調(diào)節(jié)生長因子的表達(dá)，表明Bmal1可能在OGD/R損傷后的血管新生進(jìn)程中扮演著不可或缺的角色。既往研究表明，?∕?小鼠的后肢在缺血缺氧損傷后，其血管生成能力顯著下降，VEGF表達(dá)降低，過表達(dá)則可明顯促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的遷移和成管能力[13]。為此，進(jìn)一步構(gòu)建bEnd.3細(xì)胞敲降株，以探究Bmal1及活血榮絡(luò)方含藥血清對OGD/R損傷的bEnd.3細(xì)胞血管生成能力的影響。結(jié)果顯示，敲降的bEnd.3細(xì)胞在受到OGD/R損傷后，遷移能力及成管能力下降。同時(shí)，活血榮絡(luò)方表現(xiàn)出了有效的促內(nèi)皮細(xì)胞遷移及成管的能力，但此促進(jìn)作用在敲降株中被逆轉(zhuǎn)，提示活血榮絡(luò)方的促血管新生作用可能依賴于對Bmal1的調(diào)控。

Western blotting結(jié)果顯示，OGD/R損傷可顯著升高bEnd.3細(xì)胞中生物鐘蛋白Bmal1及Clock表達(dá)，活血榮絡(luò)方進(jìn)一步升高二者蛋白表達(dá)，提示具有調(diào)和陰陽的活血榮絡(luò)方在調(diào)節(jié)OGD/R損傷后生物節(jié)律的過程中，發(fā)揮有效且顯著的效果。免疫熒光及Western blotting結(jié)果表明，活血榮絡(luò)方同樣可進(jìn)一步升高血管新生關(guān)鍵分子NICD、DLL4、MMP2及VEGF的蛋白表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)血管新生的作用，但該促進(jìn)效果在基因敲降的bEnd.3細(xì)胞株中收到抑制，可見活血榮絡(luò)方的促血管新生作用依賴于對生物節(jié)律的調(diào)控。

生物節(jié)律調(diào)節(jié)哺乳動物生理和病理的大部分過程。大量的研究表明生物節(jié)律和血管生成相互作用，共同影響腦梗死后缺血缺氧損傷的恢復(fù)。綜上，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到缺血缺氧損傷后陰陽失衡，榮氣中精微物質(zhì)的消長轉(zhuǎn)化受限，而活血榮絡(luò)方能夠有效通過調(diào)和陰陽，改善其生物節(jié)律，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞榮氣之榮養(yǎng)、化變、成形功能。本研究為進(jìn)一步中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，豐富現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Huoxue Rongluo Recipe on regulating circadian clock protein Bmal1 to improve angiogenesis in bEnd.3 cells after oxygen-glucose deprivation/ reperfusion injury

ZHANG Yu-xing1, ZHANG Ying1, ZENG Fu-kang1, GUOChun2, GAO Xiao-feng2, LI Zhong2, CHEN Yao2, ZHOU De-sheng2,LIU Li-juan2

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410000, China 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410000, China

To explore the mechanism of Huoxue Rongluo Recipe (活血榮絡(luò)方, HXRL) on promoting endothelial cells angiogenesis via regulating circadian protein brain and muscle arnt-like 1 (Bmal1) based on the theory of yin-yang and the effect of HXRL on angiogenesis after cerebral infarction.Western blotting was used to detect the expressions of circadian proteins Bmal1 and Clock at each time point after bEnd.3 cells were injured by oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R). Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) was used to determine the role of Bmal1 in genome wide, and its effects on bEnd.3 cell biological process, cell component and molecular function. The optimal intervention concentration of HXRL containing serum was detected by CCK-8 method.gene was knocked down in bEnd.3 cells and divided into control group, model group, HXRL containing serum group, si-Bmal1 and si-Bmal1 + HXRL containing serum group. The expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and neurogenic locus notch homolog protein 1 (Notch1) were detected by immunofluorescence. Western blotting was used to detect VEGF, matrix metalloproteinases 2 (MMP2), Notch1 intracellular domain (NICD) and delta-like protein 4 (DLL4) protein expressions.After bEnd.3 cells were injured by OGD/R, the expressions of Bmal1 and Clock proteins were gradually increased, and there were significant differences at 8, 12, 16 and 20 h points after modeling (< 0.05, 0.001). ChIP-seq suggests that Bmal1 was involved in cell development, differentiation, proliferation, and other processes in endothelial cells, and targeted the transcriptional start site region of VEGF and Notch1. The results of CCK-8 experiment showed that after bEnd.3 cells were injured by OGD/R, 10% HXRL-containing serum could effectively improve cell viability (< 0.001). Scratch, migration and tube formation experiments confirmed that HXRL-containing serum could effectively improve the migration ability and angiogenesis ability of bEnd.3 cells after OGD/R injury (< 0.05, 0.01, 0.001), but inknockdown strains, this promotion was suppressed (< 0.05, 0.01, 0.001). The results of immunofluorescence and Western blotting showed that HXRL-containing serum could further increase the protein expressions of VEGF, MMP2, NICD, DLL4, Bmal1 and Clock in bEnd.3 cells damaged by OGD/R (< 0.05, 0.01, 0.001). Inknockdown strain, the promoting effect of HXRL-containing serum on the expressions of VEGF, MMP2, NICD and DLL4 was inhibited (< 0.05, 0.01, 0.001).HXRL can effectively promote the angiogenesis of endothelial cells after OGD/R injury, and its mechanism is closely related to the regulation of circadian clock Bmal1 protein.

Huoxue Rongluo Recipe;ischemic stroke; circadian clock protein Bmal1; oxygen-glucose deprivation; Bmal1 knockdown strain; angiogenesis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6509 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.023

2022-06-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82104766）；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2021JJ30521，2021JJ40424）；湖南省衛(wèi)健委科研項(xiàng)目（202103071190）；湖南省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（2021218）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目（2020ZXYJH38，2020ZXYJH39）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金與聯(lián)合基金項(xiàng)目（2021XJJJ039，2021XJJJ052）

張宇星，男，博士，從事中醫(yī)藥對腦血管病及其并發(fā)癥的防治研究。Tel: 15616213284 E-mail: yuxing-zhang@foxmail.com

周德生，男，博士，主任醫(yī)師，從事中醫(yī)藥對腦血管病及其并發(fā)癥的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 2478020529@qq.com

劉利娟，女，博士，副主任醫(yī)師，從事中醫(yī)藥對腦血管病及其并發(fā)癥的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 601264967@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]