Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法優(yōu)化經(jīng)典名方小承氣湯的提取工藝

趙玥瑛，王昌海，張澤康，張 晴，郭明雪，孫 萌，席 鋮，楊雪穎，董 爽，張馨雨，杜守穎，陸 洋，白 潔

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法優(yōu)化經(jīng)典名方小承氣湯的提取工藝

趙玥瑛，王昌海，張澤康，張 晴，郭明雪，孫 萌，席 鋮，楊雪穎，董 爽，張馨雨，杜守穎，陸 洋*，白 潔*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵權(quán)法優(yōu)化經(jīng)典名方小承氣湯的提取工藝。以蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林含量、出膏率及指紋圖譜相似度為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs），以加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPPs），采用單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素水平，Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝參數(shù)并進(jìn)行驗(yàn)證。最后，計(jì)算不同提取參數(shù)的各評(píng)價(jià)指標(biāo)下各樣品與基準(zhǔn)樣品的基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度，采用AHP-熵權(quán)法確定各種評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行綜合評(píng)分，預(yù)測(cè)最佳提取工藝。方差分析結(jié)果顯示，2次項(xiàng)回歸模型的方差顯著（＜0.01），且失擬值不顯著，表明所建模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用所建模型進(jìn)行函數(shù)化。確定最佳提取工藝為全方飲片加6倍量水，提取30 min，提取1次。平行3次的驗(yàn)證試驗(yàn)綜合評(píng)分均值為95.37，RSD為2.31%，且符合基準(zhǔn)樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)?；谫|(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）理念、基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法篩選的經(jīng)典名方小承氣湯提取工藝參數(shù)穩(wěn)健可靠，同時(shí)為其他經(jīng)典名方的制備工藝開發(fā)提供了參考。

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)；經(jīng)典名方；小承氣湯；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度；層次分析法-熵權(quán)法；蘆薈大黃素；大黃酚；厚樸酚；辛弗林；指紋圖譜；關(guān)鍵質(zhì)量屬性；關(guān)鍵工藝參數(shù)

經(jīng)典名方小承氣湯（Xiaochengqi Decoction）出自《傷寒論》（東漢·張仲景），被收載于《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[1]。全方由大黃、厚樸、枳實(shí)3味藥組成，具有瀉熱通便、消脹除滿的功效，主治痞、滿、實(shí)而不燥之陽(yáng)明腑實(shí)證，癥見潮熱、譫語(yǔ)、大便不通，效果顯著[2]?，F(xiàn)代應(yīng)用主要集中在便秘[3-6]、術(shù)后胃腸功能紊亂[7-10]、和術(shù)后早期炎性腸梗阻[11-12]。臨床上熱性感染性疾病中期，如大葉性肺炎、流行性腦膜炎等出現(xiàn)便秘，胸腹脹滿，高熱譫語(yǔ)，口渴，舌苔老黃等實(shí)熱癥候時(shí)，用小承氣湯酌加清熱解毒之品，收效頗著[13]。

經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑的開發(fā)需基于基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)保證關(guān)鍵質(zhì)量屬性與基準(zhǔn)樣品的一致性。但由于工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)提取方式、提取容器等的變化以及受成本、效率的影響，提取時(shí)間可能發(fā)生較大改變，導(dǎo)致中試產(chǎn)品和基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量不一致，因此，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代提取工藝與傳統(tǒng)制法的質(zhì)量一致性是經(jīng)典名方研究的關(guān)鍵所在，需統(tǒng)籌考慮提取工藝各因素對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響。質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）是一種系統(tǒng)的研發(fā)方法，需要在可靠的科學(xué)和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理基礎(chǔ)上，預(yù)先定義好目標(biāo)，強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品和工藝的理解以及對(duì)工藝的控制[14-15]。本研究采用基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度（standard relation，SR）來(lái)評(píng)價(jià)現(xiàn)代提取工藝下各樣品與基準(zhǔn)樣品間質(zhì)量的一致性，SR值越接近100%，則該樣品與基準(zhǔn)樣品越接近。層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵權(quán)法將主觀賦權(quán)法和客觀賦權(quán)法相結(jié)合，用于確定不同測(cè)定指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，所得評(píng)價(jià)結(jié)果更加真實(shí)科學(xué)[16]。本研究基于QbD理念篩選小承氣湯的最優(yōu)提取工藝參數(shù)。計(jì)算不同提取參數(shù)的各種評(píng)價(jià)指標(biāo)下各樣品與基準(zhǔn)樣品的基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度，采用AHP-熵權(quán)法確定各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行模型預(yù)測(cè)，以保證在所篩選的提取工藝參數(shù)下制備的樣品與基準(zhǔn)樣品保持質(zhì)量一致，確保提取工藝的穩(wěn)定可靠，為小承氣湯的后續(xù)開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)夯實(shí)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WT3003型電子天平，杭州萬(wàn)特衡器有限公司；JM-B10002型電子天平，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSA 224S型電子分析天平、BT 125D型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-6型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；DZF-6051型真空干燥器，北京利康達(dá)圣科技有限公司；BY-400C-1型醫(yī)用離心機(jī)、G20型醫(yī)用離心機(jī)，北京白洋醫(yī)療器械有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DHG-9140 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DZTW型電子調(diào)溫電熱套500 mL，北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司；MH-2000可調(diào)式電熱套2000 mL、MH-3000可調(diào)式電熱套3000 mL、MH-5000可調(diào)式電熱套5000 mL，北京科偉永興儀器有限公司；Thermo UItimate 3000高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，CM7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 試藥

酒洗大黃飲片（批號(hào)1-21030301，產(chǎn)地四川阿壩縣）、姜厚樸飲片（批號(hào)1-20042001，產(chǎn)地陜西城固縣）、清炒枳實(shí)飲片（批號(hào)1-21030601，產(chǎn)地湖南漢壽縣），均購(gòu)自河北萬(wàn)歲藥業(yè)有限公司，分別經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系劉春生教授鑒定為蓼科大黃屬植物藥用大黃Baill.的干燥根和根莖，木蘭科木蘭屬植物厚樸Rehd. et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮和蕓香科柑橘屬植物酸橙L.的干燥幼果的炮制加工品。

對(duì)照品蘆薈大黃素（批號(hào)110795-202011，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.5%）、大黃酚（批號(hào)110796-201922，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、厚樸酚（批號(hào)110729-202015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、辛弗林（批號(hào)110727-202110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%），中國(guó)食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇，色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；甲酸，色譜級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 小承氣湯提取液的制備[17]

稱取酒洗大黃55.2 g、姜厚樸27.6 g、清炒枳實(shí)39.0 g，加入一定倍量的去離子水，加熱回流提取，用1層300目尼龍篩網(wǎng)濾過(guò)，調(diào)整濾液體積至適宜體積即得小承氣湯。

2.2 小承氣湯指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品3.63 mg、大黃酚對(duì)照品5.59 mg、厚樸酚對(duì)照品6.62 mg，用甲醇充分溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中；精密稱取辛弗林對(duì)照品9.47 mg，用甲醇充分溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中；分別加甲醇溶解定容至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為141.57、222.26、262.15、378.04 μg/mL的對(duì)照品母液。再精密移取1 mL母液至25 mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為5.66、8.89、10.49、15.12 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備[17]移取小承氣湯提取液3 mL于15 mL離心管內(nèi)，加入7 mL甲醇，搖勻后，5000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液1。精密移取上述離心后的上清液5 mL，通過(guò)聚酰胺柱（60～90目，2.5 g，內(nèi)徑1.5 cm，干法裝柱），用水20 mL洗脫，收集洗脫液于25 mL量瓶?jī)?nèi)，加水定容搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，得供試品溶液2。

2.2.3 色譜條件[17]

（1）供試品溶液1：色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，洗脫梯度：0～10 min，15%乙腈；10～30 min，15%～20%乙腈；30～95 min，20%～30%乙腈；95～135 min，30%～60%乙腈；135～140 min，60%～95%乙腈；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

（2）供試品溶液2：色譜柱為Thermo Umisil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1000 mL），等度洗脫：0～20 min，51%甲醇；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積30 μL。

2.3 出膏率的測(cè)定

將小承氣湯提取液濃縮到相對(duì)密度1.20～1.25，再轉(zhuǎn)移至已恒定質(zhì)量的250 mL蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，60 ℃真空干燥72 h，即得小承氣湯干膏粉，計(jì)算出膏率（出膏率＝/，為小承氣湯干膏粉的質(zhì)量，為全方飲片質(zhì)量）。

2.4 指紋圖譜的測(cè)定[17]

2.4.1 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液1的制備方法。

2.4.2 色譜條件 同“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液1的色譜條件。

2.5 提取工藝研究

2.5.1 單因素考察

（1）加水量：稱取全方飲片置于圓底燒瓶中，分別加水6、8、10、12、14、20倍，加熱回流1 h，依法測(cè)定蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林含量及出膏率，平行操作3份，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值確定加水倍量的低水平和高水平。由表1可知，加6～14倍量水時(shí)，各指標(biāo)整體呈上升趨勢(shì)，超過(guò)14倍量水后趨于平穩(wěn)，故選加水量為6倍和14倍。

（2）提取時(shí)間：稱取全方飲片置于圓底燒瓶中，加水8倍，分別回流提取30、60、90、120、150 min，依法測(cè)定蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林含量及出膏率，平行操作3份，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值確定提取時(shí)間的低水平和高水平。由表2可知，提取時(shí)間為30～120 min時(shí)，除90 min的蘆薈大黃素和大黃酚含量低于60 min外，其他指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)，超過(guò)120 min后，蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚的含量下降，辛弗林含量增加，出膏率無(wú)明顯變化，故選提取時(shí)間為30 min和120 min。

表1 加水量對(duì)指標(biāo)成分含量和出膏率的影響

Table 1 Effects of water addition on index component content and paste-forming rate

加水量/倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/% 蘆薈大黃素和大黃酚厚樸酚辛弗林 60.110.090.3414.55 80.160.120.3616.18 100.200.150.4417.66 120.200.190.4818.41 140.250.200.4818.37 200.250.250.5118.64

表2 提取時(shí)間對(duì)指標(biāo)成分含量和出膏率的影響

Table 2 Effects of extraction time on index component content and paste-forming rate

提取時(shí)間/min質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/% 蘆薈大黃素和大黃酚厚樸酚辛弗林 300.160.090.2814.82 600.160.120.3616.18 900.150.130.4417.19 1200.190.160.4920.17 1500.180.140.5920.18

2.5.2 基準(zhǔn)樣品的制備 小承氣湯出自東漢張仲景所著的《傷寒論》，原文記載制法為“上三味，以水四升，煮取一升二合，去滓，分溫二服”[2]。綜合古籍和實(shí)際生產(chǎn)要求，確定全方的煎煮工藝為按處方量稱取3味飲片于陶瓷鍋中，加800 mL去離子水，武火（1600 W）煮沸轉(zhuǎn)文火，文火（600 W）煎煮約47 min至240 mL，用1層300目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，調(diào)整濾液體積至240 mL，得水煎液。

分別取5 mL水煎液于25 mL西林瓶中，放入?20 ℃冰箱中預(yù)冷凍12 h后，置于?80 ℃預(yù)冷2 h的冷凍干燥機(jī)，凍干溫度為?80 ℃，真空度為（5±1）Pa，干燥72 h，即得小承氣湯基準(zhǔn)樣品[17]。

2.5.3 Box-Behnken試驗(yàn)

（1）關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPPs）的確定：小承氣湯主治陽(yáng)明邪熱與腸中糟粕互結(jié)但燥結(jié)不甚之證，方中與此主治病癥相關(guān)的藥效成分為蘆薈大黃素、大黃酚、厚樸酚和辛弗林[18]，同時(shí)這4個(gè)成分分別歸屬不同藥材，可以全面控制小承氣湯基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量，故以4個(gè)指標(biāo)性成分含量（1為蘆薈大黃素和大黃酚含量，2為厚樸酚含量，3為辛弗林含量）、出膏率（4）和指紋圖譜相似度（5）作為小承氣湯制備工藝的CQAs[19-22]。基于經(jīng)驗(yàn)和已發(fā)表文獻(xiàn)，選擇提取時(shí)間（1）、加水倍量（2）、提取次數(shù)（3）作為小承氣湯提取工藝的CPPs[23-25]。

（2）Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)：稱取與基準(zhǔn)樣品相同處方量的同一批飲片，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定提取時(shí)間（1）和加水倍量（2）的范圍，依據(jù)經(jīng)驗(yàn)將提取次數(shù)（3）設(shè)計(jì)為1、2、3次，因素水平見表3。采用Design Expert 10.0軟件，進(jìn)行3因素3水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的設(shè)計(jì)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)。

（3）試驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面分析：Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及小承氣湯樣品檢測(cè)結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果見表4。2次多項(xiàng)式模型優(yōu)于交互2項(xiàng)式和1項(xiàng)式模型，且總模型顯著（＜0.001），失擬值不顯著，表明所建模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型函數(shù)化。多元線性回歸方程為＝?106.58－47.641－66.132－120.693－16.0012－22.9113－25.7323＋24.9312＋5.1422＋5.1132，模型adj2為0.980 8，表明方程的擬合度較好，pred2為0.893 5，表明模型的預(yù)測(cè)性能良好，因此，可用此模型來(lái)預(yù)測(cè)各指標(biāo)的實(shí)際情況。

2.6 基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度的原理方法

2.6.1 確定評(píng)價(jià)對(duì)象 基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度是評(píng)價(jià)某樣品與基準(zhǔn)樣品相似度的關(guān)鍵參數(shù)，本方法的基本路線如圖1所示。應(yīng)首先確定樣品評(píng)價(jià)的指標(biāo)數(shù)目和樣品數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)將Box-Behnken設(shè)計(jì)的17個(gè)樣品和基準(zhǔn)樣品進(jìn)行對(duì)比，以蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林的含量和出膏率以及指紋圖譜相似度5個(gè)指標(biāo)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以X、S為評(píng)價(jià)對(duì)象，X表示Box-Behnken設(shè)計(jì)的第（＝1，2，…，）個(gè)樣本的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的測(cè)量值，S表示基準(zhǔn)樣品的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的測(cè)量值。

2.6.2 計(jì)算相對(duì)偏差（relative deviation，RD）值 RD表示第（＝1，2，…，）個(gè)樣本的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的相對(duì)偏差，能夠更科學(xué)全面地分析不同樣品與基準(zhǔn)樣品之間的相似度。RD值越小，代表X相對(duì)于S的偏差越小，即該樣品與基準(zhǔn)樣品相似度越高。利用公式（1）計(jì)算X相對(duì)于S的RD值，計(jì)算結(jié)果見表5。結(jié)果表明，當(dāng)以蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林含量以及指紋圖譜相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，與基準(zhǔn)樣品質(zhì)量最為接近的試驗(yàn)號(hào)是5，以出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，與基準(zhǔn)樣品質(zhì)量接近的試驗(yàn)號(hào)為14。

RD＝|X－S|/S（1）

2.6.3 計(jì)算基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度（standard relation，SR） 以基準(zhǔn)樣品質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)值（），以Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)下的各樣品質(zhì)量為測(cè)得值（），以不同的指標(biāo)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按公式（2）計(jì)算所得結(jié)果，稱為基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見表6。SR表示第（＝1，2，…，）個(gè)樣本的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度。SR越接近100%，在該指標(biāo)下的工藝參數(shù)制得的樣品與基準(zhǔn)樣品相似度越高。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

Table 3 Box-Behnken experimental design and response value

試驗(yàn)編號(hào)X1/minX2/倍X3/次質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/%指紋圖譜相似度綜合評(píng)分 Y1Y2Y3 175 (0)14 (+1)1 (?1)0.220.240.7518.650.976?17.61 230 (?1)10 (0)3 (+1)0.360.340.6436.510.969?123.42 375102 (0)0.290.330.8729.260.976?92.36 4301420.300.280.6222.250.969?66.21 5756 (?1)10.130.080.3414.240.98680.78 6120 (+1)1420.370.491.0535.150.964?201.46 775630.300.390.8231.920.961?123.58 81201030.440.550.9939.180.946?256.57 9751020.340.320.8228.750.969?106.30 10751430.440.710.8636.120.979?324.90 11751020.330.330.7828.790.967?106.20 12120620.260.280.6829.270.969?54.79 13751020.350.320.8228.220.970?109.97 14301010.170.130.5114.190.96557.67 15751020.290.390.8626.730.964?118.05 161201010.210.180.5320.880.96816.18 1730620.200.190.5418.560.98216.45 基準(zhǔn)樣品 0.110.100.3411.131.000

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

Table 4 Variance analysis of Box-Behnken

誤差來(lái)源模型F值 二次多項(xiàng)式模型交互二項(xiàng)式模型一項(xiàng)式模型 總模型91.95***65.02***71.58*** X184.22***40.38***22.98*** X2162.27***77.80***44.28*** X3540.45***259.10***147.49*** X1X24.752.28 X1X39.744.67 X2X312.285.89 X1212.14 X220.52 X320.51 失擬值4.498.0112.77 Radj20.980 80.960 00.929 7

***P＜0.001

圖1 方法流程圖

SR＝1－RD＝1－|X－S|/S（2）

2.7 AHP-熵權(quán)法組合權(quán)重的計(jì)算

2.7.1 AHP主觀賦權(quán)

（1）構(gòu)建判斷矩陣：根據(jù)君臣佐使原則[26]，小承氣湯方中大黃為君藥，味苦寒，主瀉熱祛實(shí)，瀉火解毒，以蕩滌胃腸實(shí)熱；厚樸味苦辛溫，溫中行氣，除脹滿，為臣藥；枳實(shí)味苦微寒，破氣消積導(dǎo)滯，以消痞實(shí)，為佐使，3藥配合，共奏瀉熱通便，寬中行氣之效[13]。本研究參考《中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》要求[27]，根據(jù)小承氣湯的處方組成，首選君藥中的有效成分為含量測(cè)定指標(biāo)，兼顧與制備工藝、穩(wěn)定性的相關(guān)性，確定以大黃中的蘆薈大黃素和大黃酚（1）、厚樸的厚樸酚（2）、枳實(shí)的辛弗林（3）作為質(zhì)量控制指標(biāo)，同時(shí)輔以出膏率（4）和指紋圖譜相似度（5）。指紋圖譜可反映小分子成分輪廓和定性特質(zhì)，但與含量測(cè)定的指標(biāo)性成分相比，其所包含的質(zhì)量信息仍較少[28]，故將其重要程度視為與出膏率同等重要。故按蘆薈大黃素和大黃酚＞厚樸酚＞辛弗林＞出膏率≈指紋圖譜相似度的順序，再根據(jù)AHP理論判斷矩陣1～9標(biāo)度法，按同一層次內(nèi)個(gè)指標(biāo)的相對(duì)重要程度進(jìn)行打分（表7）。蘆薈大黃素和大黃酚為君藥的主要藥效成分，相對(duì)于厚樸中的厚樸酚較明顯重要，故標(biāo)為4，相對(duì)枳實(shí)中的辛弗林明顯重要，標(biāo)為5，相對(duì)于出膏率和指紋圖譜相似度明顯更為重要，標(biāo)為6，以此類推，根據(jù)公式（3）構(gòu)建判斷矩陣，數(shù)據(jù)見表8，用a表示因素相對(duì)于因素的比較結(jié)果。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)的RDi,j

Table 5 RDij of Box-Behnken test

試驗(yàn)號(hào)RDij試驗(yàn)號(hào)RDij試驗(yàn)號(hào)RDij Y1Y2Y3Y4Y5Y1Y2Y3Y4Y5Y1Y2Y3Y4Y5 11.001.401.210.680.0271.732.901.411.870.04132.182.201.411.540.03 22.272.400.882.280.0383.004.501.912.520.05140.550.300.500.270.04 31.642.301.561.630.0292.092.201.411.580.03151.642.901.531.400.04 41.731.800.821.000.03103.006.101.532.250.02160.910.800.560.880.03 50.180.200.000.280.01112.002.301.291.590.03170.820.900.590.670.02 62.363.902.092.160.04121.361.801.001.630.03

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)的SRij

Table6 SRij of Box-Behnken test

試驗(yàn)號(hào)SRij試驗(yàn)號(hào)SRij Y1Y2Y3Y4Y5Y1Y2Y3Y4Y5 10.00?40.00?20.5932.4397.6010?200.00?510.00?52.94?124.5397.90 2?127.27?140.0011.76?128.0396.9011?100.00?130.00?29.41?58.6796.70 3?63.64?130.00?55.88?62.8997.6012?36.36?80.000.00?62.9896.90 4?72.73?80.0017.650.0996.9013?118.18?120.00?41.18?53.5597.00 581.8280.00100.0072.0698.601445.4570.0050.0072.5196.50 6?136.36?290.00?108.82?115.8196.4015?63.64?190.00?52.94?40.1696.40 7?72.73?190.00?41.18?86.7996.10169.0920.0044.1212.4096.80 8?200.00?350.00?91.18?152.0294.601718.1810.0041.1833.2498.20 9?109.09?120.00?41.18?58.3196.90

(3)

表7 AHP構(gòu)建判斷矩陣的標(biāo)準(zhǔn)[16]

Table7 Criterion of constructing judgment matrix of AHP[16]

標(biāo)度含義 1表示2個(gè)因素相比，具有相同重要性 3表示2個(gè)因素相比，前者比后者稍重要 5表示2個(gè)因素相比，前者比后者明顯重要 7表示2個(gè)因素相比，前者比后者強(qiáng)烈重要 9表示2個(gè)因素相比，前者比后者極端重要 2、4、6、8表示上述相鄰判斷的中間值 倒數(shù)若因素e與因素f的重要性之比為aef，那 么因素f與因素e重要性之比為afe＝1/aef

（2）計(jì)算權(quán)重：首先對(duì)判斷矩陣進(jìn)行幾何平均（方根法），按公式（4）計(jì)算得到初始權(quán)重系數(shù)W′，a表示第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)因素對(duì)第1，2，…，個(gè)指標(biāo)因素的比較結(jié)果，然后按照公式（5）計(jì)算歸一化權(quán)重系數(shù)（主觀權(quán)重系數(shù)，WS），得到5個(gè)指標(biāo)的WS，結(jié)果見表9。

表8 指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣

Table 8 Decision matrix of paired comparison on indexes

評(píng)價(jià)指標(biāo)Y1Y2Y3Y4Y5 Y114566 Y21/41344 Y31/51/3122 Y41/61/41/211 Y51/61/41/211

W′＝(a1a2…a)1/n（4）

表9 組合權(quán)重系數(shù)

Table 9 Combination weight coefficient

評(píng)價(jià)指標(biāo)WjSWjOWj Y10.530.200.43 Y20.230.470.45 Y30.110.140.06 Y40.070.180.05 Y50.070.000.00

WS＝W′/W′ （5）

（3）一致性檢驗(yàn)：對(duì)矩陣進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。首先根據(jù)公式（6）計(jì)算最大特征根max，再根據(jù)公式（7）計(jì)算一致性指標(biāo)（consistency index，CI），得到CI為0.04，一致性比例（consistency ratio，CR）（CR＝CI/RI，RI為自由度指標(biāo)）為0.03，均小于0.1，表明該矩陣具有一致性[16]。

max＝(aW′/W′)/（6）

CI＝(max－)/(－1) （7）

2.7.2 信息熵客觀賦權(quán)

（1）建立Box-Behnken試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)矩陣：現(xiàn)有個(gè)樣本，個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，原始數(shù)據(jù)矩陣＝(X)×n，以蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林含量，出膏率及指紋圖譜相似度5個(gè)指標(biāo)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

（2）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為概率矩陣：根據(jù)公式（8）將原始數(shù)據(jù)矩陣轉(zhuǎn)化為概率矩陣，P表示在第個(gè)指標(biāo)下第個(gè)樣本的概率。

P＝X/X（8）

（3）計(jì)算各指標(biāo)的信息熵和權(quán)重系數(shù)：信息熵（H）越小，代表指標(biāo)下的數(shù)據(jù)離散程度較高，則其所提供的信息量就越大[16]。根據(jù)公式（9）計(jì)算出各指標(biāo)的H，依次為0.984 4、0.963 0、0.988 8、0.985 7、1.000 0，按照公式（10）計(jì)算各指標(biāo)客觀權(quán)重系數(shù)（WO）。

H＝?PlnP，＝1/ln（9）

WO＝(1－H)/(1－H) （10）

2.7.3 組合權(quán)重的確定 采用AHP得到WS，熵權(quán)法得到WO，根據(jù)公式（11）計(jì)算各指標(biāo)組合權(quán)重系數(shù)（W），結(jié)果見表9。

W＝WSWO/WSWO（11）

2.8 綜合評(píng)分

通過(guò)AHP-熵權(quán)法得到的綜合權(quán)重系數(shù)可知，蘆薈大黃素和大黃酚指標(biāo)占比43%，厚樸酚占比45%，辛弗林占比6%，出膏率占比5%，因此根據(jù)公式（12）計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表3。綜合評(píng)分為100時(shí)，所對(duì)應(yīng)工藝參數(shù)下制得的樣品與基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量最為一致。Box-Behnken模型預(yù)測(cè)的最佳工藝為加水6倍量，提取時(shí)間30 min，提取1次。

綜合評(píng)分＝SR,Y1×0.43＋SR,Y2×0.45＋SR,Y3×0.06＋SR,Y4×0.05 （12）

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化后的提取工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林含量，出膏率及指紋圖譜相似度，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表10。驗(yàn)證試驗(yàn)的綜合評(píng)分均值為95.37（理論預(yù)測(cè)值為98.41），在課題組前期研究建立的小承氣湯基準(zhǔn)樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)（蘆薈大黃素和大黃酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.11～0.20 mg/g，厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08～0.15 mg/g，辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.23～0.40 mg/g；出膏率9.25%～11.25%；指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度＞0.9）[17]，且綜合評(píng)分的RSD值為2.31%，表明本方法建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所確定的提取工藝條件重復(fù)性高。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

Table 10 Validation of experimental results

試驗(yàn)編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)Y4/%Y5綜合評(píng)分RSD/% Y1Y2Y3 10.120.100.3413.300.98594.122.31 20.110.100.3413.550.98997.91 30.120.100.3413.400.98694.07 基準(zhǔn)樣品0.110.100.3411.131.000

3 討論

在確定了處方、制法、用法等關(guān)鍵信息后，嚴(yán)格按照傳統(tǒng)工藝制得的基準(zhǔn)樣品質(zhì)量是衡量經(jīng)典名方小承氣湯中試產(chǎn)品及商業(yè)化規(guī)模產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。古籍記載小承氣湯以水為提取溶劑，最終根據(jù)藥液量來(lái)確定煎煮時(shí)間，與回流提取的實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)情況不符。因此本研究對(duì)加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行深入考察，以基準(zhǔn)樣品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為指標(biāo)來(lái)對(duì)提取工藝進(jìn)行整體評(píng)價(jià)，確定與傳統(tǒng)工藝基本一致的小承氣湯現(xiàn)代提取工藝參數(shù)。

本研究基于QbD理念，以現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范為參照，銜接古籍記載和現(xiàn)行規(guī)范，建立了以蘆薈大黃素和大黃酚、厚樸酚、辛弗林、出膏率和指紋圖譜相似度為主的質(zhì)量控制體系，確定以加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為關(guān)鍵工藝參數(shù)，采用單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素水平，進(jìn)一步應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化經(jīng)典名方小承氣湯提取工藝。AHP是人為確定各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，受主觀影響較大；熵權(quán)法根據(jù)數(shù)據(jù)的變化規(guī)律判斷評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要程度，但不能體現(xiàn)方劑各藥味君臣佐使的配伍關(guān)系。本研究結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法對(duì)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系進(jìn)行賦權(quán)，明確5個(gè)指標(biāo)在質(zhì)量控制體系中的權(quán)重系數(shù)，即可通過(guò)綜合評(píng)分及模型預(yù)測(cè)確定與基準(zhǔn)樣品質(zhì)量最為接近的提取工藝參數(shù)，所得數(shù)據(jù)更加科學(xué)全面。

基于QbD理念結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法優(yōu)化得到的小承氣湯提取工藝參數(shù)穩(wěn)健可靠，符合經(jīng)典名方“傳承精華、古為今用、古今銜接”的基本研究原則，實(shí)現(xiàn)了其由古方向現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵一步，為其它經(jīng)典名方的現(xiàn)代提取工藝研究提供了理論參考，同時(shí)也為目前工業(yè)生產(chǎn)中如何保證中間體或制劑與基準(zhǔn)樣品間的一致性提供了評(píng)價(jià)方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of extraction process for classical prescription Xiaochengqi Decoction based on Box-Behnken experimental design, standard relation and analytic hierarchy process combined with entropy method

ZHAO Yue-ying, WANG Chang-hai, ZHANG Ze-kang, ZHANG Qing, GUO Ming-xue, SUN Meng, XI Cheng, YANG Xue-ying, DONG Shuang, ZHANG Xin-yu, DU Shou-ying, LU Yang, BAI Jie

Beijing University of Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing 102488, China

The extraction process of the classical prescription Xiaochengqi Decoction (小承氣湯, XD) was optimized based on Box-Behnken experimental design, standard relation and analytic hierarchy process combined with entropy method.With the contents of aloe emodin and chrysophanol, magnolol, synephrine as well as the paste-forming rate and fingerprint similarity as critical quality attributes (CQAs). The amount of water, extraction time and frequency were used as the critical process parameters (CPPs). The single factor experiment design was used to determine the level of each factor, and the Box-Behnken experimental design was used to optimize the extraction process. Finally, the standard relation between each samples and standard decoction of various indexes of different extraction parameters was calculated, while AHP-entropy method was applied to determine the weight of each index for comprehensive score.The results of variance analysis showed that thevalue of the quadratic regression model was significant (< 0.01), and the lack-of-fit value was not significant, indicating that the model was statistically significant. The relationship between various factors and the response values could be functionalized by the established models. Through further optimization of design space, the optimal extraction process of XD was 6-fold volume of water, extracted once and extracted for 30 min. The average comprehensive evaluation of three parallel verification tests was 95.37, RSD value was 2.31%, and meet the quality requirements of standard decoction.The extraction process parameters of XD based on the quality by design (QbD), standard relation and analytic hierarchy process combined with entropy method was stable and reliable, which would provide guidance for the process development of other classical prescriptions.

quality by design; classical prescription; Xiaochengqi Decoction; Box-Behnken design-response surface method; standard relation; analytic hierarchy process-entropy weight method; aloe emodin; chrysophanol; magnolol; sinflin;fingerprint; critical quality attributes; critical process parameters

R283.6

A

0253 - 2670(2022)20 - 6472 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.019

2022-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82173989）

趙玥瑛（1998—），女，碩士研究生，從事中藥新劑型開發(fā)與研究。Tel: 18197341874 E-mail: ll2820064026@163.com

陸 洋，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新劑型新技術(shù)研究。Tel: (010)53912123 E-mail: landocean28@163.com

白 潔，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑與新技術(shù)研究。Tel: (010)84738657 E-mail: baijie22811@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]