循環(huán)軸向壓縮應(yīng)力增強基質(zhì)依賴型組織工程骨骨再生能力的研究*

梁萬元 胡文輝 丁海濱 李建美 董世武

目前，缺乏理想的成骨微環(huán)境和高成骨活性的骨修復(fù)材料是制約大段骨缺損治療的瓶頸問題[1]。為解決該難點問題，本課題組前期建立了一種新的組織工程骨策略——基質(zhì)依賴型組織工程骨（matrix-based tissue engineering bone，M-TEB），該方法是采用凍干的方式去除生長在骨支架材料上的種子細胞的活性，但保留種子細胞來源的基質(zhì)成分的方式，構(gòu)建得到功能化的組織工程骨材料[2]。

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是M-TEB中最常用的種子細胞，其在向成骨分化的過程中會伴隨著骨保護素、骨形成蛋白2、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等的變化，這些蛋白在骨重建過程中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。同時，BMSCs已經(jīng)被證實為一種機械敏感性細胞，調(diào)控其所處的力學(xué)微環(huán)境可以指導(dǎo)其定向譜系分化[5-8]。因此，構(gòu)建適宜BMSCs 成骨分化所需的應(yīng)力環(huán)境來促進其成骨分化，進而調(diào)控其基質(zhì)蛋白的表達和分泌，最終改變M-TEB的骨再生能力是一種可行的途徑。結(jié)合現(xiàn)有研究，本文選取幅度10 kPa、頻率1 Hz的循環(huán)軸向壓縮應(yīng)力（cyclic axial compression stress，CACS）來模擬適宜BMSCs成骨分化的應(yīng)力微環(huán)境，并設(shè)計了一種在CACS條件下制備M-TEB的方法，通過構(gòu)建大鼠股骨缺損模型以評價在CACS 條件下制備的新型M-TEB 在骨再生方面的優(yōu)勢，再利用轉(zhuǎn)錄組測序和條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)實驗研究促成這一變化的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用到的C57BL/6小鼠（4 ～6周，30只）和SD大鼠（200 ～250 g，12只）均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供，實驗過程中對動物的處置得到陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會的批準[SCXK（渝）20170002]。

1.2 主要儀器與試劑

細胞培養(yǎng)箱（Series ⅡWater Jacket，美國Thermo 公司）；三維組織培養(yǎng)測試系統(tǒng)（ElectroForce 7000，美國TA儀器公司）；掃描電鏡（Crossbeam 340，德國蔡司公司）；Micro-CT（SkyScan1276，美國Bruker 公司）；骨支架材料（主要成分為羥基磷灰石和Ⅰ型膠原蛋白，型號：Re-2，奧精醫(yī)療科技股份有限公司）；EGM-2MV培養(yǎng)基（美國Lonza公司）；Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒（美國Thermo公司）；VEGFA Elisa試劑盒、CCK-8試劑盒、茜素紅染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ALP 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；貝伐單抗（美國MCE公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 循環(huán)軸向壓縮應(yīng)力條件下M-TEB的構(gòu)建與表征

（1）構(gòu)建方法。課題組前期構(gòu)建M-TEB是在靜態(tài)條件下進行的，具體流程如圖1C 上半部分所示，即將從C57BL/6小鼠骨髓腔內(nèi)分離得到的BMSCs作為種子細胞[9]，種植到骨支架材料（尺寸：3 mm×3 mm×3 mm）上，在靜態(tài)條件下進行14 d共培養(yǎng)，再經(jīng)過凍干處理后獲得[10]。本文為了研究循環(huán)軸向壓縮應(yīng)力對M-TEB 骨再生能力的影響，將上述方法中14 d的靜態(tài)培養(yǎng)過程改為14 d的動態(tài)培養(yǎng)，其他條件和操作保持不變。具體操作方法如下：每天將細胞支架復(fù)合體放入三維組織培養(yǎng)測試系統(tǒng)的組織培養(yǎng)倉內(nèi)（見圖1A），連續(xù)加載4 h、幅度10 kPa、頻率1 Hz的CACS 刺激，其余時間放回細胞培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。將靜態(tài)條件下和動態(tài)條件下構(gòu)建的M-TEB分別記為靜態(tài)M-TEB和動態(tài)M-TEB。

圖1 三維組織培養(yǎng)測試系統(tǒng)及M-TEB構(gòu)建流程圖：A.三維組織培養(yǎng)測試系統(tǒng)（紅色橢圓標示區(qū)域為組織培養(yǎng)倉）；B.循環(huán)軸向壓縮應(yīng)力波形圖；C.M-TEB的具體構(gòu)建流程圖

（2）M-TEB 表征。①DNA 殘留量：用Quant-iT Pico‐Green dsDNA 試劑盒定量檢測各組M-TEB 脫細胞前后的DNA濃度，以評價凍干法滅活細胞的效果；②基質(zhì)沉積：用金靶濺射鍍膜后，在掃描電鏡下觀察并記錄材料表面的顯微圖片；③VEGFA蛋白濃度：根據(jù)VEGFA ELISA檢測試劑盒說明對靜態(tài)M-TEB和動態(tài)M-TEB中VEGFA濃度進行定量。

1.3.2 大鼠股骨缺損模型的構(gòu)建與修復(fù)

（1）模型的構(gòu)建與修復(fù)：在大鼠的股骨中上段鉆出直徑5 mm、深至髓腔的圓柱狀骨缺損，隨機分為3組，每組4 只進行干預(yù)。分別為：假手術(shù)組，在骨缺損處不植入任何材料；靜態(tài)M-TEB 組，在骨缺損處植入靜態(tài)M-TEB 材料（3 mm×3 mm×3 mm）；動態(tài)M-TEB 組，在骨缺損處植入動態(tài)M-TEB材料（3 mm×3 mm×3 mm）。

（2）觀察指標：術(shù)后8 周，進行Micro-CT掃描，觀察缺損修復(fù)情況并計算骨密度（g/cm3）、骨體積百分比（%）；并進行組織學(xué)檢查（Masson 染色），觀察骨缺損處新骨生成情況。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-sequencing，RNA-Seq）

為研究CACS刺激對BMSCs生長、分化的影響，提取未經(jīng)過脫細胞程序處理的靜態(tài)M-TEB 和動態(tài)M-TEB 構(gòu)建體中BMSCs 的RNA 進行RNA-Seq 分析[11]，篩選出差異基因，并基于基因本體論（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫進行富集分析[12]。

1.3.4 條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)實驗

（1）條件培養(yǎng)基制備與分組：本部分實驗共設(shè)置4 個組。利用靜態(tài)M-TEB 和動態(tài)M-TEB 樣品制備條件培養(yǎng)基[10]，分別記為靜態(tài)條件培養(yǎng)基組（即靜態(tài)CM 組）和動態(tài)條件培養(yǎng)基組（即動態(tài)CM 組）。同時為了驗證VEGFA是否在條件培養(yǎng)基中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從上述兩組條件培養(yǎng)基各取出一半并加入50 μg/mL 貝伐單抗（VEGFA 阻斷劑），分別記為靜態(tài)CM+Anti 組和動態(tài)CM+Anti 組。以下實驗中，每組條件培養(yǎng)基均設(shè)置3個重復(fù)。

（2）內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）遷移和增殖實驗。①遷移實驗：將EPCs用EGM-2MV培養(yǎng)基重懸后接種到24孔Transwell小室上腔內(nèi)，并在下腔加入條件培養(yǎng)基。24 h 后，利用DAPI 熒光染色檢測遷移到Transwell小室濾膜下側(cè)的細胞數(shù)。②增殖實驗：分別用各組條件培養(yǎng)基對EPCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并在第1、3、7 d利用CCK-8法檢測各組EPCs的增殖情況。

（3）BMSCs成骨誘導(dǎo)實驗：分別用各組條件培養(yǎng)基對BMSCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并在第7 d檢測堿性磷酸酶（ALP）活性和第21 d觀察鈣質(zhì)沉積（茜素紅染色法）水平，以評價BMSCs的成骨分化情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。兩組差異比較采用t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 “凍干法”滅活細胞效果

DNA中攜帶大量的遺傳信息，是造成組織工程移植物出現(xiàn)排斥反應(yīng)的主要物質(zhì)[13]。如圖2所示，經(jīng)過“凍干法”處理后，靜態(tài)M-TEB和動態(tài)M-TEB中DNA的濃度相對于脫細胞前均顯著降低（P均＜0.001），說明本實驗中采用的“凍干法”能較好地降解細胞中的DNA，達到了滅活細胞的目的，降低了后續(xù)體內(nèi)移植免疫排斥的風險。

圖2 各組M-TEB凍干前后DNA濃度定量結(jié)果

2.2 M-TEB電鏡掃描結(jié)果

電鏡掃描結(jié)果顯示，動態(tài)M-TEB相比骨支架材料和靜態(tài)M-TEB在材料表面明顯覆蓋有更為豐富膜片狀細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)（見圖3），提示CACS刺激能夠促進BMSCs在M-TEB 表面分泌和沉積更多的細胞外基質(zhì)。

圖3 M-TEB材料表面電鏡掃描結(jié)果：A.骨支架材料（×500）；B.靜態(tài)M-TEB（×500）；C.動態(tài)M-TEB（×500）

2.3 Micro-CT掃描結(jié)果

如圖4所示，術(shù)后8周，假手術(shù)組新骨生成較少，骨缺損恢復(fù)情況較差；靜態(tài)M-TEB組可見較多的新骨生成，但仍有小部分區(qū)域未被修復(fù)；動態(tài)M-TEB組則基本看不見明顯的骨缺損，骨結(jié)構(gòu)比較完整。分析骨體積分數(shù)和骨密度，動態(tài)MTEB組也明顯優(yōu)于假手術(shù)組和靜態(tài)M-TEB組（骨體積分數(shù)分別為P＜0.001，P＜0.01；骨密度分別為P＜0.001，P＜0.01）。

圖4 股骨缺損處3D重建圖像及參數(shù)分析：A-C.分別為假手術(shù)組、靜態(tài)M-TEB組和動態(tài)M-TEB組3D重建圖像，紅色虛線區(qū)為原始骨缺損范圍；D.三組的骨體積分數(shù)；E.三組的骨密度

2.4 組織學(xué)檢查結(jié)果

Masson染色結(jié)果顯示（見圖5），假手術(shù)組骨缺損處多為纖維狀組織，幾乎沒有新骨生成；靜態(tài)M-TEB 組有一定量的新骨生成，但大部分仍為纖維狀組織；動態(tài)M-TEB組中新生骨數(shù)量最多，僅有小部分的纖維狀組織。實驗結(jié)果證明，動態(tài)M-TEB 相比靜態(tài)M-TEB 具有更強的新骨生成能力。

圖5 骨缺損處組織切片Masson染色結(jié)果（×100）：A.假手術(shù)組；B.靜態(tài)M-TEB組；C.動態(tài)M-TEB組

2.5 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行分析，選擇P＜0.01 且|log2(FoldChange)|≥1 作為差異基因篩選閾值，如圖6A 所示，動態(tài)M-TEB中BMSCs相較靜態(tài)M-TEB有163個差異基因，其中123 個基因上調(diào)，40 個基因下調(diào)。聚類熱圖（見圖6B）展示了排名前50 的差異基因在各個樣本中的分布情況，結(jié)果顯示差異基因的表達取決于BMSCs 是否受到CACS刺激。將差異基因進行GO富集分析，共富集出175個差異（q＜0.01）GO 術(shù)語，觀察前30 個差異GO 術(shù)語（見圖6C）發(fā)現(xiàn)主要涉及MAPK 通路、細胞凋亡、血管生成等。統(tǒng)計各差異基因在前30 個差異GO 術(shù)語（見圖6C）中出現(xiàn)的頻次，發(fā)現(xiàn)VEGFA 出現(xiàn)28 次，位于所有差異基因中第1位，出現(xiàn)頻次前10的差異基因分別為VEGFA（28次）、HMOX1（15次）、HSPH1（13次）、GDNF（12次）、HBEGF（11 次）、EPHA4（11 次）、SERPINE1（9 次）、FBXW7（9次）、GADD45B（8次）、MDM2（8次）。

圖6 轉(zhuǎn)錄組差異基因分析結(jié)果：A.差異基因火山圖，紅色點代表上調(diào)基因，綠色點代表下調(diào)基因，藍色點代表沒有顯著改變的基因；B.前50個差異基因聚類熱圖，紅色代表上調(diào)基因，藍色代表下調(diào)基因；C.前30個具有顯著性差異的GO術(shù)語

2.6 VEGFA的基因和蛋白表達水平

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，動態(tài)M-TEB中BMSCs的VEGFA基因表達量水平顯著高于靜態(tài)M-TEB中BMSCs（P＜0.01）；與之對應(yīng)的Elisa檢測結(jié)果顯示，動態(tài)M-TEB中VEGFA蛋白濃度也顯著高于靜態(tài)M-TEB（P＜0.01）（見圖7）。

圖7 VEGFA 的基因和蛋白表達水平：A.未經(jīng)脫細胞的各組MTEB 中BMSCs 的VEGFA 基因表達水平（來源于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果）；B.兩組M-TEB中VEGFA蛋白濃度

2.7 條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)EPCs遷移和增殖

DAPI 熒光染色結(jié)果顯示（見圖8），動態(tài)CM 組誘導(dǎo)EPCs的遷移數(shù)相較靜態(tài)CM組顯著增加（P＜0.05）。在誘導(dǎo)EPCs增殖的實驗中，除了第1 d各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外（P均＞0.05），在第4、7 d，動態(tài)CM組生長速率顯著高于靜態(tài)CM組（P均＜0.001）。靜態(tài)CM+Anti組和動態(tài)CM+Anti 組兩組培養(yǎng)基誘導(dǎo)EPCs 遷移的能力相較靜態(tài)CM 組顯著降低（P均＜0.05），但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)EPCs增殖的能力呈現(xiàn)出上述相同的趨勢。實驗結(jié)果表明，動態(tài)CM 組誘導(dǎo)的EPCs 相比靜態(tài)CM 組具有更強的遷移和增殖能力，主要原因在于前者VEGFA濃度更高。

2.8 條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化

如圖9所示，動態(tài)CM組ALP染色陽性面積顯著高于靜態(tài)CM 組（P＜0.05），茜素紅染色結(jié)果呈相同趨勢。而加入VEGFA抑制劑的兩組，ALP染色陽性面積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且顯著低于靜態(tài)CM組（P均＜0.05），茜素紅染色結(jié)果呈現(xiàn)出一致的結(jié)果。實驗結(jié)果表明，動態(tài)M-TEB組相比靜態(tài)M-TEB組具有相對更高濃度的VEGFA，因而表現(xiàn)出更強的促進BMSCs成骨分化的能力。

圖9 條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)BMSC成骨分化結(jié)果：A-D.分別為靜態(tài)CM組、動態(tài)CM組、靜態(tài)CM+Anti組和動態(tài)CM+Anti組條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化7 d后的ALP染色結(jié)果；E-H.分別為上述4組條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化21 d后的茜素紅染色結(jié)果；I.ALP染色陽性區(qū)域百分比統(tǒng)計結(jié)果；J.茜素紅染色陽性區(qū)域百分比統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

本文主要研究循環(huán)軸向壓縮應(yīng)力對M-TEB骨再生能力的影響。構(gòu)建M-TEB 所使用的骨支架材料具有較強的剛性，直接對其加壓會破壞其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，達不到對BMSCs進行應(yīng)力刺激的目的。本研究采用CACS 對密閉倉內(nèi)液體加壓的形式，在不影響骨支架材料結(jié)構(gòu)的前提下，可將應(yīng)力通過液體傳遞到骨支架材料上的BMSCs。10 kPa是人體在無負荷情況下肌肉收縮引起的骨髓腔內(nèi)最大的生理壓力，已被證實可促進BMSCs 成骨分化[14]；而1 Hz 是正常人體生理活動所生產(chǎn)的頻率[15]，有利于細胞保持正常的增殖活性。故本文最終選擇10 kPa 幅度、1 Hz 頻率的CACS 作為M-TEB構(gòu)建過程中的應(yīng)力刺激條件。

現(xiàn)有的研究表明，適當?shù)臋C械負荷刺激對骨組織工程功能化的實現(xiàn)是有益的。Luo 等[16]將人骨髓間充質(zhì)干細胞接種到脫鈣骨支架材料上進行流體動力學(xué)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)相比于傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)，前者的細胞密度、ALP活性更高且生成更多的細胞外基質(zhì)，植入裸鼠皮下后，有更多的新骨生成和更高的骨密度。Duty等[17]則是對植入大鼠體內(nèi)的骨移植物加載間歇性壓縮應(yīng)力（每周3 次，每次30 min，幅度為13.3 N，頻率為1 Hz），6周后發(fā)現(xiàn)，相比未進行力學(xué)干預(yù)的組，力學(xué)干預(yù)組的骨礦化量明顯更高。本文在CACS條件下構(gòu)建得到動態(tài)M-TEB，相比靜態(tài)M-TEB，前者在材料表面包裹有更為豐富的膜片狀細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，且在大鼠股骨缺損模型中表現(xiàn)出更強的骨再生能力，說明在M-TEB構(gòu)建過程中CACS刺激的加入增強了M-TEB骨再生能力。

MAPK 通路在細胞感受外界機械刺激中發(fā)揮著重要作用，靜水壓力、流體剪切力等通過激活MAPK 通路觸發(fā)MSCs成骨分化相關(guān)基因表達[18-19]。同時，生理水平的層流剪切應(yīng)力刺激會抑制MSCs 的凋亡[20]，而周期性機械拉伸則通過增加抗凋亡相關(guān)基因的表達顯著阻止細胞數(shù)量的減少[21]。本文GO 富集結(jié)果顯示，BMSCS 受到CACS 刺激后，在MAPK 通路、細胞凋亡方面發(fā)生顯著改變，提示CACS在調(diào)控BMSCs成骨分化、抗凋亡等方面與其他形式機械負荷具有同等的作用。

BMSCs 在成骨分化過程中可以通過旁分泌VEGFA 的形式促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、存活和遷移，從而促進血管生成[22-23]。本文GO 富集分析結(jié)果顯示，BMSCs 受到CACS 刺激后在血管生成等方面發(fā)生改變，與上述報道相符合。進一步分析發(fā)現(xiàn)，VEGFA是前30個差異GO術(shù)語中出現(xiàn)頻次最高的上調(diào)差異基因，且動態(tài)M-TEB 中VEGFA的蛋白濃度顯著高于靜態(tài)M-TEB，證實CACS 通過促進BMSCs 中VEGFA 基因和蛋白的表達，進而提高動態(tài)MTEB 中VEGFA 蛋白濃度。VEGFA 作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，具有促進血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用[24-25]。本實驗中，動態(tài)M-TEB 中VEGFA 的濃度更高，預(yù)示其具有更強的促血管生成能力，條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)實驗證明了這一猜想。血管生成和骨生成這兩個過程的耦合在骨再生中發(fā)揮了重要的作用[26-27]。在實驗中還發(fā)現(xiàn)動態(tài)M-TEB來源的條件培養(yǎng)基具備更強的促進BMSCs 成骨分化的能力，阻斷實驗證明VEGFA 在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。綜上可以推斷，動態(tài)M-TEB中具有更高濃度的VEGFA，因而在植入大鼠股骨缺損處后，其釋放的VEGFA以促進血管生成和骨生成過程的耦合，最終促進了骨缺損處的骨重建。

綜上所述，CACS 刺激促進BMSCs 中VEGFA 的表達和分泌，提高了M-TEB 材料中VEGFA 濃度，最終使動態(tài)M-TEB在大鼠股骨缺損模型中表現(xiàn)出更強的骨再生力。本文提出的基于CACS的M-TEB構(gòu)建方法既是增強組織工程骨的骨再生能力的一種可行方式，也為解決組織工程骨血管化難題提供了一種新的思路。