開口箭均一多糖 TCP-C1-1的結(jié)構(gòu)分析及其生物活性

李文聰，李雪妍，柯銀鉛，祝梓旋，劉呈雄，郭志勇，劉朝霞，鄒 坤

(三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室，湖北 宜昌 443003)

開口箭，又名粗絲，其基源植物為百合科鈴蘭屬TupistrachinensisBaker.開口箭植物主要分布于我國四川、云南、浙江等地.開口箭是一種少數(shù)民族民間用藥[1]，主要治療于咽喉腫痛，白喉，胃痛等，并在《中藥大辭典》《全國中藥匯編》等藥學(xué)文獻(xiàn)中均有收錄.現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，開口箭具有細(xì)胞毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理活性[2-6].但是目前對開口箭多糖部位的研究尚不多見.

趙燁等[7]通過實驗表明開口箭粗多糖對金黃色葡萄球菌、大腸希維爾菌具有較好的抑制作用.解燕等[8]通過對開口箭水提物研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的免疫活性，并且在后續(xù)的實驗中，從DEAE-52陰離子樹脂分離得到的開口箭粗多糖可以顯著增強正常小鼠的細(xì)胞活力，并且能顯著抑制S180實體腫瘤細(xì)胞的生長.本課題前期對開口箭的粗多糖進(jìn)行免疫抗腫瘤活性的初步研究，其具有較好的藥理活性.但開口箭多糖的純化和結(jié)構(gòu)分析，及多糖與其活性關(guān)系，尚無深入研究，本研究從此入手，從開口箭根莖部分離提取純化得到多糖，并探究其生物學(xué)活性.

1 材料與儀器

1.1 材料

D-甘露糖(麥克林)、L-鼠李糖(麥克林)、D-無水葡萄糖(麥克林)、D-半乳糖(麥克林)、D-果糖(麥克里面)、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T1000、T2000、T6000、T10000、T20000(麥克林)、VC(國藥集團)、DEAE-52 陰離子樹脂(科密歐)、SephadexG-200 凝膠(科密歐)、硅膠薄層板(科密歐)、其他試劑均為分析純級別.

開口箭，采摘自湖北省宜昌市長陽土家族自治縣， 經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為TupistrachinensisBaker.

1.2 儀器

紫外分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、CBM-10A vp Plusl液相(島津)、Ulitimate 3000高效液相(Thermo)、外接示差顯示器(Shodex)、紅外光譜儀(AoelAB)、核磁共振儀(Bruker AVANCE 500 MHz)、酶標(biāo)儀(TECAN).

2 方法

2.1 開口箭的提取和分級醇沉

開口箭根部50 kg，洗凈切碎，在65 ℃以 95%乙醇浸提 3次脫脂后，在殘渣中加入蒸餾水，于微沸狀態(tài)下進(jìn)行提取，濃縮干燥蒸餾得開口箭粗多糖.稱量開口箭粗多糖樣品102.3 g，加入1 500 mL純水，超聲加熱溶解，再分別以30%、60%、80% 不同的乙醇濃度進(jìn)行分級醇沉，采用2 500 r·min-1離心機進(jìn)行離心15 min，收集離心管下層中的沉淀，干燥稱重，得到了多糖A、B、C，并將其命名為TCP-A、TCP-B、TCP-C，計算得率，其得率計算公式為m醇沉部位/m粗樣品×100%.

2.2 醇沉部位的總糖含量測定

總糖含量測定是基于賴長江生等[9]使用苯酚-濃硫酸顯色的方法，略有調(diào)整.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取0.102 7 g，于 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水定容至 100 mL.取 5 mL，再用蒸餾水定容至50 mL，配置成0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備液.

樣品溶液的配制：稱取開口箭粗多糖，TCP-A、TCP-B、TCP-C各100 mg，分別加蒸餾水定容至100 mL.取5 mL，再用蒸餾水定容至50 mL，配置成0.1 mg·mL-1樣品儲備液.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：移取上述葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 放置于 25 mL的具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，再分別加入1 mL的苯酚和5 mL的濃硫酸.充分振搖，將其置于80 ℃水浴鍋中水浴30 min，另取蒸餾水做空白對照，于485 nm下測定樣品的吸光，對照品葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，D(485)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以計算樣品中總糖量m總糖，按照公式m總糖/m樣品×100%計算樣品中的糖含量.

2.3 對粗多糖C脫蛋白前后蛋白含量的測定

稱取TCP-C 20 g以適量的純水溶解，加入 1∶1(V/V)的 Sevage 試劑即正丁醇∶氯仿=1∶4(V/V) ，攪拌，分液，重復(fù)6次.

蛋白含量測定是基于Bohle等[10]方法，在本實驗室具體試劑情況對其條件進(jìn)行調(diào)整.

考馬斯亮藍(lán)溶液配置：稱取考馬斯亮藍(lán) G250 10 mg放置燒杯中，加入5 mL 濃度為95%的乙醇，加入后攪拌，待到固體全部溶解，加入50 mL濃度為85%的磷酸，邊加入邊攪拌，待顏色變成均一的紅棕色，加入100 mL純水.

蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配置：稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，放入10 mL的容量瓶中，定容，配制成5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液.

樣品溶液配置：稱取未除蛋白粗TCP-C和已除蛋白的TCP-C 各50 mg，加入10 mL純水溶解，配置5 mg·mL-1的樣品待測液.

蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：移取上述蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 放置于25 mL的具塞試管中，加入0.15 moL·L-1NaCl溶液至5 mL，再加入5 mL上述考馬斯亮藍(lán)試劑，充分震搖，另取蒸餾水做空白對照，于595 nm下測定樣品的吸光值D(595)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

樣品中蛋白含量測定：移取上述的樣品溶液各吸取5 mL放置于25 mL的具塞試管中，再加入5 mL上述考馬斯亮藍(lán)試劑，充分震搖，另取蒸餾水做空白對照，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣品中蛋白質(zhì)量m蛋白.

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以計算樣品中蛋白m蛋白，按照公式m蛋白/m樣品×100%計算樣品中的蛋白含量.

2.4 DEAE-52 纖維素離子交換樹脂純化

將上述去蛋白后的TCP-C，加入已經(jīng)預(yù)處理的 DEAE-52 離子交換樹脂柱層析，流動相體系為純水，0.1 mol·L-1NaCl溶液、0.3 mol·L-1NaCl溶液、0.7 moL·L-1NaCl溶液.每10 mL收集1次，按2.2方法測量其吸光度.收集各個部分，將其命名為TCP-C1、TCP-C2、TCP-C3、TCP-C4.

2.5 葡聚糖凝膠Sephadex G200純化和純度驗證

將純水部位TCP-C使用Sephadex G200進(jìn)行純化分離，收集主峰得到 TCP-C1-1，后再采用葡聚糖凝膠Sephadex G-200 進(jìn)行純化和檢驗，每10 mL收集1次，具體檢測方法采用苯酚-濃硫酸法檢測，方法同2.2收集主峰.

2.6 TCP-C1-1多糖相對分子質(zhì)量測定

該部分實驗是基于王國佳等[11]使用葡聚糖凝膠測量多糖相對分子質(zhì)量的方法，并且根據(jù)本實驗對其條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整.

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置：分別稱取已知相對分子質(zhì)量1 000、2 000、6 000、10 000、20 000 的多糖標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，定容至5 mL.

樣品溶液配置：取得到的均一多糖 TCP-C1-1 15 mg，定容至 5 mL.

流動相：100% 純水35 min柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：15 μL.

樣品采用和標(biāo)準(zhǔn)同樣的色譜條件，具體為純水相.

2.7 TCP-C1-1多糖紅外光譜(IR)分析

稱取干燥的 TCP-C1-1 樣品5 mg，使用紅外光譜儀進(jìn)行測定.

2.8 TCP-C1-1多糖單糖構(gòu)成

該部分實驗是基于陳凌霄等[12]對于TLC薄層色譜確定多糖的單糖構(gòu)成方法的探索，并依據(jù)本實驗室實際情況進(jìn)行方法調(diào)整.

2.8.1 溶液配置 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置：分別稱取果糖90 mg，葡萄糖 90 mg，甘露糖 90 mg，半乳糖 90 mg，鼠李糖 90 mg，分別加入 2 mL純水，振蕩，加熱，使其完全溶解后備用.

顯色劑溶液配置：稱取2 g的苯胺，量取2 mL的二苯胺，量取100 mL丙酮溶液，將苯胺和二苯胺加入其中，振蕩溶解.

展開劑溶液配置：展開劑體系以正丁醇：異丙醇∶水∶醋酸=7∶5∶2∶1的體積比進(jìn)行配置，即量取正丁醇1.4 mL，異丙醇1.0 mL，水0.4 mL，醋酸0.2 mL進(jìn)行混合待用.

2.8.2 TCP-C1-1多糖水解 稱取TCP-C1-1 50 mg，加入2 mL的水進(jìn)行溶解，再加入4 mL 2 mol·mL-1的三氟乙酸溶液，密封后置于烘箱中于110 ℃水解4 h，取出后待其冷卻至室溫，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，后加入甲醇洗滌，繼續(xù)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其蒸干，反復(fù)多次，直至水解樣品無酸味.取出樣品，使用0.5 mL水溶解，待用.

2.8.3 TLC薄層色譜分析 將上述標(biāo)準(zhǔn)品和多糖水解液，進(jìn)行點板操作，使用吹風(fēng)機將殘存溶液吹干，將苯胺-二苯胺丙酮溶液使用噴霧器噴灑其中，將其置于烘箱中90 ℃，加熱1 h.

2.9 TCP-C1-1核磁共振分析

稱取凍干的TCP-C1-1 樣品40 mg，使用D2O進(jìn)行溶解，在其中加入兩滴氘代丙酮，使用核磁進(jìn)行測定.

2.10 TCP-C1-1生物活性研究

2.10.1 DPPH清除活性研究 DPPH溶液配置：稱取5 mg DPPH，加入到無水乙醇定容到100 mL，充分溶解，避光.

陽性對照VC梯度濃度的配置：準(zhǔn)確稱取100 mg VC定容至100 mL，分別配置成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的梯度水溶液.

樣品梯度濃度的配置：稱取樣品 TCP-C1-1 20 mg定容至10 mL，分別配置成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的梯度水溶液.

DPPH自由基清除率的的測定：取2 mL 樣品或VC水溶液于試管中，加入2 mL DPPH 溶液，空白組為2 mL 樣品+2 mL 無水乙醇，對照組為2 mL DPPH+2 mL ddH2O，混勻后避光反應(yīng) 2 h，517 nm 處測吸光值.

DPPH自由基清除率= [1-(D樣品-D空白)/D對照] × 100%.

2.10.2 TCP-C1-1對α-糖苷酶抑制活性 配置0.1 moL·L-1pH=6.8緩沖溶液：取0.790 g KH2PO4和1.792 1 g Na2HPO4·12H2O，溶于100 mL的純水中.

酶溶液配置：將母液100 U溶于1 mL上述配置的緩沖溶液中.

底物4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)溶液配置：稱取PNPG 15.6 mg使用上述配置的緩沖液，溶解于5 mL上述配置的緩沖溶液中.

阿卡波糖溶液配置：稱取6.5 mg的阿卡波糖，使用上述配置的緩沖溶液1 mL溶解.并且將母液兩倍稀釋 為6、3、1.5、0.75、0.375、0.187 56 mg·mL-1.

碳酸鈉溶液配置：稱取0.212 g的碳酸鈉，使用純水定容至10 mL，得到0.2 moL·L-1的碳酸鈉溶液、

TCP-C1-1樣品溶液配置：稱取TCP-C1-1樣品6.5 mg，用容量瓶定容到1 mL，配置成10 mg·mL-1的母液，并且將母液稀釋為0.20、0.41、0.81、1.63、3.25、6.50 mg·mL-1.

操作方法：使用移液槍量取40 μL上述配置的酶溶液加入到96孔板上，再加入不同濃度的抑制液80 μL，并且37 ℃水浴鍋中加熱10 min，取出后加入40 μL的底物，并再置于37 ℃水浴鍋30 min，使用微孔震蕩板500 r·min-1震蕩2 min取出后加入100 μL的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在405 nm下測量吸光度.

背景組：上述同樣的操作，不加酶溶液，不加入樣品，加入120 μL緩沖液.

近年來，威海市食品藥品監(jiān)管局堅決貫徹“四個最嚴(yán)”和“四有兩責(zé)”要求，深入實施食品安全戰(zhàn)略，通過“全域覆蓋、全程監(jiān)管、全民共建”的創(chuàng)建模式，全力推進(jìn)國家食品安全城市和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全市“雙城聯(lián)創(chuàng)”。

空白組：上述同樣的操作，加入酶溶液，不加入樣品，加入80 μL緩沖液.

抑制率=[D空白-(D樣品-D背景)]/D空白×100%.

2.10.3 TCP-C1-1對小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的抗炎活性的影響

1) 小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的增殖實驗.將指數(shù)生長期的小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 以 1×105個/孔的密度接種在 96 孔板中.加入不同 質(zhì)量濃度(0.1857、0.375、0.75、1.5、3 μg·mL-1)TCP-C1-1，每個樣品質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行組，通過酶標(biāo)儀492 nm的波長下測量每一組的D(492)值，以細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞作為對照組，按照公式計算細(xì)胞活力.

細(xì)胞活力=D實驗/D對照.

2) TCP-C1-1 對RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響.Grisse 法檢測 NO 的水平將小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW 264.7(2.5×105個/孔)接種到 24 孔板中，用脂多糖(LPS)1 μg·mL-1處理 2 h 后，加入不同質(zhì)量濃度的TCP-C1-1.24 h 后，收集培養(yǎng)上清液.每個樣品質(zhì)量濃度(0.375、0.75、1.5 μg·mL-1)設(shè)置 3 個平行組，同時以細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞作為對照組.根據(jù)試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測量每組的D(492)值.根據(jù)D(492)值，測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的水平.

3) 統(tǒng)計學(xué)分析.SPSS 19.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，單因素方差分析用于比較多組間差異，Dunnett-t檢驗用于兩組間均數(shù)差異的比較：p<0.05則差異具有統(tǒng)計意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 分級醇沉

多糖A、B、C的質(zhì)量及其得率見表1.

表1 分級醇沉各個部分糖質(zhì)量Tab.1 Mass of each part of graded alcohol precipitation

3.2 不同醇沉部位的總糖含量

圖1 總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 standard curve of total sugar content

表2 各個部分多糖含量

3.3 對粗多糖C脫蛋白前后蛋白含量的測定

蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，線性回歸方程y=0.6222x-0.3819，R2=0.9964.計算出未除蛋白的TCP-C的蛋白含量為16.2%，已除蛋白的TCP-C的蛋白含量為1.9%，表明該部分蛋白已經(jīng)去除的較為完全.

圖2 蛋白含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of protein content determination

3.4 DEAE離子交換樹脂的洗脫曲線

DEAE離子交換樹脂洗脫曲線與洗脫組分如圖3與表3所示，其中純水部分(0～20瓶)出峰形較為對稱，收集該部分，并將其命名為TCP-C1.

3.5 均一多糖的純度驗證

通過葡聚糖凝膠純化Sephadex G-200 對TCP-C1多糖進(jìn)行分離，得到均一多糖TCP-C1-1，并對其純度進(jìn)行驗證(圖4)，采用葡聚糖凝膠驗證，通過洗脫曲線可以判斷，其峰形較為對稱.可以判斷TCP-C1-1是均一多糖.

圖3 多糖C的DEAE洗脫曲線Fig.3 DEAE elution curve of TCP-C

表3 DEAE洗脫各部組分

3.6 TCP-C1-1的相對分子質(zhì)量測定

如圖5所示，不同相對分子質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=-8275.5x+167926，R2=0.9902.TCP-C1-1其高效凝膠色譜液相圖如圖6所示，從液相圖的出峰也可以判斷TCP-C1-1是均一多糖，TCP-C1-1出峰時間在18.5 min.通過計算可以得出，該均一多糖相對分子質(zhì)量為1.52×104.

圖4 TCP-C1-1均一多糖Sephaedx G-200驗證洗脫曲線Fig.4 TCP-C1-1 validation elution curve of Sephaedx G-200 homogeneous polysaccharide

圖5 多糖相對分子質(zhì)量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of polysaccharide molecular weight determination

圖6 TCP-C1-1出峰時間Fig.6 TCP-C1-1 departure time

3.7 紅外光譜測定

TCP-C1-1紅外光譜如圖7所示，3 286 cm-1為羥基的伸縮震動，此為多糖的特征吸收峰，2 941 cm-1為糖上幾個中弱峰的C-H震動，1 022 cm-1為 C-O 伸縮振動峰；923 cm-1弱峰為端基碳 C-H 彎曲振動峰；903 cm-1處有吸收說明該糖組分中含有 β-糖苷鍵.

3.8 均一多糖TCP-C1-1 的單糖構(gòu)成

果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和水解后的TCP-C1-1如圖8所示，通過圖8可以判斷，水解后的TCP-C1-1和果糖的位置極為相近，所以可以判斷，該TCP-C1-1可能是由果糖組成的一種果聚糖.

圖7 TCP-C1-1紅外吸收Fig.7 TCP-C1-1 infrared absorption

圖8 標(biāo)準(zhǔn)品和TCP-C1-1酸解單糖對比Fig.8 Comparison between standard and TCP-C1-1 acidolysis monosaccharide

3.9 TCP-C1-1核磁共振分析結(jié)果

通過微譜數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)TCP-C1-1中碳譜的化學(xué)位移值與Li等[13]實驗過程中發(fā)現(xiàn)的果聚糖碳譜的化學(xué)位移值高度重合，其結(jié)果如表4所示，其文獻(xiàn)中報道的結(jié)構(gòu)如圖9所示.

表4 TCP-C1-1碳譜數(shù)據(jù)和β-(2→1)果聚糖碳譜數(shù)據(jù)Tab.4 13C NMR results of TCP-C1-1 and β-(2→1) fructan

圖9 文獻(xiàn)中所報道β-(2→1)果聚糖結(jié)構(gòu)圖Fig.9 β-(2→1) fructan structure diagram reported in the literature

果聚糖是由一分子由果糖和葡萄糖的二糖蔗糖和一個或者多個果糖形成的.Li等[13]在文獻(xiàn)中介紹了葡萄糖殘基鑒定方法，其主要采用核磁共振氫譜來進(jìn)行判斷，首先氫譜上δ=5.31位置的葡萄糖殘基上的1號氫和果糖殘基上的4號氫進(jìn)行積分相對比，從而確定葡萄糖殘基存在.

TCP-C1-1的核磁共振氫譜如圖10所示，在對δ=5.31 和葡萄糖殘基上的1號氫和δ=4.12、δ=4.14果糖殘基上的4號氫進(jìn)行積分，結(jié)果確定其存在約為83倍關(guān)系，本實驗使用葡聚糖凝膠測定TCP-C1-1相對分子質(zhì)量為15 200，以83倍的關(guān)系可以推算其相對分子質(zhì)量為15 120，這符合于TCP-C1-1的相對分子質(zhì)量測定，所以可以證明TCP-C1-1中含有一分子葡萄糖殘基.

圖10 TCP-C1-1核磁共振氫譜Fig.10 TCP-C1-1 nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum

綜上所述，可以確定TCP-C1-1是由果糖組成的果聚糖，且存在β糖苷鍵，其相對分子質(zhì)量為15 200，連接方式為(2→1)連接，其結(jié)構(gòu)如圖11所示，是一類菊粉果聚糖.

圖11 TCP-C1-1結(jié)構(gòu)Fig.11 TCP-C1-1 structure

3.10 TCP-C1-1生物活性研究

3.10.1 DPPH清除活性研究 TCP-C1-1多糖樣品DPPH自由基清除活性如圖12所示，TCP-C1-1多糖具有一定的 DPPH 自由基清除活性，在一定濃度范圍，隨著多糖濃度升高，活性增強.在濃度為2 mg·mL-1時，其清除率可以達(dá)到可以達(dá)到63.3%.

圖12 VC和TCP-C1-1對DPPH自由基的清除活性Fig.12 DPPH free radical scavenging by VC and TCP-C1-1

3.10.2 TCP-C1-1對α-糖苷酶的抑制活性 TCP-C1-1對α-糖苷酶抑制活性如圖13所示，通過 TCP-C1-1和阿卡波糖的對比，在保持濃度相近的情況下，TCP-C1-1其對糖苷酶的抑制活性表現(xiàn)優(yōu)越，遠(yuǎn)高于陽性對照藥阿卡波糖，并且在濃度為6.50 mg·mL-1時，其抑制活性可以達(dá)到74.4%.

3.10.3 TCP-C1-1細(xì)胞抗炎活性 由圖14可知，TCP-C1-1對小鼠的巨噬細(xì)胞RAW 264.7作用24 h后，于對照比相比，TCP-C1-1其在0.187 5、0.375、0.75、1.5、3、6 μg·mL-1下，都能顯著促進(jìn)其細(xì)胞的增長.在低濃度時，其促進(jìn)細(xì)胞增殖活動于濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，于對照組相比較，具有顯著的差異，其中在1.5 μg·mL-1促進(jìn)細(xì)胞增長最明顯.

圖13 阿卡波糖和TCP-C1-1 對α-糖苷酶抑制活性Fig.13 α-GLycosidase inhibitory activity of acarbose and TCP-C1-1

如圖15所示，于LPS對照組相比，TCP-C1-1的濃度達(dá)到1.5 μg·mL-1的情況下時，其可以顯著抑制細(xì)胞產(chǎn)生NO.并且明顯低于對照組.證明TCP-C1-1可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)出的炎癥損傷，且成一定劑量依賴的關(guān)系.

圖15 TCP-C1-1 對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞釋放NO的影響Fig.15 Effect of TCP-C1-1 on the release of NO from RAW264.7 cell

4 結(jié)果

本實驗從開口箭根部分離提取得到均一多糖，其相對分子質(zhì)量為1.52×104，TCP-C1-1是由果糖均一多糖構(gòu)成的，其為β-(2→1)連接.通過后續(xù)對其生物活性進(jìn)行實驗，其在清除自由基能力抗α-糖苷酶活性方面都表現(xiàn)出較好的活性.在細(xì)胞抗炎活性實驗方面，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥時，機體中促炎癥因子在內(nèi)毒素的作用產(chǎn)生的產(chǎn)物NO，TCP-C1-1可抑制LPS誘導(dǎo)出RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子NO的產(chǎn)生，并且在其濃度為1.5 μg·mL-1時其明顯的抑制了NO的產(chǎn)生，證明TCP-C1-1是一種具有較好抗炎活性的均一多糖.

對于TCP-C1-1結(jié)構(gòu)和其生物活性的探討，對于深入研究開口箭活性物質(zhì)具有較為重要的意義.對中藥均一多糖結(jié)構(gòu)的研究，可為以多糖為主要成分的中藥質(zhì)量控制水平的提升奠定基礎(chǔ).